Name: structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect
Uploaded: 2019-03-19T13:00:00
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हम अपने घर में अनुसंधान कार्यक्रम के माध्यम से बीम समय प्रदान करने के लिए ESRF धंयवाद ।

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	<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeshAndCollect:+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines.">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Protection+of+Protein+Crystals+against+Radiation+Damage+in+Electron+and+X-Ray+Diffraction.">Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).</li><li>Chapman, H. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).</li><li>Rhodes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. , (2006).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Gabadinho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MxCuBE+a+synchrotron+beamline+control+environment+customized+for+macromolecular+crystallography+experiments.">MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).</li><li>De Santis, D., Leonard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notiziario+Neutroni+e+Luce+di+Sincrotrone.">Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone.</a> Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).</li><li>Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+mini-&#954;+goniometer+head+in+macromolecular+crystallography+diffraction+experiments.">The use of a mini-&#954; goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).</li><li>Evans, P. R., Murshudov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+are+my+data+and+what+is+the+resolution?.">How good are my data and what is the resolution?.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).</li><li>Taylor, G. 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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

एक MX प्रयोग की सफलता आमतौर पर अपेक्षाकृत बड़े, अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल के अस्तित्व पर निर्भर करता है । परियोजनाओं के लिए जहां छोटे क्रिस्टल बौछार से बड़े क्रिस्टल के लिए अनुकूलन विफल रहता है, MeshAndCollect एक संभावना प्रदान करता है एक पूर्ण विवर्तन डेटासेट प्राप्त करने के लिए संरचना समाधान के संयोजन के माध्यम से समरूपी आंशिक डाटा सेट एकत्र छोटे क्रिस्टल की एक श्रृंखला से । विधि एक उच्च फोटॉन प्रवाह और एक छोटे बीम व्यास, कला विवर्तनमापी डिवाइस और एक तेजी से readout डिटेक्टर के एक राज्य के साथ सुसज्जित के साथ, आदर्श MX के लिए सिंक्रोट्रॉन बीएमलाइंस के साथ संगत है । इस तरह के एक अंत स्टेशन पर, इस तरह के एक प्रयोग के डेटा संग्रह भाग के बारे में 20 मिनट लगेंगे, एकत्र किए जाने वाले आंशिक डेटा सेट की संख्या और विश्लेषण किए जाने वाले क्रिस्टल-युक्त नमूना धारकों की संख्या के आधार पर होगा ।
एक MeshAndCollect प्रयोग की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण पूर्वावश्यकता एक पर्याप्त संख्या का अस्तित्व है (कम से ५०, १०० आदर्श रूप में) नमूना धारक पर स्थिति का डिफफ्रैक्टिंग । अनुभव से, क्रिस्टल के ंयूनतम आकार का विश्लेषण किया जा करने के लिए सबसे छोटी आयाम में के बारे में 5 μm होना चाहिए । विधि मानक cryo के किसी भी प्रकार के साथ संगत है-सबसे अच्छा परिणाम मेष mounts कि कठोर और सीधे कर रहे है का उपयोग कर प्राप्त किया जा रहा है के साथ संगत नमूना धारकों ठंडा ।
esrf में, meshandcollect एक passerelle में उपयोगकर्ता के अनुकूल तरीके से लागू किया जाता है (http://isencia.be/passerelle-edm-en) कार्यप्रवाह30 MXCuBE2 बीमलाइन नियंत्रण सॉफ्टवेयर से उपलब्ध है । अंय एसएक्स विधियों की तुलना में MeshAndCollect का एक प्रमुख लाभ यह है कि एकत्र डेटा मानक कार्यक्रमों और स्वचालित एकल क्रिस्टल एमएक्स के लिए इस्तेमाल पाइपलाइनों द्वारा संसाधित किया जा सकता है ।
जैसा कि हमारे उदाहरण से पता चलता है, MeshAndCollect बहुत लागू करने के लिए आसान है और आंशिक विवर्तन डेटा सेट की एक श्रृंखला की ओर जाता है, आमतौर पर छोटे क्रिस्टल से एकत्र, जो संरचना समाधान में उपयोग के लिए एक पूर्ण डेटा सेट का उत्पादन करने के लिए विलय किया जा सकता है । इसके अलावा, MeshAndCollect को प्रोटीन क्रिस्टलग्राफी के नमूने अंतरिक्ष खोलने की क्षमता है के रूप में यह एक तरह से क्रिस्टलीकरण परीक्षण जहां पिछले अनुकूलन कदम, बड़े क्रिस्टल का उत्पादन, असफल से प्रयोग करने योग्य डेटा एकत्र प्रदान करता है ।
उज्ज्वल एक्स-रे स्रोतों की दिशा में वर्तमान घटनाक्रम के प्रकाश में (जैसे, अत्यंत शानदार स्रोत (ईबीएस) परियोजना/यह निकट हैकि विकिरण क्षति की वृद्धि के कारण, मल्टी-क्रिस्टल डेटा संग्रह की सुविधा के प्रकार द्वारा MeshAndCollect डेटा संग्रह के मानक विधि बन जाएगा, बजाय एक अपवाद-के रूप में वर्तमान में मामला है-synchrotron पर आधारित एमएक्स beamlines ।

Macromolecular एक्स-रे क्रिस्टललेखी (MX), दूर से, जैविक macromolecular के तीन आयामी संरचनाओं में परमाणु संकल्प अंतर्दृष्टि पाने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है । हालांकि, एक प्रमुख बोतल गर्दनें अपेक्षाकृत बड़े, अच्छी तरह से डिफफ्रैक्टिंग क्रिस्टल के लिए आवश्यकता है ।
अक्सर, और विशेष रूप से जब झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टलीकरण, सबसे बड़ा आयाम में कुछ माइक्रोन के केवल बहुत छोटे क्रिस्टल प्राप्त किया जा सकता है । विकिरण क्षति प्रभाव एक पूर्ण विवर्तन डेटा सेट है कि एक एकल माइक्रो क्रिस्टल2से एकत्र किया जा सकता है के संकल्प की सीमा, और बहुत बार, यह शोर अनुपात करने के लिए संकेत में सुधार करने के लिए आवश्यक है और इसलिए डेटा सेट संकल्प, कई विलय द्वारा आंशिक अलग से डेटा सेट, लेकिन समरूपी क्रिस्टल । सिंक्रोट्रॉन स्रोतों और कहीं पर एक्स-रे बीम के फ्लक्स घनत्व में वृद्धि ( एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर्स (एक्स-fels)), मतलब है कि उपयोगी आंशिक विवर्तन डेटा सेट जैविक के भी बहुत छोटे क्रिस्टल से एकत्र किया जा सकता है अणुओं. यह, बारी में, संग्रह और आंशिक विवर्तन डेटा के विलय के लिए नई तकनीकों के विकास के लिए नेतृत्व किया गया है कई अलग क्रिस्टल से एकत्र की संरचना समाधान के लिए एक पूरा डेटा सेट का उत्पादन करने के क्रम में । ऐसी तकनीकों को सामान्यतः धारावाहिक क्रिस्टललेखी (SX)3,4,5,6,7,8के रूप में संदर्भित किया जाता है । एसएक्स का एक प्रोटोटाइप उदाहरण एक्स-रे बीम3,4,5में एक क्रिस्टल घोल की एक संकीर्ण धारा शुरू करने के लिए सुई लगानेवाला उपकरणों का उपयोग है । एक विवर्तन पैटर्न हर बार रिकॉर्ड किया जाता है एक क्रिस्टल एक्स-किरणों को उजागर करने के लिए अग्रणी है संग्रह करने के लिए, व्यक्तिगत क्रिस्टल के कई हजारों से, ' अभी भी ' विवर्तन छवियों, जानकारी है जो फिर एक पूरा डेटा सेट का उत्पादन करने के लिए विलय कर दिया है । हालांकि, धारावाहिक डेटा संग्रह के इस प्रकार का एक काफी नुकसान है कि अभी भी छवियों के प्रसंस्करण समस्याग्रस्त किया जा सकता है । आंकड़ों की गुणवत्ता में काफी सुधार हुआ है यदि क्रिस्टल घुमाया जा सकता है और/सीरियल क्रिस्टलीय प्रयोगों6के दौरान एक ही क्रिस्टल से कई डिफक्शन छवियों एकत्र कर रहे हैं ।
MeshAndCollect1 ' मानक ' एमएक्स रोटेशन डेटा संग्रह के साथ एसएक्स के संयोजन के उद्देश्य के साथ विकसित किया गया था और अनुमति देता है, एक स्वचालित फैशन में, एक ही macromolecular लक्ष्य के कई क्रिस्टल से आंशिक डिफक्शन डेटा सेट इकट्ठा करने के लिए experimenters एक ही या अलग नमूना धारकों पर घुड़सवार । एक पूर्ण विवर्तन डेटा समुच्चय तब एकत्र किए गए आंशिक डेटा समुच्चयों के अधिकांश समरूपी विलयन द्वारा प्राप्त किया जाता है । meshandcollect एमएक्स के लिए किसी भी राज्य के-the-कला सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे बीमलाइन के साथ संगत है (आदर्श रूप में नमूना स्थिति पर एक अपेक्षाकृत छोटे (20 μm या कम) बीम आकार के साथ एक प्रविष्टि डिवाइस सुविधा). लघु के एक श्रृंखला से पूरा डेटा सेट के संकलन के अलावा, अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल, विधि भी बहुत सूक्ष्म क्रिस्टल के difअपवर्तन गुणवत्ता के प्रारंभिक प्रयोगात्मक मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है और अपारदर्शी नमूनों के प्रसंस्करण के लिए, उदाहरण के लिए, मेसो में झिल्ली प्रोटीन के microक्रिस्टलों9।
एक MeshAndCollect प्रयोग के शुरू में, पदों, दो आयामों में, एक ही नमूना धारक में निहित कई क्रिस्टल में से प्रत्येक के एक कम खुराक एक्स-रे स्कैन का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं । इस स्कैन के दौरान एकत्र द्विवर्तन छवियों को स्वचालित रूप से प्रोग्राम DOZOR1, जो नमूना धारक पर क्रिस्टल की स्थिति उनके संबंधित अलग अलग शक्ति के अनुसार प्रकार द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । आंशिक डेटा सेट के संग्रह के लिए स्थितियां स्वचालित रूप से एक विवर्तन शक्ति कट-ऑफ़ के आधार पर असाइन की जाती हैं और अंतिम चरण में, विवर्तन डेटा के छोटे wedges, सामान्यतया ± 5 का ° रोटेशन, प्रत्येक चुनी गई स्थिति से एकत्रित किए जाते हैं. अनुभव से पता चला है कि इस रोटेशन रेंज आंशिक डेटा के लिए क्रिस्टल प्रति प्रतिबिंब की एक पर्याप्त राशि प्रदान करता है स्केलिंग प्रयोजनों के सेट, जबकि एक ही समय में, संभव को कम करने के क्रिस्टल केंद्रित मुद्दों और एक में कई क्रिस्टल को उजागर करने का मौका विशेष रूप से भीड़ समर्थन1। इसके बाद व्यक्तिगत रूप से या तो मैन्युअल रूप से या स्वचालित डेटा प्रोसेसिंग पाइपलाइन10,11,12,13का उपयोग कर संसाधित कर रहे हैं । डाउनस्ट्रीम संरचना निर्धारण के लिए यह तो14,15,16 विलय किया जा करने के लिए आंशिक डेटा सेट का सबसे अच्छा संयोजन खोजने के लिए आवश्यक है जिसके बाद परिणामस्वरूप पूरा डेटा सेट उसी तरह से इलाज किया जा सकता है एक एकल क्रिस्टल प्रयोग से उद्भव के रूप में ।
व्यवहार में meshandcollect का एक उदाहरण के रूप में, हम यहां cyan फ्लोरोसेंट प्रोटीन (cfp) cerulean के क्रिस्टल संरचना का समाधान वर्तमान, एक की श्रृंखला से एकत्र आंशिक डेटा सेट के संयोजन से निर्मित एक विवर्तन डेटा सेट का उपयोग एक ही नमूना समर्थन पर घुड़सवार माइक्रोक्रिस्टल । सेरुलियन जेलिफ़िश aequorea विक्टोरिया17से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) से इंजीनियर किया गया है, जिसका फ्लोरोसेंट वर्णमूलक autoउत्प्रेरक तीन लगातार अमीनो एसिड अवशेषों के चक्रीकरण से बना है । सेरुलियन, क्रोमोफोर, सेरीन और टाइरोसीन के पहले और दूसरे अवशेषों को क्रमशः थ्रिटोनिन (S65T) और ट्रिप्टोफेन (Y66W) के रूप में रूपांतरित करके जीएफपी से प्राप्त किया जाता है और इसके आगे के उत्परिवर्तनों के साथ क्रोमोफोर वातावरण को अनुकूल (Y145A, N146I, H148D, M153T और V163A) का उत्पादन करने के लिए एक महत्वपूर्ण, अभी तक सबऑप्टिमल प्रतिदीप्ति स्तर qy = ०.४९18,19,20। सेरुलियन के सबऑप्टिमल फ्लोरोसेंट गुणों को जटिल प्रोटीन गतिशीलता से जोड़ने का प्रस्ताव किया गया है, जिसमें प्रोटीन की ग्यारह β-किस्में में से एक के अपूर्ण स्थिरीकरण और दो भिन्न क्रोमोफोर के आवास को शामिल किया गया है । आइसोमर पीएच और विकिरण की स्थिति22पर निर्भर करता है । हम एक मॉडल प्रोटीन के रूप में Cerulean के साथ काम करने के लिए चुना क्रिस्टल आकार ट्यूनिंग क्रिस्टलीकरण के आधार पर अपेक्षाकृत आसानी के कारण MeshAndCollect प्रोटोकॉल का उपयोग illustrating । सेरुलियन की संरचना बहुत ही अपने मूल प्रोटीन जीएफपी के समान है, क्योंकि यह एक β-बैरल का गठन एक α-हेलिक्स, जो क्रोमोफोर भालू के आसपास ग्यारह β-किस्में का गठन किया है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline</td>
			<td>ESRF ID 23-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization plates XDXm with sealant</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Life Technologies Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>10-110-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroMeshes 700/25</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU:&#160;M3-L18SP-25L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 10/300 -GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5174-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9201-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186&#8211;3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aimless</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204&#8211;1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ccCluster</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844&#8211;1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeshAndCollect workflow</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328&#8211;2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCuBE2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700&#8211;707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24&#8211;226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>Max-Planck-Institut f&#252;r Medizinische Forschung</td>
			<td>Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125&#8211;132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect

एक्स-रे क्रिस्टलीय प्रमुख तकनीक जैविक macromolecules के 3 आयामी संरचनाओं के विषय में उच्च संकल्प जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हाल ही में जब तक, एक प्रमुख आवश्यकता अपेक्षाकृत बड़े, अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल, जो अक्सर प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण है की उपलब्धता रहा है । हालांकि, धारावाहिक क्रिस्टलीय के आगमन और बहु में एक पुनर्जागरण-क्रिस्टल डेटा संग्रह विधियों का मतलब है कि बड़े क्रिस्टल की उपलब्धता अब एक सीमित कारक होना चाहिए । यहां, हम स्वचालित MeshAndCollect प्रोटोकॉल है, जो पहले कई छोटे क्रिस्टल की स्थिति की पहचान एक ही नमूना धारक पर घुड़सवार के उपयोग को समझाने और फिर के लिए आंशिक भिंन डेटा सेट की एक श्रृंखला के क्रिस्टल से संग्रह निर्देश अनुवर्ती विलय और संरचना निर्धारण में उपयोग करें । MeshAndCollect माइक्रो क्रिस्टल के किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है, भले ही कमजोर डिफफ्रैक्टिंग । एक उदाहरण के रूप में, हम यहां पेश करने के लिए तकनीक का उपयोग करने के लिए Cyan फ्लोरोसेंट प्रोटीन की क्रिस्टल संरचना (CFP) सेरुलियन हल ।

MeshAndCollect, के रूप में MXCuBE2 में कार्यांवित ( चित्रा 1aदेखें), एक ही नमूना धारक जिसमें क्रिस्टल के दृश्य पहचान मुश्किल था पर स्थित सेरुलियन के छोटे क्रिस्टल से आंशिक विवर्तन डेटा सेट के संग्रह के लिए प्रयोग किया जाता था । नमूना धारक को स्क्रीन करने के लिए, हम मेशलूप के केंद्र पर एक ग्रिड आकर्षित किया ( चित्र 1bदेखें) और dozor स्कोर हीट मानचित्र के आधार पर (देखें आंकड़े 1C, 1c) ८५ आंशिक डिफ़म डेटा सेट स्वचालित रूप से एकत्रित किए गए थे । ये व्यक्तिगत रूप से तो विलय (ऊपर देखें) के लिए ९९.८% पूर्णता के साथ एक डेटा सेट का उत्पादन किया गया dmin = 1.7 å ( तालिका 1देखें) । उच्चतम रिज़ॉल्यूशन शेल में आधा-सेट सहसंबंध (CC1/2)३४ ६०% (= ४.७) था । के रूप में की उंमीद है, Cerulean के क्रिस्टल संरचना सीधे आणविक प्रतिस्थापन३३ द्वारा उत्पंन डेटा सेट का उपयोग करके हल किया जा सकता है । शोधन के बाद, हम २२.८% की एक आरकाम और २५.४% की एकनि: शुल्क प्राप्त की । पहले से निर्धारित संरचना (PDB प्रविष्टि 2WSO21) के साथ superposition ०.१ Å के सीα पदों पर एक वैश्विक rmsd से पता चलता है ।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>मर्ज किए गए डेटा सेट के आंकड़े</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>क्लस्टरिंग थ्रेशोल्ड</td>
			<td>०.३५</td>
		</tr>
<tr>
<td>आंशिक डेटासेट की संख्या</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>अंतरिक्ष समूह</td>
			<td>P212121</td>
		</tr>
<tr>
<td>यूनिट सेल (ए, बी, सी)</td>
			<td>५०.९८, ६२.७६, ६९.५०</td>
		</tr>
<tr>
<td>रिज़ॉल्यूशन श्रेणी</td>
			<td>46.58-1.70 (1.73-1.70)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmerge (सभी मैं + और मैं-)</td>
			<td>०.१३३ (०.७४३)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (सभी मैं + & मैं-)</td>
			<td>०.१४२ (०.८१३)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim (सभी मैं + & मैं-)</td>
			<td>०.०४७ (०.३१८)</td>
		</tr>
<tr>
<td>प्रेक्षण कुल/</td>
			<td>220693/25129</td>
		</tr>
<tr>
<td>माध्य ((i)/sd (i))</td>
			<td>१३.८ (४.७)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mn (I) अर्ध-समुच्चय सहसंबंध CC (1/</td>
			<td>०.९९४ (०.६०२)</td>
		</tr>
<tr>
<td>पूर्णता</td>
			<td>९९.८ (९९.५)</td>
		</tr>
<tr>
<td>बहुलता</td>
			<td>८.८ (६.५)</td>
		</tr>
<tr>
<td>अंतिम आरcryst
</td>
			<td>२२.८</td>
		</tr>
<tr>
<td>अंतिमनि: शुल्क
</td>
			<td>२५.४</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: मर्ज किए गए डेटा सेट के आंकड़े संग्रहीत डेटा की उच्च गुणवत्ता को दर्शाते हैं ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58594/58594fig1.jpg"> चित्रा 1: एक ही नमूना धारक में निहित छोटे क्रिस्टल की एक श्रृंखला से आंशिक डेटा सेट की एक श्रृंखला इकट्ठा करने के लिए MeshAndCollect का उपयोग करना. A) उपयोगकर्ता-इंटरफ़ेस MXCuBE2 । ऑन-अक्ष व्यूअर फ़ील्ड पर हरा अंडाकार ग्रिड उपकरण को इंगित करता है । ख) इसके साथ एक ग्रिड जीवन छवि क्षेत्र में नमूना धारक की छवि पर तैयार की है । ग) डोजोर स्कोर का हीट मैप । D) एक द्विवर्तन छवि का उदाहरण । E) श्रेणीबद्ध क्लस्टर विश्लेषण के बाद डेन्ट्रोग्राम । लाल रंग में डेटा सेट मर्ज करने के लिए उपयोग किए गए थे । च) सेरुलियन की समग्र संरचना । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58594/58594fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

हम एक पूरा विवर्तन डेटा सेट प्राप्त करने के लिए, अनुवर्ती संरचना निर्धारण में उपयोग के लिए, आंशिक द्विवर्तन डेटा फ्लोरोसेंट प्रोटीन सेरुलियन के कई छोटे क्रिस्टल से एकत्र सेट से बना meshandcollect प्रोटोकॉल का उपयोग वर्तमान ।

MeshAndCollect का उपयोग कर फ्लोरोसेंट प्रोटीन सेरुलियन की संरचना समाधान

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

पक नमूनों से छोटे क्रिस्टल को मापने के लिए मानक रोटेशन डेटा संग्रह के साथ धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी को संयोजित करने के लिए स्वचालित मेशएंडकॉलेक्ट प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। विधि पहले एक ही नमूना धारक पर चढ़कर क्रिस्टल की स्थिति की पहचान करती है ताकि आंशिक डेटा सेट के संग्रह को निर्देशित किया जा सके जिसे बाद में विलय कर दिया जाएगा और संरचना के समाधान के लिए उपयोग किया जाएगा। मेशएंडकॉलेक्ट सम्मोहक है क्योंकि यह आपको तेजी से और एक ही सेटअप, संरचना समाधान, लिगांड स्क्रीनिंग और छोटे क्रिस्टल के साथ सभी के साथ प्रयोग करने की अनुमति देता है।विधि सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन के वीएमएक्स के साथ संगत है जो आदर्श रूप से उच्च फोटॉन फ्लेक्स, एक छोटे बीम व्यास और एक तेज रीलोड डिटेक्टर से लैस है। सबसे पहले, प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइन के डेटाबेस के लिए विस्तारित सूचना प्रणाली से कनेक्ट करें और प्रयोग संख्या और एक फार्म से पासवर्ड के साथ MX.Log में चुनें। इसके बाद, शिपमेंट का चयन करें नया जोड़ें और मांगी गई जानकारी भरें।आंशिक जोड़ें और संबंधित डेटा भरें चुनें। जोड़ें कंटेनर का चयन करें, एक SC3 पक चुनें, और पक में नमूना धारकों की स्थिति सहित आवश्यक जानकारी भरें । प्रायोगिक हच में, पक को नमूना परिवर्तक कर्ता में लोड करें और इसकी स्थिति पर ध्यान दें।इसके बाद, प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइन के डेटाबेस के लिए सूचना प्रणाली में लॉग इन करें। तैयार प्रयोग का चयन करें, शिपमेंट ढूंढें, नेक्स्ट चुनें, और नमूना परिवर्तक में बीमलाइन और पक स्थिति को इंगित करें। ए फॉर्म पर दिए गए एक्सपेरिमेंटल नंबर और पासवर्ड के साथ बीमलाइन कंट्रोल सॉफ्टवेयर में लॉग इन करें।प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइन के डेटाबेस के लिए सूचना प्रणाली के साथ बीमलाइन नियंत्रण सॉफ्टवेयर को सिंक करने के लिए प्रेस सिंक करें। सैंपल होल्डर को गोनियोमीटर पर माउंट करने के लिए बीमलाइन कंट्रोल सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करें। फिर सही-नमूना परिवर्तक क्षेत्र में एक स्थिति पर क्लिक करें और माउंट नमूना का चयन करें ।केंद्र बटन का चयन करें और फिर लूप के टिप के किनारे के बीच में तीन क्लिक केंद्र। सेव का चयन करके केंद्रित स्थिति को बचाएं। उन्नत के तहत, डेटा संग्रह कतार में वर्कफ़्लो विजुअल रिओरिएंटेशन जोड़ें।फिर कलेक्ट क्यू पर क्लिक करके वर्कफ्लो लॉन्च करें। इसके बाद, उस पर क्लिक करके सहेजे गए केंद्र पदों में से एक का चयन करें। केंद्र बटन पर फिर से क्लिक करें, तो पाश के तने की शुरुआत के बीच पर एक तीन क्लिक केंद्र ।सेव पर क्लिक करके दूसरी पोजीशन बचाएं। और फिर जारी रखें पर क्लिक करें। वर्कफ़्लो के बाद नमूना धारक के विमान को गोनियोमीटर के रोटेशन धुरी के साथ संरेखित करता है, नमूना धारक को जाल के बीच में कहीं फिर से केंद्र में रखें।नमूना धारक को उन्मुख करें ताकि मेश का चेहरा बीमलाइन नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ओमेगा धुरी को घुमाकर एक्स-रे बीम दिशा के लंबवत हो। बीमलाइन कंट्रोल सॉफ्टवेयर में अपर्चर ड्रॉपडाउन मेन्यू पर क्लिक करें और वैल्यू चुनें। फिर जाल उपकरण खिड़की लाने के लिए जाल उपकरण आइकन पर क्लिक करें।बीमलाइन नियंत्रण सॉफ्टवेयर के नमूने को देखने में, बाएं क्लिक करके और नमूना धारक पर क्रिस्टल वाले क्षेत्र पर माउस को खींचकर जाल खींचें। जाल को बचाने के लिए, जाल टूल विंडो में प्लस बटन पर क्लिक करें। बीमलाइन नियंत्रण सॉफ्टवेयर के संकल्प क्षेत्र में, उस संकल्प को दर्ज करें जिस पर विवर्तन छवियों को एकत्र किया जाना चाहिए।यदि क्रिस्टल की विवर्तन गुणवत्ता के बारे में कोई पूर्व जानकारी ज्ञात नहीं है, तो दो और 2.5 के बीच एक मूल्य की सिफारिश की जाती है। उन्नत डेटा संग्रह टैब में MeshAndCollect चुनें। इसे कतार में जोड़ें और कतार में क्लिक करें।पैरामीटर विंडो में, बीमलाइन निर्भर डिफ़ॉल्ट पैरामीटर का उपयोग करें। यहां वर्णित प्रयोग में, डिफ़ॉल्ट पैरामीटर 0.037 सेकंड एक्सपोजर टाइम प्रति मेश स्कैन पॉइंट, 100% ट्रांसमिशन और प्रति मेश स्कैन लाइन एक डिग्री दोलन हैं। क्लिक करें जारी रखें।जाल स्कैन चलाता है और प्रत्येक ग्रिड बिंदु पर एकत्र विवर्तन छवियों का विश्लेषण किया जाता है और सॉफ्टवेयर डोजर के साथ विवर्तन शक्ति के अनुसार स्थान दिया जाता है। डोजर विश्लेषण के बाद, एक गर्मी नक्शा उत्पन्न होता है और बाद में आंशिक डेटा संग्रह के लिए आदेश स्वचालित रूप से विवर्तन शक्ति के आधार पर सौंपा जाता है। अंत में, आंशिक डेटा संग्रह लॉन्च करने के लिए जारी रखें क्लिक करें।एमएक्सक्यूबी में लागू किए गए मेशएंडकॉलेक्ट का उपयोग उसी नमूना धारक पर स्थित सेरूलन के छोटे क्रिस्टल से आंशिक विवर्तन डेटा सेट के संग्रह के लिए किया गया था जिसमें क्रिस्टल की दृश्य पहचान मुश्किल थी। नमूना धारक को स्क्रीन करने के लिए, जाल लूप के केंद्र पर एक ग्रिड तैयार किया गया था और डोजर स्कोर हीट मैप के आधार पर, 85 आंशिक विवर्तन डेटा सेट स्वचालित रूप से एकत्र किए गए थे। इन्हें व्यक्तिगत रूप से एकीकृत किया गया था, फिर 1.7 एंगस्ट्रॉम के संकल्प पर 99.8% पूर्णता के साथ डेटा सेट का उत्पादन करने के लिए विलय कर दिया गया था।जैसा कि अपेक्षित था, उत्पन्न डेटा सेट का उपयोग करके आणविक प्रतिस्थापन द्वारा सेरूलन की क्रिस्टल संरचना को हल किया जा सकता है। शोधन के बाद, 22.8% का आर कार्य और 25.4% से मुक्त आर प्राप्त किया गया। पहले निर्धारित संरचना की सुपर स्थिति 0.1 एंग्स्ट्रॉम के सी-अल्फा पदों पर एक वैश्विक आरएमएसडी दिखाती है।उन परियोजनाओं के लिए जहां क्रिस्टल विकास चरण का अनुकूलन, मेशंडकोलेक्ट छोटे क्रिस्टल से प्राप्त इन असंगत आंशिक डेटा सेटों के संयोजन के आधार पर एक पूर्ण डेटा सेट प्राप्त करने की संभावना प्रदान करता है। इस तकनीक ने संरचनात्मक जीवविज्ञानियों के लिए भागों के नमूने से एक संरचना को हल करने का मार्ग प्रशस्त किया जहां केवल कुछ दसवां सूक्ष्म क्रिस्टल का उत्पादन नहीं किया जा सका।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

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Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

सुमो का स्थानीयकरण-संशोधित फ्लोरोसेंट सूमो-फँसाने प्रोटीन का उपयोग कर प्रोटीन

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

एक सबसेलुलर कंपार्टमेंट-विशिष्ट रेडॉक्स-संवेदनशील ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके सेलुलर ऑक्सीकरण का आकलन

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...