Name: structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect
Uploaded: 2019-03-19T13:00:00
Duration: 6 min 42 s
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Ringraziamo l'ESRF per fornire tempi di fascio attraverso il suo programma di ricerca interna.

1. espressione e purificazione di Cerulean
Nota: Questo è basato sul protocollo pubblicato da Lelimousin et al. 21
<ol><li>Esprimere la sua etichetta Cerulean in Escherichia coli BL21 cellule coltivate a 37 ° C in 4 L di auto viscoelastico medio23 fino OD600= 1 e quindi incubare per una notte a 27 ° C.</li>
	<li>Raccogliere le cellule batteriche a 5.000 x g e lisare le cellule tramite sonicazione (40%, 5 min, 10 impulsi s, 10 s pausa) in 200 mL di tampone costituito da 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl e 1 x privo di EDTA inibitori della proteasi.</li>
	<li>Caricare il surnatante in una colonna di sua trappola Ni-NTA ed eluire Cerulean con imidazolo 100 mM nelle stesse condizioni di buffer.</li>
	<li>Piscina le frazioni di colore gialle brillante. La proteina è intrinsecamente colorata, quindi le frazioni contenenti Cerulean sono facilmente distinguibili.</li>
	<li>Purificare la proteina (4 mL) in una colonna di S75 in 20 millimetri Tris pH 8.0.</li>
	<li>Piscina le frazioni di gialle brillante e concentrare la soluzione della proteina a 15 mg/mL.</li>
</ol>2. cristallizzazione
<ol><li>Utilizzare goccia d'attaccatura del vapore diffusione tecnica24 a 20 ° C nelle piastre di Linbro. Riempire i pozzetti con 1 mL di una soluzione precipitante composta da 100 mM HEPES pH 6,75, 12% PEG8000 e 100 mM MgCl2. Per le gocce d'attaccatura, mescolare 1 µ l di proteina concentrata a 15 mg/mL con 1 µ l di soluzione precipitante. Cristalli dovrebbero apparire in 24h.</li>
	<li>Raccolto i cristalli ottenuti e trasferimento a 100 µ l di un buffer di semina composto da 0,1 M a pH HEPES 6.75, 22% PEG 8000.</li>
	<li>Macinare i cristalli con una smerigliatrice di tessuto di 0,1 mL e diluire in semina buffer (rapporto 1: 100).</li>
	<li>Digerire un'aliquota della soluzione stock (15 mg/mL) della proteina con tripsina (0,5 mg/mL nello stesso buffer) per 1 h (01:10 (v/v)).</li>
	<li>Miscelare la soluzione di proteine digerite con 10% di semi-contenente tampone (v/v).</li>
	<li>Crescere cristalli (10 * 10 * 20 µm3) a 0,1 M a pH HEPES 7, 14% PEG 8000, 0,1 MgCl2 in sospensione di 1-1.5 μL gocce utilizzando il metodo di diffusione del vapore.</li>
</ol>3. Crystal montaggio
<ol><li>Utilizzare un ciclo adatto, ad esempio, un fori quadrati di maglia ciclo 700 di 25 µm ogni montato su una colonna vertebrale campione standard porta25. Trasferire cristalli dalla goccia di cristallizzazione (passo 2,6) in 1 µ l di soluzione di crioprotettore (la soluzione precipitante ben mescolata con glicerolo (finale 20% v/v)).</li>
	<li>Montare il liquame di cristallo della proteina su un loop di maglia spostando il ciclo sotto i cristalli e sollevandoli dalla goccia. Idealmente i cristalli dovrebbero essere nell'intervallo di dimensioni di 5 µm – 30 µm nella dimensione massima senza sovrapposizioni tra cristalli montati nel ciclo.</li>
	<li>Stoppino fuori il liquido in eccesso, toccando il Monte rapidamente con la carta da filtro. Sedimenti i cristalli che si siedono sul piano del ciclo circondato da poco liquido massa possibile.</li>
	<li>Tuffatevi sul Monte un unipuck pieno di azoto liquido. Memorizzare il puck a 100 K in un contenitore adatto fino a tempo del fascio è disponibile.</li>
</ol>4. offline preparazione dell'esperimento sincrotrone
Nota: Richiedere tempo fascio sincrotrone il più presto possibile e seguire le istruzioni online per i tipi di accesso disponibili e su come presentare una domanda per un determinato sincrotrone. Le linee guida ESRF possono essere trovate alla http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. Se un membro di un gruppo di allocazione blocco ESRF (borsa), un'applicazione per ogni progetto specifico non è necessaria. In questo caso gli sperimentatori dovrebbero avvicinarsi loro responsabile borsa riguardanti la programmazione del tempo di larghezza.
<ol><li>Dopo la proposta è accettata e viene ricevuto un invito per l'esperimento, hanno tutti i partecipanti di completare la formazione sulla sicurezza. Compilare il "A-form" (tramite il portale utente ESRF, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) con le informazioni di sicurezza richiesti sui campioni. Contattare il referente locale per discutere l'esperimento. Una volta che il vostro un-forma è presentata e convalidato vi darà il numero di esperimento e la password.</li>
	<li>Connettersi a estesa ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) e scegliere MX.</li>
	<li>Effettuare il login con il numero di esperimento e la password da un-forma.</li>
	<li>Selezionare spedizione | Aggiungi nuovo e compilare le informazioni richieste.</li>
	<li>Selezionare Aggiungi pacco e compilare i dati pertinenti. Selezionare Aggiungi Container, scegliere un unipuck e compilare le informazioni richieste, incluse le posizioni dei titolari del campione nel puck.</li>
</ol>5. caricamento del campione su una Beamline
<ol><li>Nel hutch sperimentale, caricare il puck in autocampionatore (SC) dewar e nota la sua posizione.</li>
	<li>La cabina sperimentale di interblocco e immettere il hutch di controllo.</li>
	<li>Login per il ISPyB (https://esrf.fr/). Selezionare Preparare esperimento, trovare la spedizione, selezionare Avanti e indicare la beamline e la posizione di puck in SC.</li>
	<li>Accedere al software di controllo beamline, qui MXCuBE227,28 con il numero sperimentale e la password forniti su un-forma.<ol>
<li>Premete Sync per sincronizzare il software di controllo beamline con il database di ISPyB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare il software di controllo beamline, per montare il supporto del campione sul goniometro. In MXCuBE2, una posizione nell'area campione changer fare clic destro e selezionare Monte campione.</li>
	<li>Approfittando del MK3 Mini-kappa goniometro29 installato al massimo di beamlines l'ESRF MX, uso "visual riallineamento" flusso di lavoro30 di MXCuBE2 per allineare il piano di supporto del campione con l'asse di rotazione del goniometro.<ol>
<li>Selezionare il pulsante di centro , quindi 3-fare clic su centro al centro del bordo della punta del ciclo. Salvare la posizione concentrata selezionando Salva.</li>
		<li>Fare nuovamente clic sul pulsante centro , quindi 3-fare clic su centro metà dell'inizio del gambo del ciclo. Salvare la seconda posizione anche facendo clic su Salva.</li>
		<li>Selezionare uno dei salvati centrato posizioni facendo clic su di esso.</li>
		<li>In Avanzate, è possibile aggiungere il flusso di lavoro Visual riorientamento per la coda della raccolta dati MxCuBE2.</li>
		<li>Avviare il flusso di lavoro facendo clic su raccogliere coda.</li>
		<li>Dopo il flusso di lavoro consente di allineare il piano di supporto del campione con l'asse di rotazione del goniometro, centro il portacampioni nuovamente, questa volta da qualche parte nel mezzo della mesh.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Orientare il supporto del campione in modo che la faccia della mesh è perpendicolare alla direzione del fascio di raggi x ruotando l'asse di omega utilizzando MXCuBE2.</li>
	<li>In MXCuBE2, selezionare la dimensione di larghezza richiesta per la scansione del supporto del campione (solo per beamlines con dimensioni del fascio variabile).<ol>
<li>Fare clic su apertura a discesa menu nel software di controllo della beamline e selezionare un valore, ad esempio, 10 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definire una mesh per l'analisi di rete.<ol>
<li>Fare clic sull'icona dello strumento mesh in MXCuBE2. Verrà visualizzata la finestra di strumento di maglia.</li>
		<li>Secondo il campione di MXCuBE2, disegnare la maglia da sinistra cliccando e trascinando il mouse sopra l'area contenente cristalli il supporto del campione.</li>
		<li>Per salvare la rete fare clic sul pulsante Plus nella finestra degli strumenti di rete (mesh diventa verde).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. preparare ed eseguire il flusso di lavoro MeshAndCollect
<ol><li>Nel campo risoluzione di MXCuBE2, Inserisci la risoluzione (dmin) alle quali diffrazione immagini devono essere raccolti, ad esempio, qui 1.8 Å.</li>
	<li>Selezionare MeshAndCollect nella scheda di raccolta dati Avanzate , aggiungerlo alla coda e fare clic su raccogliere la coda.</li>
	<li>Nella finestra del parametro che viene visualizzata, utilizzare i parametri di default dipendente beamline. Nell'esperimento descritto qui impostazioni predefinite sono parametri 0.037 s tempo di esposizione al punto di scansione di rete, 100% di trasmissione (che in questo caso 4 x 1011 ph/s), 1 ° oscillazione per linea di scansione di rete.</li>
	<li>Fare clic su Continua. Viene eseguita la scansione di rete e le immagini di diffrazione raccolte in ogni punto della griglia sono analizzate e classificate secondo forza di diffrazione con il software DOZOR1. Questo processo viene eseguito in background.</li>
	<li>Dopo l'analisi DOZOR viene generata una mappa termica e l'ordine per le raccolte di dati parziali successivi viene assegnato automaticamente in base alla forza di diffrazione (Vedi Figura 1). Nota: I risultati di questo passaggio possono essere ispezionati anche in ISPyB. Per la raccolta di set di dati parziali, che una nuova scheda con le impostazioni si apre il software di controllo beamline, selezionare i valori adatti per la gamma di rotazione (cioè 0,1 °), numero di immagini (ad esempio, 100), tempo di esposizione, ad alta risoluzione e trasmissione, inversa fascio ecc idealmente la dose per ogni Cuneo essere raccolti dovrebbe essere inferiore al limite di Garman (30 MGy). Il tempo di esposizione approssimativa per immagine è 0.037 s a 0.1 s in condizioni sperimentali descritte.</li>
	<li>Fare clic su continua per avviare le raccolte di dati parziali.</li>
</ol>7. trattamento dei dati
Nota: I set di dati parziali sono integrati con un programma adeguato (XDS10). Per questo sarà essere usato uno script Python che riconosce ogni set di dati singoli, integra e fa in modo che l'indicizzazione tra i diversi insiemi di dati parziali è coerenza.
<ol><li>Aprire la cartella contenente le immagini: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean.</li>
	<li>Eseguire una copia di sicurezza della sottocartella processo che può essere trovata nella cartella dove sono raccolti i set di dati parziali.<ol>
<li>Sul terminale Linux, utilizzare il comando cp-r process_backup di processo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spostarsi nella cartella processo e lanciare lo script di elaborazione.<ol>
<li>Sul terminale Linux, digitare il comando cd processo e premere INVIO.</li>
		<li>Tipo procMultiCrystalData e premere INVIO. Nota: Lo script chiederà per un gruppo di spazio e i parametri delle cellule (questa informazione è facoltativa), immettere quelli secondo le istruzioni. Dopo un'ultima conferma dell'utente, lo script verrà eseguito automaticamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. l'Unione di insiemi di dati
Nota: Dopo che tutti i set di dati parziali sono integrati la migliore combinazione di loro vengono uniti per produrre il set finale di dati per uso nella determinazione della struttura e la raffinatezza. Diverse finalità di questo processo di fusione può essere per ottenere piena completezza (altamente consigliato), alta molteplicità o le migliori statistiche di dati (alta < I/σ(I) >, R-fattori di Bassi, ecc.). Quest'ultimo può talvolta essere a scapito della completezza e/o molteplicità, così questa opzione dovrebbe essere scelto con cura.
<ol><li>Unire i set di dati parziali utilizzando il programma ccCluster14. Utilizza Hierarchical Cluster Analysis (HCA) per determinare le possibili combinazioni di isomorfe insiemi di dati parziali ().<ol>
<li>Digitare ccCluster nel terminale Unix per aprire l'interfaccia utente grafica (GUI). Nota: Nella GUI di ccCluster un dendrogramma viene disegnato. Questo dà un suggerimento su quale set di dati parziale potrebbe risultare migliore Unito basato su isomorfismo tra di loro.</li>
		<li>Fare clic su un nodo che corrisponde a un valore di circa 0.4 sull'asse verticale. In genere, i valori più alti includerà dati più parziali di moda portare ma in peggio l'Unione statistiche come serie di dati parziali saranno meno isomorfe.</li>
		<li>Fare clic su Unisci dati. Il cluster selezionato saranno trattati in background e le statistiche di fusione stimate apparirà in una nuova scheda nella GUI. Questo passaggio può essere ripetuto per diverse combinazioni di insiemi di dati. Per una buona combinazione di serie di dati parziali la completezza dovrebbe essere vicino al 100%, < I/σ(I) > valori elevati (10 o superiore in shell risoluzione minima) e i valori di31 R-meas bassa (circa il 5% in shell bassa risoluzione).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per ogni combinazione selezionata è possibile utilizzare lo script di input generato per unire i set di dati parziali scelti in un file di singolo mtz (cioè, inutile32).</li>
	<li>Definitivamente in scala e unire i dati di intensità in questo file utilizzando un programma di ridimensionamento (cioè, aimless32) e, come con un file proveniente da una raccolta di dati di cristallo singolo, utilizzare l'uscita per successive phasing e soluzione di strutture33 .</li>
</ol>

<ol>
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B. G., McCarthy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+mini-&#954;+goniometer+head+in+macromolecular+crystallography+diffraction+experiments.">The use of a mini-&#954; goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).</li><li>Evans, P. R., Murshudov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+are+my+data+and+what+is+the+resolution?.">How good are my data and what is the resolution?.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).</li><li>Taylor, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+phasing.">Introduction to phasing.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESRF+upgrade+programme+phase+II+(2015+-+2022).">ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022).</a> The orange book. , (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Il successo di un esperimento di MX dipende solitamente l'esistenza di relativamente grandi, ben diffracting cristalli. Per i progetti cui ottimizzazione da docce piccolo cristallo a cristalli più grandi non riesce, MeshAndCollect fornisce una possibilità per ottenere un set di dati di diffrazione completa per struttura soluzione tramite la combinazione dei set di dati parziale isomorfe raccolti da una serie di piccoli cristalli. Il metodo è compatibile con sincrotrone beamlines per MX, idealmente con un flusso di fotoni ad alta e un piccolo fascio di diametro, dotato di un dispositivo di diffrattometro d'avanguardia e un rilevatore di lettura veloce. Su una stazione di fine, la parte di raccolta di dati di tale esperimento porterà circa 20 minuti, a seconda del numero di serie di dati parziali per essere raccolti e il numero di cristallo contenenti supporti del campione da analizzare.
La condizione più importante per il successo di un esperimento di MeshAndCollect è l'esistenza di un numero sufficiente (almeno 50, 100 idealmente) di diffracting posizioni il supporto del campione. Dall'esperienza, la dimensione minima dei cristalli da analizzare deve essere circa 5 µm nella dimensione più piccola. Il metodo è compatibile con qualsiasi tipo di standard compatibile cryo-raffreddamento del campione titolari con i migliori risultati raggiunti utilizzando mesh monti che sono rigide e dritto.
Presso l'ESRF, MeshAndCollect viene implementata in modo user-friendly in un flusso di lavoro Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en)30 disponibile nel software di controllo beamline MXCuBE2. Dei principali vantaggi di MeshAndCollect rispetto ad altri metodi SX è che i dati raccolti possono essere elaborati da programmi standard e automatizzata di tubazioni utilizzate per singolo cristallo MX.
Come dimostra il nostro esempio, MeshAndCollect è molto facile da applicare e porta ad una serie di insiemi di dati di diffrazione parziale, solitamente raccolti da piccoli cristalli, che possono essere Uniti per produrre un set di dati completo per l'uso nella soluzione della struttura. Inoltre, MeshAndCollect ha il potenziale per aprire lo spazio di campionamento di cristallografia di proteine in quanto fornisce un modo per raccogliere dati utilizzabili dalle prove di cristallizzazione dove l'ultimo passaggio di ottimizzazione, la produzione di cristalli di grandi dimensioni, è riuscita.
Alla luce degli attuali sviluppi verso più luminosi sorgenti di raggi x (per esempio, estremamente brillante fonte (EBS) progetto/ESRF35) è prevedibile che a causa di danno da radiazione aumentata, il tipo di raccolta di dati multi-cristallo facilitato da MeshAndCollect diventerà il metodo standard di raccolta di dati, piuttosto che un'eccezione – come è attualmente il caso - a base di sincrotrone beamlines MX.

Cristallografia macromolecolare (MX) è, di gran lunga il metodo più utilizzato per comprendere le strutture tridimensionali delle macromolecole biologiche risoluzione atomica. Tuttavia, un collo di bottiglia più importanti è il requisito per cristalli relativamente grandi, ben diffrangano.
Spesso e in particolare quando la cristallizzazione di proteine di membrana, possono essere ottenuti solo molto piccoli cristalli di pochi micron di dimensione più grande. Danno da radiazione effetti limite la risoluzione un completo dei dati di diffrazione che possa essere raccolti da un singolo cristallo micro2e molto spesso, è necessario migliorare il rapporto segnale-rumore e quindi dati impostare risoluzione, fondendo diversi insiemi di dati di diffrazione parziale da cristalli diversi, ma isomorfi. Gli aumenti nella densità di cambiamento continuo di fasci di raggi x presso sincrotroni e altrove (ad esempio elettroni liberi a raggi x (X-FELs) laser), hanno fatto sì che insiemi di dati di diffrazione parziale utili possono essere raccolti da cristalli anche molto piccoli del biologico macromolecole. Questo, a sua volta, ha portato allo sviluppo di nuove tecniche per la raccolta e l'Unione di insiemi di dati di diffrazione parziale raccolti da molti cristalli diversi al fine di produrre un set di dati completo per la soluzione della struttura. Tali tecniche sono comunemente come seriale cristallografia (SX)3,4,5,6,7,8. Un esempio prototipo di SX è l'uso di dispositivi di iniettore per introdurre un flusso stretto di un impasto di cristallo nei raggi x larghezza3,4,5. Un reticolo di diffrazione viene registrato ogni volta che un cristallo è esposto ai raggi x che conduce alla raccolta, da molte migliaia di singoli cristalli, di 'ancora' immagini di diffrazione, informazioni che viene unita a produrre un set di dati completo. Tuttavia, un notevole svantaggio di questo tipo di raccolta dei dati seriale è che l'elaborazione di immagini fisse può essere problematico. La qualità dei dati è notevolmente migliorata se cristalli possono essere ruotati e/o diverse immagini di diffrazione sono raccolti dal cristallo stesso durante gli esperimenti di cristallografia seriale6.
MeshAndCollect1 è stato sviluppato con l'obiettivo di coniugare SX con collezione di dati di rotazione MX 'standard' e permette, in modo automatico, sperimentatori di raccogliere set di dati di diffrazione parziale da numerosi cristalli dello stesso bersaglio macromolecolare montato sui portacampioni uguali o diversi. Un set di dati di diffrazione completa viene quindi ottenuto unendo il più isomorfa dei set parziale di dati raccolti. MeshAndCollect è compatibile con qualsiasi beamline di raggi x di sincrotrone di state-of-the-art per MX (idealmente un impianto di dispositivo di inserimento con un relativamente piccolo (20 µm o meno) larghezza dimensioni in corrispondenza della posizione del campione). Oltre alla compilazione dei set completi di dati da una serie di cristalli piccoli, ben diffrangano, il metodo è anche molto adatto per la valutazione sperimentale iniziale della qualità diffrazione di micro-cristalli e per il trattamento dei campioni opachi, ad esempio, in meso cresciuta microcristalli di membrana proteine9.
All'inizio di un esperimento di MeshAndCollect, le posizioni, in due dimensioni, di ciascuno dei molti cristallo contenuta in un supporto singolo campione sono determinate utilizzando una scansione a raggi x di bassa dose. Le immagini di diffrazione raccolte durante questa scansione automaticamente vengono analizzate dal programma DOZOR1, che ordina le posizioni dei cristalli il supporto del campione secondo la loro forza rispettiva diffrazione. Posizioni per la raccolta di set di dati parziali vengono assegnati automaticamente in base a un cut-off forza di diffrazione e, nell'ultimo passaggio, piccoli cunei di dati di diffrazione, tipicamente ± 5 ° di rotazione, vengono raccolti da ogni posizione scelta. L'esperienza ha dimostrato che questa gamma di rotazione fornisce una quantità sufficiente di riflessioni al cristallo per set di dati parziale ridimensionamento fini, mentre allo stesso tempo, ridurre i problemi di centraggio di cristallo possibili e la possibilità di esporre più cristalli in un 1di supporto particolarmente affollate. Le zeppe di dati di diffrazione individuali (serie di dati parziali) sono quindi trattati sia manualmente o utilizzando l'elaborazione automatica dei dati e condutture10,11,12,13. Per la determinazione della struttura a valle quindi è necessario trovare la migliore combinazione di set di dati parziali per essere unite14,15,16 dopo che l'intero set di dati risultante può essere trattato nello stesso modo come uno che proviene da un cristallo singolo esperimento.
Come esempio di MeshAndCollect in pratica, vi presentiamo qui la soluzione della struttura cristallina di Cerulean la ciano proteina fluorescente (CFP), utilizzando un set di dati di diffrazione costruito dalla combinazione di parziale insiemi di dati raccolti da una serie di microcristalli montato sul supporto del campione stesso. Celestopoli sono stato progettato da verde fluorescente Protein (GFP) dalla Medusa Aequorea victoria17, cui cromoforo fluorescente autocatalytically è formata dalla ciclizzazione dei tre consecutivi dell'amminoacido residui. Celestopoli sono ottenuta da GFP mutando i residui primi e la secondo il cromoforo, Serina e tirosina, treonina (S65T) e triptofano (Y66W) rispettivamente e adattando l'ambiente cromoforo con ulteriori mutazioni (Y145A, N146I, H148D, M153T e V163A) per produrre un livello significativo, ancora non ottimale di fluorescenza di QY = 0.4918,19,20. Le proprietà fluorescenti suboptimale di Cerulean sono state proposte per essere legata alle dinamiche di proteina complessa che coinvolge la stabilizzazione imperfetta di una delle undici β-fili della proteina21 e per la sistemazione di due differenti cromoforo isomeri a seconda del pH e irradiazione condizioni22. Abbiamo scelto di lavorare con Cerulean come proteina modello che illustrano l'utilizzo del protocollo MeshAndCollect a causa del relativamente facilità di sintonizzazione cristallo dimensione a seconda della cristallizzazione. La struttura di Cerulean è molto simile a che della sua proteina di padre GFP è costituito di un β-barilotto formata da undici β-fili che circondano un α-elica, che porta il cromoforo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline</td>
			<td>ESRF ID 23-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization plates XDXm with sealant</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Life Technologies Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>10-110-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroMeshes 700/25</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU:&#160;M3-L18SP-25L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 10/300 -GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5174-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9201-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186&#8211;3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aimless</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204&#8211;1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ccCluster</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844&#8211;1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeshAndCollect workflow</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328&#8211;2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCuBE2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700&#8211;707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24&#8211;226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>Max-Planck-Institut f&#252;r Medizinische Forschung</td>
			<td>Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125&#8211;132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect

Cristallografia a raggi x è la tecnica principale utilizzata per ottenere informazioni di alta risoluzione concernente le strutture 3-dimensionale delle macromolecole biologiche. Fino a poco tempo, un requisito importante è stata la disponibilità di relativamente grandi, ben diffracting cristalli, che spesso sono difficili da ottenere. Tuttavia, l'avvento della cristallografia seriale e un Rinascimento in metodi di raccolta dati multi-cristallino ha fatto sì che la disponibilità di grandi cristalli non devono più essere un fattore limitante. Qui, vi illustriamo l'utilizzo del protocollo MeshAndCollect automatizzato, che identifica innanzitutto le posizioni di molti piccoli cristalli montati su supporto del campione stesso e quindi dirige la collezione dai cristalli di una serie di insiemi di dati di diffrazione parziale per la fusione successiva e uso nella determinazione della struttura. MeshAndCollect può essere applicato a qualsiasi tipo di micro-cristalli, anche se debolmente diffracting. Ad esempio, presentiamo qui l'uso della tecnica per risolvere la struttura di cristallo della Cerulean ciano proteina fluorescente (CFP).

MeshAndCollect, come è implementato in MXCuBE2 (Vedi Figura 1A), è stato utilizzato per la raccolta di set di dati di diffrazione parziale da piccoli cristalli di Cerulean situate allo stesso titolare di campione in cui era difficile identificazione visiva dei cristalli. Per schermare il portacampioni, abbiamo disegnato una griglia sopra il centro della meshloop (cfr. Figura 1B) e basato sul DOZOR Punteggio calore mappa 85 diffrazione parziale (Vedi figure 1, 1D), insiemi di dati sono stati raccolti automaticamente. Questi sono stati integrati individualmente poi fusa (Vedi sopra) per produrre un set di dati con completezza di 99.8% a dmin = 1.7Å (cfr. tabella 1). Correlazione di metà-set (CC1/2)34 in shell più alta risoluzione era 60% (= 4,7). Come previsto, la struttura di cristallo di Cerulean poteva essere risolto semplicemente con sostituzione molecolare33 utilizzando il set di dati generato. Dopo un affinamento, abbiamo ottenuto un Rlavoro del 22,8% e un Rgratuito del 25,4%. Sovrapposizione con la struttura determinata in precedenza (PDB ingresso 2WSO21) Mostra un rmsd globale sulle posizioniα C 0.1 Å. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Statistiche del set di dati risultante</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Soglia di clustering</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Numero di dataset parziale</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gruppo spaziale</td>
			<td>P212121</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cella unitaria (a, b, c)</td>
			<td>50,98, 62,76, 69.50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gamma di risoluzioni</td>
			<td>46,58-1.70 (1,73-1,70)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmerge (tutti I + e -)</td>
			<td>0,133 (0.743)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (tutte le ho + & ho-)</td>
			<td>0.142 (0,813)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPIM (tutti ho + & ho-)</td>
			<td>0,047 (0,318)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Osservazioni totale/unico</td>
			<td>220693/25129</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mean((I)/SD(I))</td>
			<td>13.8 (4,7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Correlazione di metà-set MN(I) CC(1/2)</td>
			<td>0,994 (0,602)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Completezza</td>
			<td>99.8 (99,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Molteplicità</td>
			<td>8.8 (6,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Finale Rcryst
</td>
			<td>22,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Finale Rgratis
</td>
			<td>25.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Statistiche del set di dati risultante che indica l'alta qualità dei dati raccolti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58594/58594fig1.jpg"> Figura 1: utilizzo di MeshAndCollect per raccogliere una serie di set di dati parziale da una serie di piccoli cristalli contenuti nel supporto del campione stesso. A) l'interfaccia utente di MXCuBE2. L'ovale verde sopra il campo sull'asse visualizzatore indica lo strumento griglia. B) con esso viene disegnata una griglia sull'immagine del supporto del campione nel campo immagine di vita. Mappa di C) calore dei punteggi DOZOR. D) esempio di un'immagine di diffrazione. E) dendrogramma dopo analisi dei cluster gerarchica. Insiemi di dati in rosso sono stati utilizzati per l'Unione. F) struttura del Cerulean. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58594/58594fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect at JoVE.com

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Presentiamo l'uso del protocollo MeshAndCollect per ottenere un set di dati di diffrazione completa, per uso nella determinazione della struttura successivi, composto da set di dati di diffrazione parziale raccolti da molti piccoli cristalli della proteina fluorescente Cerulean.

Soluzione di strutture della proteina fluorescente Cerulean utilizzando MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Il protocollo automatizzato MeshAndCollect è stato sviluppato per combinare la cristallografia seriale con la raccolta standard dei dati di rotazione per misurare piccoli cristalli dai campioni di disco. Il metodo identifica prima la posizione dei cristalli montati sullo stesso portacampioni per poi dirigere la raccolta di set di dati parziali che verranno successivamente uniti e utilizzati per la soluzione della struttura. MeshAndCollect è avvincente in quanto consente di fare esperimenti rapidamente e con la stessa configurazione, soluzione di struttura, screening del ligando e tutto il genere con piccoli cristalli.Il metodo è compatibile con il VMX della beamline di sincrotrone, ideale per un flex di fotoni elevato, un piccolo diametro del fascio e un rilevatore di ricarica veloce. In primo luogo, connettersi al sistema informativo esteso per il database della beamline di cristallografia proteica e scegliere MX.Log con il numero dell'esperimento e la password dal modulo A. Selezionare Quindi Spedizione Aggiungi nuovo e compilare le informazioni richieste.Selezionare Aggiungi parziale e compilare i dati pertinenti. Selezionare Aggiungi contenitore, scegliere un disco SC3 e compilare le informazioni necessarie, incluse le posizioni dei supporti campione nel disco. Nell'hutch sperimentale, caricare il disco nel doer del cambio campione e notarne la posizione.Successivamente, accedere al sistema informativo per il database della beamline di cristallografia proteica. Selezionate Prepara esperimento (Prepare Experiment), trovate la spedizione, selezionate Avanti (Next) e indicate la posizione della linea trave e del disco nel cambiacampo. Accedere al software di controllo beamline con il numero sperimentale e la password forniti nel modulo A.Premere Sincronizza per sincronizzare il software di controllo della linea di fascio con il sistema informativo per il database della beamline di cristallografia proteica. Utilizzare il software di controllo della linea di fascio per montare il portacampioni sul goniometro. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse su una posizione nell'area del cambio di esempio e scegliere Campione montaggio.Selezionare il pulsante centrale e quindi tre clic al centro al centro del bordo della punta del ciclo. Salvare la posizione centrata selezionando Salva. In Avanzate aggiungere il riorientamento visivo del flusso di lavoro alla coda di raccolta dati.Quindi avviare il flusso di lavoro facendo clic su Raccogli coda. Selezionare quindi una delle posizioni del centro salvate facendo clic su di essa. Fare di nuovo clic sul pulsante centrale, quindi un centro di tre clic al centro dell'inizio dello stelo del ciclo.Salvare la seconda posizione cliccando su Salva. E poi clicca su Continua. Dopo che il flusso di lavoro ha allineato il piano del portacampioni con l'asse di rotazione del goniometro, centrare nuovamente il portacampioni da qualche parte al centro della mesh.Orientare il portacampioni in modo che la faccia della rete sia perpendicolare alla direzione del fascio di raggi X ruotando l'asse omega utilizzando il software di controllo della linea di fascio. Nel software di controllo della linea di fascio, fate clic sul menu a discesa Apertura (Aperture) e selezionate un valore. Quindi fai clic sull'icona dello strumento mesh per far emergere la finestra degli strumenti mesh.Nella vista campione del software di controllo della linea di fascio, disegnare la mesh facendo clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinando il mouse sull'area contenente cristalli sul supporto del campione. Per salvare la mesh, fare clic sul pulsante più nella finestra degli strumenti mesh. Nel campo di risoluzione del software di controllo della linea di fascio, immettere la risoluzione alla quale devono essere raccolte le immagini di diffrazione.Se non sono note informazioni preliminari sulla qualità della diffrazione dei cristalli, si raccomanda un valore compreso tra due e 2,5. Selezionare MeshAndCollect nella scheda Raccolta dati avanzata. Aggiungerlo alla coda e fare clic su Raccogli coda.Nella finestra dei parametri, utilizzate i parametri di default dipendenti dalla linea di fascio. Nell'esperimento qui descritto, i parametri predefiniti sono 0,037 secondi di esposizione per punto di scansione mesh, trasmissione al 100% e oscillazione di un grado per linea di scansione mesh. Fare clic su Continua.La scansione mesh funziona e le immagini di diffrazione raccolte in ogni punto della griglia vengono analizzate e classificate in base alla forza di diffrazione con il software Dozer. Dopo l'analisi Dozer, viene generata una mappa termica e l'ordine per le successive raccolte parziali di dati viene assegnato automaticamente in base alla forza di diffrazione. Infine, fare clic su Continua per avviare le raccolte dati parziali.MeshAndCollect implementato in MXCuBE è stato utilizzato per la raccolta di set di dati di diffrazione parziale da piccoli cristalli di Cerulean situati sullo stesso supporto del campione in cui l'identificazione visiva dei cristalli era difficile. Per schermare il portacampioni, è stata disegnata una griglia al centro del ciclo mesh e, in base alla mappa termica del punteggio Dozer, sono stati raccolti automaticamente 85 set di dati di diffrazione parziale. Questi sono stati integrati individualmente e poi uniti per produrre un set di dati con una completezza del 99,8% con una risoluzione di 1,7 angstrom.Come previsto, la struttura cristallina del ceruleo potrebbe essere risolta con la sostituzione molecolare usando il set di dati generato. Dopo il perfezionamento, sono stati ottenuti un lavoro di R del 22,8% e una R priva del 25,4%. La super posizione della struttura determinata in precedenza mostra un RMSD globale su posizioni c-alfa di 0,1 angstrom.Per i progetti in cui l'ottimizzazione della fase di crescita dei cristalli, MeshAndCollect offre la possibilità di ottenere un set di dati completo basato sulla combinazione di questi insiemi di dati parziali amorfo ottenuti da cristalli più piccoli. Questa tecnica ha spianato la strada ai biologi strutturali per risolvere una struttura dal campione di parti in cui non è stato possibile produrre solo pochi decimi di microcristamenti.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ricerca

Biochimica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Indagine sulla proteina Sequenza-struttura-dinamica Relazioni con Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Purificazione di affinità del cloroplasto Translocon proteina complessi usando il Tag di rubinetto

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Studi strutturali di macromolecole in soluzione con piccolo angolo x-ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Alta sensibilità misura dell'affinità di legame di DNA di fattore di trascrizione per titolazione competitivo mediante microscopia a fluorescenza

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

La struttura e la dinamica dei nucleosomi usando la formazione immagine di microscopia di forza atomica di sondaggio

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Liposoma singole misurazioni per lo studio degli enzimi di membrana Proton-pompaggio usando microscopia fluorescente ed elettrochimica

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Localizzazione delle proteine di SUMO-modificate utilizzando proteine di cattura di Sumo fluorescente

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Valutazione dell'ossidazione cellulare utilizzando una proteina fluorescente verde sensibile al comparto subcellulare

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...