Name: structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect
Uploaded: 2019-03-19T13:00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect at JoVE.com

Vi takker ESRF for å gi strålen tid gjennom sin egen forskningsprogram.

1. uttrykk og rensing av Cerulean
Merk: Dette er basert på protokollen publisert av Lelimousin et al. 21
<ol><li>Uttrykke sin-merket Cerulean i Escherichia coli BL21 celler dyrket på 37 ° C i 4 L auto induserbart middels23 til OD600= 1 og deretter ruge over natten på 27 ° C.</li>
	<li>Høste bakterieceller 5000 x g og lyse celler via sonication (40%, 5 min, 10 s puls, 10 s pause) i 200 mL buffer består av 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl og 1 x EDTA-fri proteasehemmere.</li>
	<li>Last nedbryting på en hans-trap Ni-NTA kolonne og elute Cerulean med 100 mM imidazole i samme buffer vilkår.</li>
	<li>Basseng lyse gul farget fraksjoner. Proteinet er egentlig farget, derfor Cerulean inneholder fraksjoner er lett identifiserbar.</li>
	<li>Rense protein (4 mL) på en S75 kolonne i 20 mM Tris pH 8.0.</li>
	<li>Basseng lyse gule fraksjoner og konsentrere protein løsningen 15 mg/mL.</li>
</ol>2. krystallisering
<ol><li>Bruker det hengende miste damp diffusjon teknikk24 ved 20 ° C i Linbro plater. Fylle brønnene med 1 mL av en precipitant løsning med 100 mM HEPES ved pH 6,75, 12% PEG8000 og 100 mM MgCl2. Den hengende dråper, blande 1 µL av protein konsentrert til 15 mg/mL med 1 µL precipitant løsning. Krystaller skal vises i 24 timer.</li>
	<li>Harvest krystallene innhentet og overføre dem til 100 µL av en seeding buffer består av 0.1 M HEPES pH 6,75, 22% pinne 8000.</li>
	<li>Grind krystaller med en 0,1 mL vev jeksel og fortynne i seeding buffer (forhold 1: 100).</li>
	<li>Fordøye en aliquot av protein lager løsningen (15 mg/mL) med trypsin (0,5 mg/mL i samme buffer) 1t (1:10 (v/v)).</li>
	<li>Bland fordøyd protein-løsning med 10% av frø inneholder bufferen (v/v).</li>
	<li>Vokse krystaller (10 * 10 * 20 µm3) i 0.1 M HEPES pH 7, 14% pinne 8000, 0,1 MgCl2 i 1-1,5 μL hengende dråper med metoden damp spredning.</li>
</ol>3. Crystal montering
<ol><li>Bruk en egnet loop, f.eks en mesh loop 700 firkantet hull på 25 µm montert på en RYGGRAD standard eksempel holderen25. Overføre krystaller fra krystallisering rullegardinlisten (trinn 2.6) til 1 µL kryoprotektant løsning (vel precipitant løsningen blandet med glyserol (20% v/v endelige)).</li>
	<li>Montere protein krystall slurry til en mesh loop ved å flytte loop under krystaller og løfte dem ut av fall. Ideelt skal krystaller i området størrelse på 5 µm-30 µm i maksimumsdimensjonen uten overlapping mellom krystaller montert i loopen.</li>
	<li>Veken av overflødig væske ved å berøre mount raskt med filter papir. Sediment krystallene slik at de sitter i flyet av loopen omgitt av så lite bulk væske som mulig.</li>
	<li>Stupe fjellet i en unipuck full av flytende nitrogen. Lagre pucken på 100 K i et egnet beholderen til strålen er tilgjengelig.</li>
</ol>4. frakoblet utarbeidelse av synchrotron eksperimentet
Merk: Be om synchrotron strålen tid så tidlig som mulig, og følg de elektroniske retningslinjene for tilgjengelige tilgangstyper og hvordan du sender inn en søknad for en gitt synchrotron. ESRF retningslinjene kan finnes på http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. Hvis et medlem av en ESRF blokk tildeling Group (BAG), kreves ikke et program for hver bestemt prosjekt. I dette tilfellet bør forskere tilnærming deres BAG ansvarlig om planleggingen av bjelke tid.
<ol><li>Når forslaget er akseptert og en invitasjon for eksperimentet er mottatt, har alle deltakerne fullføre sikkerhetsopplæring. Fyll ut "A-skjemaet" (via ESRF Brukerportal, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) med nødvendige sikkerhetsinformasjonen på prøvene. Kontakt lokale kontaktpersonen for å diskutere eksperimentet. Når din A-skjemaet er sendt og godkjent vil det gi deg eksperiment antallet og passord.</li>
	<li>Koble til utvidet ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) og velg MX.</li>
	<li>Logg på med eksperimentet nummeret og passordet fra A-skjemaet.</li>
	<li>Velg forsendelse | Legg til ny , og fyll ut den forespurte informasjonen.</li>
	<li>Velg Legg til pakke og fyll ut relevante data. Velg Legge til beholder, velge en unipuck og fylle ut informasjonen som kreves, inkludert plasseringen av prøven innehaverne pucken.</li>
</ol>5. lasting av prøven på en Beamline
<ol><li>I eksperimentelle bur, laste pucken inn prøven veksler (SC) dewar og noter plasseringen.</li>
	<li>Sperre eksperimentelle hytta og angi kontroll bur.</li>
	<li>Logg på ISPyB (https://esrf.fr/). Velg Klargjøre eksperimentet, finne forsendelsen, velg neste og angi beamline og pucken plasseringen i SC.</li>
	<li>Logg inn i beamline kontroll programvare, her MXCuBE227,28 med eksperimentelle nummer og passord på A-skjemaet.<ol>
<li>Trykk Sync til å synkronisere den beamline programvaren med ISPyB database.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bruk av beamline programvare, montere eksempel holderen på goniometer. I MXCuBE2, Høyreklikk en posisjon i et veksler område og velger Mount prøven.</li>
	<li>Utnytter de MK3 mini kappa goniometer29 installert på de fleste av ESRF MX beamlines, bruker MXCuBE2's "visuelle omstilling" arbeidsflyt30 justere flyet av prøven holderen med rotasjonsakse av goniometer.<ol>
<li>Velg knappen sentrum , klikk deretter 3 center på midten av kanten av spissen av løkken. Lagre sentrert posisjon ved å velge Lagre.</li>
		<li>Klikk igjen på sentrum -knappen, klikk deretter 3 sentrum midt i starten av stammen i loopen. Lagre posisjon også ved å klikke på Lagre.</li>
		<li>Velg en av de lagrede sentrert stillingene ved å klikke den.</li>
		<li>Under Avansert, legge til arbeidsflyten visuelle nyorientering MxCuBE2 samling Datakøen.</li>
		<li>Starte arbeidsflyten ved å klikke på samle køen.</li>
		<li>Når arbeidsflyten justerer flyet av prøven holderen med rotasjonsakse goniometer, center prøve abonnenten igjen, denne gangen et sted i midten av nettet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Orientere prøven holderen slik at ansiktet av nettet er vinkelrett til X-ray strålen retning ved å rotere omega aksen med MXCuBE2.</li>
	<li>I MXCuBE2, velger du strålen størrelsen kreves for skanning av prøven holderen (bare for beamlines med variabel bredde størrelse).<ol>
<li>Klikk på blenderåpning rullegardinmenyen i beamline kontroll programvare og velg en verdi, f.eks 10 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Define en maske på mesh skanning.<ol>
<li>Klikk på ikonet mesh verktøy i MXCuBE2. Vinduet mesh verktøy vises.</li>
		<li>I visningen utvalg av MXCuBE2 tegne mesh ved venstre klikke og dra musen over området med krystaller eksempel holderen for.</li>
		<li>Lagre mesh Klikk på pluss -knappen i vinduet mesh verktøy (mesh blir grønn).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. – og gjennomføre MeshAndCollect arbeidsflyten
<ol><li>Angi oppløsningen (dmin) på hvilke Diffraksjon bilder skal samles, f.eks her 1.8 Å i feltet oppløsning av MXCuBE2.</li>
	<li>Velg MeshAndCollect i kategorien Avansert data samling, legge det til i køen og klikk samle i køen.</li>
	<li>Bruk beamline avhengige standardparametere i parameter-vinduet som vises. I eksperimentet beskrevet her standard parametere er 0.037 s eksponeringstid pr. mesh skanning punkt, 100% overføring (i dette tilfellet fører til 4 x 1011 ph/s), 1 ° svingning per mesh skanning linje.</li>
	<li>Klikk Continue. Mesh skanningen kjører og Diffraksjon bildene samlet på hver punktet i rutenettet er analysert og rangert etter Diffraksjon styrke med programvaren DOZOR1. Denne prosessen kjøres i bakgrunnen.</li>
	<li>Etter DOZOR analyse genereres en varmekart og rekkefølgen for påfølgende deldata samlinger tilordnes automatisk basert på Diffraksjon styrke (se figur 1). Merk: Resultatene av dette trinnet kan også undersøkes i ISPyB. For innsamling av delvis datasett en ny tab med innstillingene dukker opp i den beamline programvaren, velger du passende verdier for rotasjon området (dvs. 0,1 °), antall bilder (dvs. 100), eksponeringstid, oppløsning, overføring, omvendt strålen etc. ideelt dosen for hver kile inn skal være under Garman grensen (30 MGy). Omtrentlig eksponeringstid per bilde er 0.037 s til 0.1 s i beskrevet eksperimentelle forhold.</li>
	<li>Klikk Fortsett for å starte den delvise data samlinger.</li>
</ol>7. databehandling
Merk: Delvis datasettene er integrert med et passende program (XDS10). For dette vil et Python-skript bli brukt som gjenkjenner hvert individuelle datasett, integrerer den og kontrollerer at indeksering mellom forskjellige delvis datasettene er konsekvent.
<ol><li>Åpne mappen som inneholder bildene: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean.</li>
	<li>Kopiere sikkerhet undermappen prosessen som finnes i mappen hvor delvis datasettene er samlet inn.<ol>
<li>På en Linux terminal, kan du bruke kommandoen cp-r prosessen process_backup.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Naviger til mappen prosessen og starte behandlingsskriptet.<ol>
<li>På en Linux terminal, Skriv inn kommandoen cd-prosessen og trykk enter.</li>
		<li>Type procMultiCrystalData og trykk enter. Merk: Skriptet vil be om en plass gruppe og celle parametere (denne informasjonen er valgfri), angi de i henhold til instruksjonene. Etter en siste bekreftelse fra brukeren, vil skriptet kjøres automatisk.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. sammenslåing av datasett
Merk: Etter at alle delvis datasett er integrert den beste kombinasjonen av dem slås sammen for å produsere det endelige datasettet for bruk i proteinstrukturer og raffinement. Ulike mål av denne sammenslåing prosessen kan være å skaffe full fullstendighet (anbefales), høy mangfold beste data statistikken (høy < I/σ(I) >, lav R-faktorer, etc.). Sistnevnte kan noen ganger være på bekostning av fullstendighet og/eller mangfold så dette alternativet bør velges med omhu.
<ol><li>Flette delvis datasettene bruk programmet ccCluster14. Den bruker hierarkisk klynge analyse (HCA) for å bestemme mulige kombinasjoner av isomorphous delvis datasett ().<ol>
<li>Skriv inn ccCluster i Unix-terminal til å åpne grafisk brukergrensesnitt (GUI). Merk: CcCluster GUI en dendrogram er tegnet. Dette gir et forslag om hvilke delvis datasett kan være best fusjonert basert på isomorphism mellom dem.</li>
		<li>Klikk på en node som tilsvarer en verdi på om 0,4 på den loddrette aksen. Høyere verdier vil vanligvis inneholde mer deldata sett men leder til verre sammenslåing statistikk som delvis datasett blir mindre isomorphous.</li>
		<li>Klikk på slå sammen DATA. Den valgte sektorgruppen behandles i bakgrunnen og anslått flette statistikken vises i en ny fane i GUI. Dette trinnet kan gjentas for ulike kombinasjoner av datasett. For en god kombinasjon av delvis datasett til fullstendigheten bør være nær 100%, < I/σ(I) > verdier høy (10 eller høyere i laveste oppløsning shell) og R-tiltak31 verdiene lav (rundt 5% i lav oppløsning skallet).</li>
	</ol>
</li>
	<li>For hver kombinasjon av valgte Bruk generert inn skriptet for å fusjonere delvis datasettene valgt til en enkelt mtz fil (dvs. meningsløs32).</li>
	<li>Definitivt skalering og flette intensitet dataene i filen med et skalering program (dvs. planløs32) og, som med en fil fra en enkelt krystall datainnsamling, bruk for påfølgende fase og struktur løsning33 .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeshAndCollect:+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines.">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Protection+of+Protein+Crystals+against+Radiation+Damage+in+Electron+and+X-Ray+Diffraction.">Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).</li><li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography.">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).</li><li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography:+the+first+five+years.">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).</li><li>Stellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+macromolecular+serial+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).</li><li>Coquelle, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-scanning+serial+protein+crystallography+using+micro-+and+nano-focused+synchrotron+beams.">Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).</li><li>Diederichs, K., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Synchrotron+X-Ray+Crystallography+(SSX).">Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX).</a> Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).</li><li>Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., B&#252;ldt, G., Gordeliy, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-Radiation-Induced+Changes+in+Bacteriorhodopsin+Structure.">X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (5), 813-825 (2011).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS+implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF.">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li><li>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+clustering+for+multiple-crystal+macromolecular+crystallography+experiments:+the+ccCluster+program.">Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844-1851 (2017).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+of+synchrotron+serial+crystallographic+data+by+a+genetic+algorithm.">Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).</li><li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography.">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength+mutations+and+posttranslational+autoxidation+of+green+fluorescent+protein.">Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12501-12504 (1994).</li><li>Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2:+Understanding+Structure-Function+Relationships+in+the+Aequorea+victoria+Green+Fluorescent+Protein.">Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein.</a> Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Lelimousin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Dynamics+in+ECFP+and+Cerulean+Control+Fluorescence+Quantum+Yield.">Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield.</a> Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).</li><li>Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromophore+Isomer+Stabilization+Is+Critical+to+the+Efficient+Fluorescence+of+Cyan+Fluorescent+Proteins.">Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins.</a> Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).</li><li>Rhodes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. , (2006).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Gabadinho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MxCuBE+a+synchrotron+beamline+control+environment+customized+for+macromolecular+crystallography+experiments.">MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).</li><li>De Santis, D., Leonard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notiziario+Neutroni+e+Luce+di+Sincrotrone.">Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone.</a> Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).</li><li>Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+mini-&#954;+goniometer+head+in+macromolecular+crystallography+diffraction+experiments.">The use of a mini-&#954; goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).</li><li>Evans, P. R., Murshudov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+are+my+data+and+what+is+the+resolution?.">How good are my data and what is the resolution?.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).</li><li>Taylor, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+phasing.">Introduction to phasing.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESRF+upgrade+programme+phase+II+(2015+-+2022).">ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022).</a> The orange book. , (2015).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre

Suksessen til et MX eksperiment er vanligvis avhenger av eksistensen av relativt store, godt diffracting krystaller. For prosjekter der optimalisering fra liten krystall dusjer til større krystaller mislykkes, gir MeshAndCollect en mulighet for å få en komplett Diffraksjon datasett for struktur løsning via kombinasjonen av isomorphous delvis datasett samlet fra en rekke små krystaller. Metoden er kompatibel med synchrotron beamlines for MX, helst med en høy Foton forandring og en liten stråle diameter, utstyrt med en toppmoderne diffractometer enhet og en rask-avlesning detektor. På slike en endestasjon tar data collection del av slikt eksperiment ca 20 minutter, avhengig av antall delvis datasett som samles og antall krystall-inneholder eksempel holdere som skal analyseres.
Den viktigste forutsetningen for suksessen til et MeshAndCollect eksperiment er eksistensen av et tilstrekkelig antall (minst 50, 100 ideelt) av diffracting posisjoner på prøven abonnenten. Fra erfaring, bør minimumsstørrelsen på krystaller som skal analyseres være ca 5 µm i minste dimensjon. Metoden er kompatibel med alle slags standard cryo-kjøling kompatibel Prøv innehaverne med de beste resultatene oppnås med mesh ridedyr som er stive og rett.
På ESRF, er MeshAndCollect implementert i en brukervennlig måte i en Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) arbeidsflyt30 tilgjengelig fra den MXCuBE2 beamline programvaren. En stor fordel av MeshAndCollect sammenlignet med andre SX metoder er at de innsamlede dataene kan behandles av standard programmer og automatisert rørledninger brukes for én krystall MX.
Som vårt eksempel viser, MeshAndCollect er svært enkel å bruke og fører til en rekke delvis Diffraksjon datasett, vanligvis samlet fra små krystaller, som kan flettes for å produsere et komplett datasett for bruk i strukturen løsning. Videre har MeshAndCollect potensial til å åpne opp prøvetaking løpet av protein krystallografi som det gir en måte å samle brukbare data fra krystallisering forsøk der optimalisering programmvaren, produksjon av store krystaller, er mislykket.
I lys av dagens utvikling mot lysere X-ray kilder (f.eks ekstremt strålende kilde (EBS) prosjekt/ESRF35) er det forventede at på grunn av økt stråling skade, typen multi-krystall datainnsamling lettere av MeshAndCollect vil bli standardmetoden for datainnsamling, i stedet for et unntak-som er tilfelle - på synchrotron-baserte MX beamlines.

Macromolecular Røntgenkrystallografi (MX) er langt, den mest brukte metoden for å få atomic oppløsning innsikt i tredimensjonale strukturer av biologiske makromolekyler. En stor flaskehalser er imidlertid behovet for relativt store, godt diffracting krystaller.
Ofte, og spesielt når bandets membran proteiner, bare svært små krystaller av noen få mikroner i største dimensjon kan oppnås. Stråling skader effekter grensen oppløsningen til en komplett Diffraksjon data angitt som kan hentes fra en enkelt mikro krystall2, og svært ofte, er det nødvendig å forbedre signal til støyforhold og dermed angitt oppløsning ved å flette flere delvis Diffraksjon datasett fra ulike, men isomorphic krystaller. Økningen i flux tettheten av X-ray bjelker ved synchrotron kilder og andre steder (f.eks X-ray fri-elektron lasere (X-FELs)), har betydd at nyttig delvis Diffraksjon datasett kan hentes fra selv svært små krystaller av biologisk makromolekyler. Dette, i sin tur har ført til utviklingen av nye teknikker for innsamling og sammenslåing av delvis Diffraksjon datasett samlet fra mange forskjellige krystaller for å produsere et komplett datasett struktur løsning. Slike teknikker er ofte referert til som føljetong krystallografi (SX)3,4,5,6,7,8. En prototypiske eksempel på SX er bruk av injektor enheter å innføre en smal strøm av en krystall slurry i røntgenbilde stråle3,4,5. Et Diffraksjon mønster registreres hver gang en krystall er eksponert for røntgenstråling fører til samlingen, fra tusenvis av individuelle krystaller, '' Diffraksjon stillbilder, informasjon som slås deretter for å produsere et komplett datasett. En betydelig ulempe av denne typen føljetong datainnsamling er imidlertid at behandlingen av stillbilder kan være problematisk. Datakvaliteten er betydelig forbedret hvis krystaller kan roteres og/eller flere Diffraksjon bilder er samlet inn fra samme crystal under føljetong krystallografi eksperimenter6.
MeshAndCollect1 ble utviklet med sikte på å kombinere SX med 'standard' MX rotasjon datainnsamling og gir, i en automatisk måte, forskere samle delvis Diffraksjon datasett fra mange krystaller av samme macromolecular målet montert på samme eller forskjellige utvalg innehavere. Et komplett Diffraksjon datasett hentes ved å flette den mest isomorphous av delvis datasettene samlet. MeshAndCollect er kompatibel med alle state-of-the-art synchrotron X-ray beamline for MX (ideelt en innsetting enhet anlegg med en relativt liten (20 µm eller mindre) stråle størrelse utvalg der). I tillegg til kompileringen av komplette datasett fra en rekke små, godt diffracting krystaller er metoden også veldig egnet for første eksperimentelle vurdering av Diffraksjon kvaliteten på mikro-krystaller og for behandling av ugjennomsiktig prøvene, i meso vokst microcrystals membran proteiner9.
På starten av en MeshAndCollect eksperiment bestemmes plasseringen, i to dimensjoner, av mange krystall i en enkelt prøve holder med en lav dose X-ray skanning. Diffraksjon bildene samlet under denne skanningen analyseres automatisk av programmet DOZOR1, som sorterer plasseringen av krystallene på prøven abonnenten i henhold til deres respektive Diffraksjon styrke. Posisjoner for innsamling av delvis datasett tilordnes automatisk basert på en Diffraksjon styrke cut-off og i det siste trinnet, små huddeler Diffraksjon data, vanligvis ±5 ° av rotasjon, er samlet inn fra hver valgte posisjon. Erfaring har vist at dette rotasjon området gir en tilstrekkelig mengde refleksjoner per krystall for delvis datasettet skalering formål, mens på samme tid, redusere mulig krystall sentrering problemer og sjansen til å utsette flere krystaller i en spesielt overfylt støtte1. Individuelle Diffraksjon data kiler (delvis datasett) blir deretter behandlet enten manuelt eller ved hjelp av automatiserte databehandling rørledninger10,11,12,13. For nedstrøms proteinstrukturer er det da nødvendig å finne den beste kombinasjonen av delvis datasett skal flettede14,15,16 som det resulterende komplette datasettet kan behandles på samme måte som en som stammer fra en enkelt krystall eksperiment.
Som et eksempel på MeshAndCollect i praksis presenterer vi her løsningen av krystall Cyan fluorescerende Protein (CFP) Cerulean, bruker et Diffraksjon datasett konstruert av kombinasjonen av delvis datasett fra en rekke microcrystals montert på samme eksempel støtte. Cerulean er konstruert fra Green fluorescerende Protein (GFP) fra maneter Aequorea victoria17, som fluorescerende chromophore er autocatalytically dannet fra cyclisation av tre påfølgende aminosyre rester. Cerulean hentes fra GFP av mutere første og andre rester av chromophore, en serine og en tyrosin, threonin (S65T) og tryptofan (Y66W) henholdsvis og tilpasse chromophore miljøet med ytterligere mutasjoner (Y145A, N146I, H148D, M153T og V163A) å produsere et betydelig, men suboptimal fluorescens nivå av QY = 0.4918,19,20. Suboptimal fluorescerende egenskapene for Cerulean er foreslått å være knyttet til komplekse protein dynamics involverer imperfektum stabilisering av en av de elleve β-trådene protein21 og innkvartering av to forskjellige chromophore isomerene avhengig av pH og bestråling forhold22. Vi valgte å jobbe med Cerulean som en modell protein illustrerer bruken av MeshAndCollect protokollen grunn det relativt enkelt å tuning krystall størrelse avhengig av krystallisering. Strukturen i Cerulean er svært lik som sin overordnede protein GFP, som det er sammensatt av en β fat dannet av elleve β-tråder rundt en α-helix, som bærer chromophore.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline</td>
			<td>ESRF ID 23-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization plates XDXm with sealant</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Life Technologies Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>10-110-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroMeshes 700/25</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU:&#160;M3-L18SP-25L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 10/300 -GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5174-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9201-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186&#8211;3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aimless</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204&#8211;1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ccCluster</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844&#8211;1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeshAndCollect workflow</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328&#8211;2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCuBE2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700&#8211;707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24&#8211;226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>Max-Planck-Institut f&#252;r Medizinische Forschung</td>
			<td>Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125&#8211;132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect

Røntgenkrystallografi er store teknikken brukes til å få høy oppløsning informasjon om 3-dimensjonale strukturer av biologiske makromolekyler. Inntil nylig er en stor krav tilgjengeligheten av relativt store, godt diffracting krystaller, som er ofte utfordrende å få. Men har ankomsten av føljetong krystallografi og en renessanse for multi-krystall datainnsamlingsmetoder ment at tilgjengeligheten av store krystaller trenger ikke lenger være en begrensende faktor. Her illustrere vi bruken av automatiserte MeshAndCollect-protokollen, som først identifiserer plasseringen av mange små krystaller montert på samme eksempel holderen og leder deretter samlingen fra krystaller av en rekke delvis Diffraksjon datasett for etterfølgende fletting og bruk i proteinstrukturer. MeshAndCollect kan brukes til alle typer mikro-krystaller, selv om svakt diffracting. Som et eksempel presenterer vi her bruk av teknikken å løse krystallstruktur av Cyan fluorescerende Protein (CFP) Cerulean.

MeshAndCollect, som gjennomføres i MXCuBE2 (se figur 1A), ble brukt for innsamling av delvis Diffraksjon datasett fra små krystaller av Cerulean ligger på samme eksempel holderen som visuell identifikasjon av krystaller var vanskelig. Til skjermen eksempel innehaveren, vi trakk et rutenett over midten av meshloop (se figur 1B) og basert på DOZOR score varme kart (se tallene 1 c, 1 D) 85 delvis Diffraksjon datasett automatisk samlet inn. Dette ble individuelt integrert og fusjonerte (se ovenfor) for å produsere et datasett med 99.8% fullstendighet dmin = 1.7Å (se tabell 1). Halv-sett sammenheng (CC1/2)34 i høyeste oppløsning shell var 60% (= 4.7). Som forventet, kunne krystallstruktur av Cerulean oversiktlig løses ved molekylær erstatning33 bruke datasettet generert. Etter raffinement fikk vi en Rfungerer på 22,8% og en Rgratis 25,4%. Superposisjon med tidligere fastsatte struktur (PDB oppføringen 2WSO21) viser en global rmsd i Cα posisjoner på 0,1 Å. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Statistikk av flettede datasettet</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Klynging terskel</td>
			<td>0,35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antall delvis datasett</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plassen gruppen</td>
			<td>P212121</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enhet-cellen (a, b, c)</td>
			<td>50.98, 62.76, 69.50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oppløsning utvalg</td>
			<td>46.58-1,70 (1,73-1,70)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmerge (alle jeg + og jeg-)</td>
			<td>0.133 (0.743)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (alle jeg + & jeg-)</td>
			<td>0.142 (0.813)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim (alle jeg + & jeg-)</td>
			<td>0.047 (0.318)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Observasjoner totalt/unike</td>
			<td>220693/25129</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mean((I)/SD(I))</td>
			<td>13.8 (4.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MN(I) halv-sett sammenheng CC(1/2)</td>
			<td>0.994 (0.602)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fullstendigheten</td>
			<td>99.8 (99,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mangfold</td>
			<td>8.8 (6.5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Siste Rcryst
</td>
			<td>22,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Siste Rgratis
</td>
			<td>25,4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Statistikk av flettede datasettet indikerer høy kvalitet dataene samlet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58594/58594fig1.jpg"> Figur 1: bruke MeshAndCollect for å samle en rekke delvis datasett fra en rekke små krystaller i samme eksempel innehaveren. A) brukergrensesnittet til MXCuBE2. Den grønne knappen over feltet på aksen seer viser verktøyet rutenett. B) med det tegnes et rutenett på bildet av prøven holderen i livet bilde-feltet. C) varmekartet DOZOR score. D) eksempel på en Diffraksjon. E) Dendrogram etter hierarkisk klynge analyse. Datasett i rødt ble brukt til fletting. F) overordnede strukturen av Cerulean. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58594/58594fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect at JoVE.com

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Vi presenterer bruken av MeshAndCollect-protokollen for å få et komplett Diffraksjon datasett, for bruk i etterfølgende proteinstrukturer, består av delvis Diffraksjon datasett fra mange små krystaller av fluorescerende protein Cerulean.

Strukturen løsning av fluorescerende Protein Cerulean bruker MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Den automatiserte MeshAndCollect-protokollen ble utviklet for å kombinere seriekrystallografi med standard rotasjonsdatainnsamling for å måle små krystaller fra puckprøver. Metoden identifiserer først plasseringen av krystaller montert på samme prøveholder for deretter å lede innsamlingen av delvis datasett som senere skal slås sammen og brukes til løsningen av strukturen. MeshAndCollect er overbevisende som det lar deg gjøre eksperimenter raskt og med samme oppsett, struktur løsning, ligand screening, og alt det med små krystaller.Metoden er kompatibel med synchrotron beamline's VMX ideelt utstyrt med høy foton flex, en liten strålediameter og en rask reload detektor. Først kobler du til det utvidede informasjonssystemet for proteinkrystallografi beamline database og velg MX.Logg inn med eksperimentnummeret og passordet fra A-skjemaet. Deretter velger du Legg til forsendelse ny og fyller ut den forespurte informasjonen.Velg Legg til delvis, og fyll ut de relevante dataene. Velg Legg til beholder, velg en SC3-puck, og fyll ut informasjonen som kreves, inkludert posisjonene til prøveholderne i pucken. I den eksperimentelle hutch, laste pucken inn i prøveveksleren doer og merke sin posisjon.Deretter logger du inn på informasjonssystemet for proteinkrystallografi beamline database. Velg Klargjør eksperiment, finn forsendelsen, velg Neste, og angi strålelinjen og puckposisjonen i prøveveksleren. Logg på beamline kontrollprogramvaren med det eksperimentelle nummeret og passordet som er angitt i A-skjemaet.Trykk på Sync for å synkronisere programvaren for strålelinjekontroll med informasjonssystemet for proteinkrystallografistrålens database. Bruk programvaren for strålelinjekontroll til å montere prøveholderen på goniometeret. Høyreklikk deretter en posisjon i eksempelvekslerområdet, og velg Monter prøve.Velg midtknappen og deretter tre klikk midt på kanten av tuppen av løkken. Lagre den midterte posisjonen ved å velge Lagre. Legg til visual reorientering for arbeidsflyten i datainnsamlingskøen under Avansert.Start deretter arbeidsflyten ved å klikke på Samle køen. Deretter velger du en av de lagrede midtposisjonene ved å klikke på den. Klikk igjen på den midterste knappen, deretter en tre-klikks midt på starten av stammen av løkken.Lagre den andre posisjonen ved å klikke på Lagre. Og klikk deretter på Fortsett. Når arbeidsflyten justerer prøveholderens plan med rotasjonsaksen til goniometeret, sentrerer du prøveholderen igjen et sted midt i nettet.Orienter prøveholderen slik at forsiden av nettet er vinkelrett på røntgenstråleretningen ved å rotere omega-aksen ved hjelp av strålelinjekontrollprogramvaren. I beamline kontrollprogramvaren klikker du på Blenderåpning-rullegardinmenyen og velger en verdi. Klikk deretter på mesh verktøyikonet for å få opp mesh verktøyvinduet.I eksempelvisningen av strålelinjekontrollprogramvaren tegner du nettet ved å høyreklikke og dra musen over området som inneholder krystaller på prøveholderen. For å lagre nettet, klikk på plussknappen i nettingverktøyvinduet. I oppløsningsfeltet til programvaren for strålelinjekontroll angir du oppløsningen der diffraksjonsbilder skal samles inn.Hvis det ikke er kjent noen tidligere informasjon om krystallenes diffraksjonskvalitet, anbefales det en verdi mellom to og 2,5. Velg MeshAndCollect i kategorien Avansert datainnsamling. Legg den til i køen, og klikk Samle køen.Bruk de strålelinjeavhengige standardparameterne i parametervinduet. I eksperimentet som er beskrevet her, standardparametere er 0,037 andre eksponeringstid per mesh scan point, 100% overføring, og en grad oscillasjon per mesh scan linje. Klikk på Fortsett.Mesh-skanningen kjører og diffraksjonsbildene som samles inn på hvert rutenettpunkt analyseres og rangeres i henhold til diffraksjonsstyrke med programvaren Dozer. Etter Dozer-analysen genereres et varmekart, og rekkefølgen for etterfølgende delvise datasamlinger tilordnes automatisk basert på diffraksjonsstyrke. Til slutt klikker du Fortsett for å starte de delvise datasamlingene.MeshAndCollect som implementert i MXCuBE ble brukt til innsamling av delvise diffraksjonsdatasett fra små krystaller av Cerulean som ligger på samme prøveholder der visuell identifisering av krystaller var vanskelig. For å skjerme prøveholderen ble et rutenett trukket over midten av nettingsløyfen, og basert på Varmekartet for Doser-poengsum ble 85 delvise diffraksjonsdatasett automatisk samlet inn. Disse ble individuelt integrert og deretter slått sammen for å produsere et datasett med 99,8% fullstendighet med en oppløsning på 1,7 angstroms.Som forventet kan krystallstrukturen til Cerulean løses ved molekylær erstatning ved hjelp av datasettet som genereres. Etter raffinement ble det oppnådd et R-arbeid på 22,8 %og en R-fri på 25,4 %. Super posisjon av den tidligere bestemte strukturen viser en global RMSD på c-alfa posisjoner av 0,1 angstroms.For prosjekter der optimaliseringen av krystallvekstfasen gir MeshAndCollect muligheten til å få et komplett datasett basert på kombinasjonen av disse amorfe delvise datasettene hentet fra mindre krystaller. Denne teknikken banet vei for strukturelle biologer å løse en struktur fra deler prøve der bare noen få tiendedeler av mikrokrystaller ikke kunne produseres.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Undersøkelse av protein-sekvens-struktur-dynamikk Relasjoner med Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rensing av Chloroplast Translocon Protein komplekser hjelp av trykk-koden

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle studier av makromolekyler i løsning med liten vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Verifiserer strukturen og dynamikken i Nucleosomes med Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposome mål for studiet av Proton pumpe membran enzymer elektrokjemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifisert proteiner bruke fluorescerende Sumo-fangst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Vurdering av cellulær oksidasjon ved hjelp av et subcellulært romspesifikt Redox-Sensitive Green Fluorescerende protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...