Name: structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect
Uploaded: 2019-03-19T13:00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect at JoVE.com

Agradecemos a ESRF para fornecer tempo de feixe através de seu programa de pesquisa.

1. expressão e purificação de Cerulean
Nota: Isto é baseado no protocolo publicado por Lelimousin et al . 21
<ol><li>Express com sua tag Cerulean em Escherichia coli BL21 células cultivadas a 37 ° C em 4 L de auto inducible médio23 até OD600= 1 e então incubar durante uma noite a 27 ° C.</li>
	<li>Colheita de células bacterianas a 5.000 x g e lisar a células através do sonication (40%, 5 min, 10 pulso s, pausa de s 10) em 200 mL de tampão composto de 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM de NaCl e 1 x livre de EDTA inibidores de protease.</li>
	<li>Carregar o sobrenadante em uma coluna de sua armadilha Ni-NTA e eluir Cerulean com imidazol 100 mM nas mesmas condições de reserva.</li>
	<li>As frações de cores amarelas brilhantes da piscina. A proteína é intrinsecamente colorida, daí as frações que contêm Cerulean são facilmente distinguíveis.</li>
	<li>Purifica a proteína (4 mL) em uma coluna de S75 em 20 mM Tris de pH 8.0.</li>
	<li>As frações de amarelas brilhantes da piscina e concentrar a solução da proteína para 15 mg/mL.</li>
</ol>2. cristalização
<ol><li>Use o drop de enforcamento difusão técnica24 a 20 ° C em placas de Linbro de vapor. Encher os poços com 1 mL de uma solução precipitant consistindo de 100 mM HEPES pH 6,75, 12% PEG8000 e 100 mM MgCl2. Para as gotas de enforcamento, misture 1 µ l de proteína concentrada a 15 mg/mL com 1 µ l de solução precipitant. Cristais devem aparecer em 24h.</li>
	<li>Os cristais obtidos de colheita e transferência para 100 µ l de um buffer de semeadura compostas de 0,1 M pH HEPES 6,75, 22% PEG 8000.</li>
	<li>Moer os cristais com um moedor de tecido de 0,1 mL e diluir em semeadura tampão (relação 1: 100).</li>
	<li>Digeri uma alíquota da solução da proteína estoque (15 mg/mL) com tripsina (0,5 mg/mL, a mesma reserva) por 1h (01:10 (v/v)).</li>
	<li>Misturar a solução de proteína digerida com 10% de sementes contendo tampão (v/v).</li>
	<li>Crescer cristais (10 * 10 * 20 µm3) em 0,1 M pH HEPES 7, 14% PEG 8000, 0.1 MgCl2 em suspensão de 1-1,5 μL gotas usando o método de difusão de vapor.</li>
</ol>3. cristal montagem
<ol><li>Use um loop apropriado, por exemplo, uma malha 700 quadrados falhas de 25 µm cada montado em uma amostra-padrão de espinha titular25. Transferi os cristais da lista suspensa de cristalização (passo 2.6) em 1 µ l de solução crioprotetoras (a solução bem precipitant misturada com glicerol (20% v/v final)).</li>
	<li>Monte o chorume de cristal da proteína em um loop de malha movendo o loop sob os cristais e levantando-os fora da gota. Idealmente, os cristais devem ser na faixa de tamanho de 5 µm – 30 µm em dimensão máxima com nenhuma sobreposição entre cristais montado no loop.</li>
	<li>Pavio do excesso de líquido por tocar o Monte rapidamente com papel de filtro. Sedimentos os cristais para que sentam-se no plano do loop rodeado por tão pouco em massa de líquido possível.</li>
	<li>Mergulhe o monte um unipuck cheio de nitrogênio líquido. Armazene o disco a 100 K em um recipiente de armazenamento adequado até tempo de feixe está disponível.</li>
</ol>4. offline preparação do experimento síncrotron
Nota: Solicitar tempo síncrotron feixe tão cedo quanto possível e siga as orientações on-line para tipos de acesso disponíveis e sobre como submeter um pedido de um determinado síncrotron. As diretrizes ESRF podem ser encontradas em http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. Se um membro de um grupo de alocação de bloco ESRF (saco), um aplicativo para cada projeto específico não é necessário. Neste caso, experimentadores devem abordar seu saco responsável sobre a programação de tempo de feixe.
<ol><li>Depois que a proposta é aceita e é recebido um convite para o experimento, ter todos os participantes completar o treinamento de segurança. Preencha a "A forma" (através do portal do usuário ESRF, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) com as informações de segurança exigidas nas amostras. Entrar em contato com a pessoa de contacto local para discutir a experiência. Uma vez que seu uma-forma é apresentada e validada ele vai te dar o número do experimento e a senha.</li>
	<li>Conectar-se a estendida ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) e escolha o MX.</li>
	<li>Fazer login com o número do experimento e a senha a partir de uma-forma.</li>
	<li>Selecionar remessa | Adicionar novo e preencha as informações solicitadas.</li>
	<li>Selecione Adicionar parcela e preencha os dados relevantes. Selecione Adicionar Container, escolha um unipuck e preencha as informações necessárias, incluindo as posições dos titulares amostra no puck.</li>
</ol>5. carregamento da amostra em uma trajetória
<ol><li>No hutch experimental, carregar o disco para o trocador de amostra (SC) dewar e observe a sua posição.</li>
	<li>Bloqueiam a cabine experimental e insira o hutch de controle.</li>
	<li>Acesse o ISPyB (https://esrf.fr/). Selecione a Experiência de preparar, encontrar o carregamento, selecione próximo e indicar a trajetória e a posição do disco em SC.</li>
	<li>Logar no software de controle de trajetória, aqui MXCuBE227,28 com o número experimental e a senha fornecidos a uma-forma.<ol>
<li>Pressione Sync para sincronizar o software de controle de trajetória com Banco de dados ISPyB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use o software de controle de trajetória, para montar o porta-amostras para o goniômetro. No MXCuBE2, clique uma posição na área de trocador de amostra e selecionar Amostra de montagem.</li>
	<li>Aproveitando o MK3 kappa mini goniômetro29 instalado no máximo da ESRF MX de Luz Síncroton, uso "realinhamento visual" fluxo de trabalho de30 do MXCuBE2 para alinhar o avião do porta-amostras com o eixo de rotação do goniômetro.<ol>
<li>Selecione o botão de Centro , centro 3 em seguida, clique no meio da borda da ponta do loop. Salve a posição centrada selecionando salvar.</li>
		<li>Clique novamente no botão Centro , centro 3 em seguida, clique no meio do início da haste do loop. Salve a segunda posição também clicando em salvar.</li>
		<li>Selecione um dos salvos centrado posições clicando nele.</li>
		<li>Sob avançado, adicione o fluxo de trabalho Visual reorientação para a fila de coleta de dados MxCuBE2.</li>
		<li>Inicie o fluxo de trabalho clicando em coletar fila.</li>
		<li>Depois que o fluxo de trabalho alinha o plano do porta-amostras com o eixo de rotação do goniômetro, centro do porta-amostras novamente, desta vez em algum lugar no meio da malha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oriente o porta-amostras de modo que a face da malha é perpendicular à direção do feixe de raios-x, girando o eixo ômega usando MXCuBE2.</li>
	<li>Em MXCuBE2, selecione o tamanho de feixe, necessário para a digitalização do porta-amostras (somente para Luz Síncroton, com tamanho variável de feixe).<ol>
<li>Clique em abertura menu drop-down do software de controle de trajetória e selecionar um valor, por exemplo, 10 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina uma malha para a verificação de malha.<ol>
<li>Clique no ícone de ferramenta malha em MXCuBE2. Aparecerá a janela de ferramenta de malha.</li>
		<li>Na exibição de amostra de MXCuBE2, desenhe a malha deixou clicando e arrastando o mouse sobre a área que contém cristais no porta-amostra.</li>
		<li>Para salvar a malha clique no botão Plus na janela de ferramenta de malha (engranzamento torna-se verde).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. preparar e executar o fluxo de trabalho MeshAndCollect
<ol><li>No campo de resolução de MXCuBE2, digite a resolução (d.min) no qual difração imagens deverão ser recolhidas, por exemplo, aqui 1,8 Å.</li>
	<li>Selecione MeshAndCollect na guia de coleta de dados avançado , adicioná-lo para a fila e clique em recolher a fila.</li>
	<li>Na janela de parâmetro que aparece, use os parâmetros padrão dependente de trajetória. No experimento aqui descrito padrões parâmetros são o tempo de exposição 0.037 s por ponto de exame de malha, 100% de transmissão (levando neste caso a 4 x 1011 ph/s), oscilação de 1 ° por linha de varredura de malha.</li>
	<li>Clique em Ccontinuar. Executa a verificação de malha e as imagens de difração, coletadas em cada ponto de grade são analisadas e classificadas de acordo com a força de difração com o software DOZOR1. Este processo é executado em segundo plano.</li>
	<li>Após a análise DOZOR um mapa de calor é gerado e a ordem para coletas de dados subsequentes parcial é atribuída automaticamente com base na força de difração (veja a Figura 1). Nota: Os resultados desta etapa também podem ser inspecionados em ISPyB. Para a coleção de conjuntos de dados parciais, que uma nova aba com configurações aparece no software de controle de trajetória, selecione valores adequados para a faixa de rotação (ou seja, 0,1 °), número de imagens (ou seja, 100), tempo de exposição, resolução, transmissão, inversa feixe etc idealmente a dose para cada Cunha a recolher deve estar abaixo do limite de Garman (30 MGy). O tempo de exposição aproximada por imagem é 0.037 s a 0,1 s em condições experimentais descritas.</li>
	<li>Clique em continuar para lançar as coleções de dados parciais.</li>
</ol>7. processamento de dados
Nota: Os conjuntos de dados parciais são integrados com um programa apropriado (XDS10). Por isso um script Python será usado que reconhece cada conjunto de dados individual, integra e certifica-se de que a indexação entre os diferentes conjuntos de dados parciais é consistente.
<ol><li>Abra a pasta que contém as imagens: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean.</li>
	<li>Faça uma cópia de segurança da subpasta processo que pode ser encontrada na pasta onde os conjuntos de dados parciais são coletados.<ol>
<li>No terminal Linux, use o comando cp-r process_backup de processo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Navegue para a pasta de processo e iniciar o script de processamento.<ol>
<li>No terminal Linux, digite o comando cd processo e tecle enter.</li>
		<li>Tipo procMultiCrystalData e tecle enter. Nota: O script irá pedir a um grupo de espaço e parâmetros de célula (esta informação é opcional), digite aqueles de acordo com as instruções. Depois de uma última confirmação do usuário, o script será executado automaticamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. fusão de conjuntos de dados
Nota: Depois de todos os conjuntos de dados parciais são integrados a melhor combinação deles são mescladas para produzir o conjunto de dados final para uso na determinação da estrutura e requinte. Diferentes objectivos deste processo de fusão podem ser obter total completude (altamente recomendado), multiplicidade de alta ou as melhores estatísticas de dados (alta < I/σ(I) >, R-fatores de baixas, etc.). Este último pode às vezes ser à custa de exaustividade e/ou multiplicidade então esta opção deve ser escolhida com cuidado.
<ol><li>Mescle os conjuntos de dados parciais, usando o programa ccCluster14. Ele usa análise de Cluster hierárquico (HCA) para determinar as combinações possíveis de conjuntos de dados parcial isomórfica ().<ol>
<li>Digite ccCluster no terminal Unix para abrir sua interface de usuário gráfica (GUI). Nota: O GUI ccCluster uma dendrograma é desenhada. Isto dá uma sugestão sobre qual parcial de conjuntos de dados podem ser melhor fundiu-se com base em isomorfismo entre eles.</li>
		<li>Clique em um nó que corresponde a um valor de cerca de 0,4 no eixo vertical. Geralmente, valores superiores incluirá dados mais parciais de moda mas leva a pior mesclando estatísticas como conjuntos de dados parciais será menos isomórfica.</li>
		<li>Clique em mesclar dados. O cluster selecionado será processado em segundo plano e as estatísticas se fundem estimadas aparecerá em uma nova aba no GUI. Este passo pode ser repetido para diferentes combinações de conjuntos de dados. Para uma boa combinação de conjuntos de dados parciais a integralidade deve ser próximo de 100%, o < I/σ(I) > valores elevados (10 ou superior na camada mais baixa resolução) e os valores de31 R-meas baixa (cerca de 5% na camada de baixa resolução).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para cada combinação selecionada, use o script de entrada gerado para mesclar os conjuntos de dados parciais, escolhidos em um arquivo único mtz (ou seja, sem sentido de32).</li>
	<li>Definitivamente de escala e mesclar os dados de intensidade neste arquivo usando um programa de escala (ou seja, sem rumo32) e, como com um arquivo originário de uma coleta de dados de cristal único, use a saída para posterior eliminação e estrutura solução33 .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeshAndCollect:+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines.">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Protection+of+Protein+Crystals+against+Radiation+Damage+in+Electron+and+X-Ray+Diffraction.">Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).</li><li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography.">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).</li><li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography:+the+first+five+years.">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).</li><li>Stellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+macromolecular+serial+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).</li><li>Coquelle, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-scanning+serial+protein+crystallography+using+micro-+and+nano-focused+synchrotron+beams.">Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).</li><li>Diederichs, K., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Synchrotron+X-Ray+Crystallography+(SSX).">Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX).</a> Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).</li><li>Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., B&#252;ldt, G., Gordeliy, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-Radiation-Induced+Changes+in+Bacteriorhodopsin+Structure.">X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (5), 813-825 (2011).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS+implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF.">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li><li>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+clustering+for+multiple-crystal+macromolecular+crystallography+experiments:+the+ccCluster+program.">Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844-1851 (2017).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+of+synchrotron+serial+crystallographic+data+by+a+genetic+algorithm.">Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).</li><li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography.">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength+mutations+and+posttranslational+autoxidation+of+green+fluorescent+protein.">Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12501-12504 (1994).</li><li>Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2:+Understanding+Structure-Function+Relationships+in+the+Aequorea+victoria+Green+Fluorescent+Protein.">Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein.</a> Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Lelimousin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Dynamics+in+ECFP+and+Cerulean+Control+Fluorescence+Quantum+Yield.">Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield.</a> Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).</li><li>Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromophore+Isomer+Stabilization+Is+Critical+to+the+Efficient+Fluorescence+of+Cyan+Fluorescent+Proteins.">Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins.</a> Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).</li><li>Rhodes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. , (2006).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Gabadinho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MxCuBE+a+synchrotron+beamline+control+environment+customized+for+macromolecular+crystallography+experiments.">MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).</li><li>De Santis, D., Leonard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notiziario+Neutroni+e+Luce+di+Sincrotrone.">Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone.</a> Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).</li><li>Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+mini-&#954;+goniometer+head+in+macromolecular+crystallography+diffraction+experiments.">The use of a mini-&#954; goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).</li><li>Evans, P. R., Murshudov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+are+my+data+and+what+is+the+resolution?.">How good are my data and what is the resolution?.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).</li><li>Taylor, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+phasing.">Introduction to phasing.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESRF+upgrade+programme+phase+II+(2015+-+2022).">ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022).</a> The orange book. , (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar

O sucesso de um experimento de MX geralmente depende da existência de relativamente grande, bem diffracting cristais. Para projetos onde a otimização dos chuveiros de cristal pequeno de cristais maiores falha, MeshAndCollect oferece a possibilidade de obter um conjunto de dados de difração completa para estrutura solução através da combinação isomórfica parciais de conjuntos de dados coletados de uma série de pequenos cristais. O método é compatível com o de luz síncroton síncrotron para MX, idealmente com um fluxo de fótons de alta e um diâmetro pequeno feixe, equipado com um dispositivo de Difratômetro de última geração e um detector de rápido-leitura. Em tal uma estação final, a parte de coleta de dados de tal experiência terá cerca de 20 minutos, dependendo do número parciais de conjuntos de dados a serem coletados e o número de cristal contendo os titulares de amostra a analisar.
O mais importante pré-requisito para o sucesso de um experimento de MeshAndCollect é a existência de um número suficiente (pelo menos 50, 100 idealmente) de diffracting posições no suporte da amostra. Da experiência, o tamanho mínimo dos cristais para ser analisado deve ser cerca de 5 µm em dimensão menor. O método é compatível com qualquer tipo de padrão compatível com cryo-resfriamento titulares da amostra com os melhores resultados alcançados usando malha as montagens que são rígidas e retas.
Na ESRF, MeshAndCollect é implementado de forma amigável em uma Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) de fluxo de trabalho30 disponível a partir do software de controle de trajetória de MXCuBE2. Uma grande vantagem do MeshAndCollect em comparação com outros métodos SX é que os dados coletados podem ser processados por programas padrão e automatizado dutos utilizados para o MX de cristal único.
Como mostra o nosso exemplo, MeshAndCollect é muito fácil de aplicar e leva a uma série de conjuntos de dados de difração parcial, geralmente coletadas de pequenos cristais, que podem ser mesclados para produzir um conjunto de dados completo para uso em solução de estrutura. Além disso, MeshAndCollect tem o potencial para abrir o espaço de amostragem de cristalografia de proteínas que fornece uma maneira de coletar dados utilizáveis de ensaios de cristalização, onde a última etapa de otimização, a produção de grandes cristais, for bem sucedida.
À luz dos desenvolvimentos atuais para fontes de raio-x mais brilhantes (por exemplo, fonte extremamente brilhante (EBS) projeto/ESRF35) é previsível que, devido a danos de radiação aumentada, o tipo de coleta de dados multi cristal facilitada por MeshAndCollect vai se tornar o método padrão de coleta de dados, em vez de uma exceção – como é actualmente o caso - no baseados em síncrotron MX de luz síncroton.

Macromolecular cristalografia de raios x (MX) é, de longe, o método mais utilizado para obter insights sobre resolução atômica as estruturas tridimensionais de macromoléculas biológicas. No entanto, um principais estrangulamentos é a exigência de cristais relativamente grandes, bem diffracting.
Muitas vezes e, em especial quando a cristalização de proteínas de membrana, apenas muito pequenos cristais de alguns mícrons na dimensão maior podem ser obtidos. Danos de radiação efeitos fixado a resolução de um dados de difração completa que pode ser coletado de um único micro cristal2e muitas vezes, é necessário melhorar a relação sinal / ruído e, portanto, dados definir a resolução, mesclando vários conjuntos de dados de difração parcial de cristais diferentes, mas isomórficos. O aumento na densidade de fluxo de feixes de raios-x em fontes síncrotron e em outros lugares (por exemplo, raios-x elétrons livres lasers (X-FELs)), significaram que os conjuntos de dados de difração parcial úteis podem ser coletados de cristais mesmo muito pequenos de biológicas macromoléculas. Isto, por sua vez, levou ao desenvolvimento de novas técnicas para a recolha e fusão parcial difração conjuntos de dados coletados de muitos cristais diferentes a fim de produzir um conjunto de dados completo para solução de estrutura. Tais técnicas são comumente referidas como serial cristalografia (SX)3,4,5,6,7,8. Um exemplo prototípico de SX é o uso de dispositivos de injector de introduzir um riacho estreito de chorume um cristal o feixe de raio-x3,4,5. Um padrão de difração é registrado toda vez que um cristal é exposto a raios-x, levando à coleção, de muitos milhares de cristais individuais, de 'ainda' imagens de difração, informação que é, então, fundiu-se para produzir um conjunto de dados completo. No entanto, uma desvantagem considerável deste tipo de coleta de dados serial é que o processamento de imagens estáticas pode ser problemático. A qualidade de dados é consideravelmente melhorada se cristais podem ser girados e/ou várias imagens de difração são recolhidas a partir do mesmo cristal durante experimentos de cristalografia série6.
MeshAndCollect1 foi desenvolvido com o objetivo de combinar SX com coleta de dados de rotação MX 'padrão' e permite, de forma automática, experimentadores para coletar os conjuntos de dados de difração parcial de numerosos cristais do mesmo destino macromolecular montado sobre os suportes de amostra iguais ou diferentes. Um conjunto de dados de difração completa é então obtido mesclando-se o mais isomórfica os parciais de conjuntos de dados coletados. MeshAndCollect é compatível com qualquer trajetória de raio-x do síncrotron de estado-da-arte para MX (idealmente uma instalação de dispositivo de inserção com um relativamente pequeno (20 µm ou menos) tamanho na posição de amostra do feixe). Além a compilação completas de conjuntos de dados de uma série de cristais pequenos, bem diffracting, o método também é muito apropriado para a avaliação inicial e experimental da qualidade difração de microcristais de e para o processamento de amostras opacas, por exemplo, no meso crescido microcristais de membrana proteínas9.
No início de um experimento de MeshAndCollect, as posições, em duas dimensões, de cada um dos muitos cristal contido em um suporte de amostra única são determinadas usando um exame de raio-x de baixa dose. As imagens de difração coletadas durante esta verificação são automaticamente analisadas pelo programa DOZOR1, que classifica as posições dos cristais no suporte da amostra de acordo com sua força de difração respectivos. Posições para a coleção de conjuntos de dados parciais são atribuídas automaticamente com base em um limite de resistência de difração e, na última etapa, pequenas cunhas de dados de difração, tipicamente de ± 5 ° de rotação, são coletadas de cada posição escolhida. A experiência demonstrou que esta gama de rotação fornece uma quantidade suficiente de reflexões por cristal para conjunto de dados parcial dimensionamento fins, enquanto ao mesmo tempo, reduzindo a centralização questões possíveis de cristal e a oportunidade de expor vários cristais em um particularmente cheio de suporte1. As cunhas de dados individuais de difração (conjuntos de dados parciais) são então processados ou manualmente ou usar o tratamento automatizado de dados gasodutos10,11,12,13. Para determinação da estrutura a jusante é então necessário encontrar a melhor combinação parciais de conjuntos de dados a ser mesclada14,15,16 , após o qual o conjunto de dados completo resultante pode ser tratado da mesma forma como uma proveniente de um experimento de cristal único.
Como um exemplo de MeshAndCollect, na prática, apresentamos aqui a solução da estrutura de cristal de Cerulean a proteína fluorescente ciano (PCP), usando um conjunto de dados de difração construído a partir da combinação parciais de conjuntos de dados coletados de uma série de microcristais montagem sobre o mesmo suporte de amostra. Cerúleo foi projetado da proteína fluorescente verde (GFP), da água-viva Aequorea victoria17, cujo cromóforo fluorescente autocatalytically é formado a partir da ciclização de três resíduos de aminoácidos consecutivos. Cerúleo é obtido a partir de GFP em mutação resíduos de primeiro e segundo o cromóforo, uma serina e uma tirosina, treonina (S65T) e triptofano (Y66W) respectivamente e adaptando o ambiente cromóforo com novas mutações (Y145A, N146I, H148D, M153T e V163A) para produzir um nível de fluorescência significativa, no entanto, de qualidade inferior de QY = 0.4918,19,20. As propriedades fluorescentes suboptimal de Cerulean têm sido propostas para ser ligada à dinâmica de proteína complexa envolvendo a imperfeita estabilização de uma das onze β-costas da proteína21 e para a acomodação de dois diferentes cromóforo isômeros, dependendo do pH e irradiação condições22. Optamos por trabalhar com Cerulean como uma proteína de modelo ilustrando o uso do protocolo de MeshAndCollect devido ao relativamente facilidade de ajuste de tamanho de cristal, dependendo a cristalização. A estrutura de Cerulean é muito semelhante ao que de sua proteína pai GFP, como é constituído de um β-barril formada de onze β-vertentes rodeia uma α-hélice, que ostenta o cromóforo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline</td>
			<td>ESRF ID 23-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization plates XDXm with sealant</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Life Technologies Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>10-110-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroMeshes 700/25</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU:&#160;M3-L18SP-25L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 10/300 -GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5174-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9201-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186&#8211;3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aimless</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204&#8211;1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ccCluster</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844&#8211;1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeshAndCollect workflow</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328&#8211;2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCuBE2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700&#8211;707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24&#8211;226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>Max-Planck-Institut f&#252;r Medizinische Forschung</td>
			<td>Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125&#8211;132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect

Cristalografia de raios x é a principal técnica usada para obter informações de alta resolução relativa as 3-dimensional estruturas de macromoléculas biológicas. Até recentemente, um requisito importante tem sido a disponibilidade de relativamente grande, bem diffracting cristais, que muitas vezes são difíceis de obter. No entanto, o advento da cristalografia serial e um renascimento em métodos de recolha de dados multi cristal significou que a disponibilidade de grandes cristais não precisa mais ser um fator limitante. Aqui, nós ilustram o uso do protocolo de MeshAndCollect automatizado, que primeiro identifica as posições de muitos cristais pequenos montados na mesma porta-amostras e então direciona a coleção de cristais de uma série de conjuntos de dados de difração parcial para fusão posterior e uso na determinação da estrutura. MeshAndCollect pode ser aplicado a qualquer tipo de microcristais, mesmo se diffracting fracamente. Como exemplo, apresentamos aqui o uso da técnica para resolver a estrutura de cristal de Cerulean a proteína fluorescente ciano (PCP).

MeshAndCollect, conforme implementado no MXCuBE2 (ver figura 1A), foi usado para a coleção de conjuntos de dados de difração parcial de pequenos cristais de Cerulean localizado na mesma porta-amostras em que a identificação visual dos cristais foi difícil. Para o porta-amostras de tela, desenhamos uma grade sobre o centro da meshloop (ver figura 1B) e baseia o DOZOR Pontuação calor mapear difração de parcial 85 (ver figuras 1, 1D), conjuntos de dados foram coletados automaticamente. Estas foram integradas individualmente, em seguida, mescladas (veja acima) para produzir um conjunto de dados com integridade de 99,8% dmin = 1.7Å (ver tabela 1). Meia-conjunto correlação (CC1/2)34 na camada de resolução mais alta foi de 60% (= 4.7). Como esperado, a estrutura de cristal de Cerulean poderia ser resolvida direta por substituição molecular33 usando o conjunto de dados gerado. Após o refinamento, obtivemos um Rtrabalhar de 22,8% e um Rlivre de 25,4%. Superposição com a estrutura previamente determinada (PDB entrada 2WSO21) mostra uma rmsd global Cα posições de 0.1 Å. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Estatísticas do conjunto de dados mesclado</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Limiar de clustering</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Número de conjuntos de dados parciais</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grupo de espaço</td>
			<td>P212121</td>
		</tr>
<tr>
<td>Célula unitária (a, b, c)</td>
			<td>50.98, 62.76, 69,50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gama de resolução</td>
			<td>46,58-1,70 (1.73-1.70)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmerge (todos eu + e -)</td>
			<td>0.133 (0.743)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (todos eu + & eu-)</td>
			<td>0,142 (0.813)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim (todos eu + & eu-)</td>
			<td>0,047 (0.318)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total de observações/exclusivo</td>
			<td>220693/25129</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mean((I)/SD(I))</td>
			<td>13,8 (4.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Correlação de metade-conjunto MN(I) CC(1/2)</td>
			<td>0.994 (0.602)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Completude</td>
			<td>99.8 (99,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multiplicidade</td>
			<td>8.8 (6.5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Final Rcryst
</td>
			<td>22,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Final Rgrátis
</td>
			<td>25.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Estatísticas do conjunto de dados resultante, indicando a alta qualidade dos dados coletados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58594/58594fig1.jpg"> Figura 1: usando MeshAndCollect para coletar uma série de conjuntos de dados parciais de uma série de pequenos cristais contidos no mesmo porta-amostra. A)-interface do usuário do MXCuBE2. O verde oval sobre o campo de visualizador no eixo indica a ferramenta grade. B) com isso uma grade é desenhada sobre a imagem do porta-amostras no campo de imagem de vida. Mapa C) calor das pontuações DOZOR. D) exemplo de uma imagem de difração. E) dendrograma após a análise de agrupamento hierárquico. Conjuntos de dados em vermelho foram usados para mesclar. F) estrutura total de Cerulean. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58594/58594fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect at JoVE.com

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Apresentamos o uso do protocolo de MeshAndCollect para obter um conjunto de dados de difração completa, para uso na determinação da estrutura subsequente, composto de difração parcial de conjuntos de dados coletados de muitos pequenos cristais de proteína fluorescente Azul cerúleo.

Solução de estrutura da proteína fluorescente Cerulean usando MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

O protocolo automatizado MeshAndCollect foi desenvolvido para combinar cristalografia serial com coleta de dados de rotação padrão para medir pequenos cristais de amostras de discos. O método identifica primeiro a posição dos cristais montados no mesmo suporte de amostra para, em seguida, direcionar a coleta de conjunto de dados parciais que será posteriormente mesclado e utilizado para a solução da estrutura. MeshAndCollect é convincente, pois permite que você faça experimentos rapidamente e com a mesma configuração, solução de estrutura, triagem de ligantes, e tudo isso com cristais minúsculos.O método é compatível com o VMX do feixe síncrotron idealmente equipado com alto fóton flex, um pequeno diâmetro de feixe e um detector de recarga rápida. Primeiro, conecte-se ao sistema de informações estendida para o banco de dados da linha de fundo de cristalografia de proteínas e escolha MX.Log in com o número do experimento e a senha do formulário A. Em seguida, selecione Adicionar novo e preencha as informações solicitadas.Selecione Adicionar parcial e preencha os dados relevantes. Selecione Adicionar recipiente, escolha um disco SC3 e preencha as informações necessárias, incluindo as posições dos titulares de amostra no disco. Na cabana experimental, carregue o disco no divisor de amostras e observe sua posição.Em seguida, faça login no sistema de informações para o banco de dados da linha de dados da linha de fundo de cristalografia de proteínas. Selecione Preparar experimento, encontrar o Envio, selecionar Próximo e indicar a posição de feixe e disco no trocador de amostras. Faça login no software de controle de linha de feixe com o número experimental e senha fornecidos no formulário A.Pressione o Sync para sincronizar o software de controle de feixe com o sistema de informações para o banco de dados da linha de fundo de cristalografia de proteínas. Use o software de controle de linha de vigas para montar o suporte de amostra no goniômetro. Em seguida, clique com o botão direito de clicar em uma posição na área do trocador de amostras e selecione Amostra de Montagem.Selecione o botão central e, em seguida, três cliques central no meio da borda da ponta do loop. Salve a posição centralada selecionando Salvar. Em Advanced, adicione a reorientação visual do fluxo de trabalho à fila de coleta de dados.Em seguida, inicie o fluxo de trabalho clicando em Coletar fila. Em seguida, selecione uma das posições de centro salvas clicando nela. Clique novamente no botão central e, em seguida, um centro de três cliques no meio do início da haste do loop.Salve a segunda posição clicando em Salvar. E, em seguida, clique em Continuar. Após o fluxo de trabalho alinhar o plano do suporte de amostra com o eixo de rotação do goniômetro, centralize novamente o suporte da amostra em algum lugar no meio da malha.Oriente o suporte amostral de modo que a face da malha seja perpendicular à direção do feixe de raios-X girando o eixo ômega usando o software de controle de linha de vigas. No software de controle de linha de feixe, clique no menu suspenso da abertura e selecione um valor. Em seguida, clique no ícone da ferramenta de malha para trazer a janela da ferramenta de malha.Na visão amostral do software de controle de linha de vigas, desenhe a malha clicando à esquerda e arrastando o mouse sobre a área que contém cristais no suporte da amostra. Para salvar a malha, clique no botão plus na janela da ferramenta de malha. No campo de resolução do software de controle de linha de luz, digite a resolução na qual as imagens de difração devem ser coletadas.Se não se sabe nenhuma informação prévia sobre a qualidade da difração dos cristais, recomenda-se um valor entre dois e 2,5. Selecione MeshAndCollect na guia de coleta de dados Avançado. Adicione-o à fila e clique em Coletar a Fila.Na janela do parâmetro, use os parâmetros padrão dependentes da linha de trave. No experimento descrito aqui, os parâmetros padrão são 0,037 segundo tempo de exposição por ponto de varredura de malha, transmissão de 100% e oscilação de um grau por linha de varredura de malha. Clique em Continuar.As varreduras de malha e as imagens de difração coletadas em cada ponto de grade são analisadas e classificadas de acordo com a força de difração com o software Dozer. Após a análise do Dozer, um mapa de calor é gerado e a ordem para coletas parciais subsequentes de dados é atribuída automaticamente com base na força de difração. Por fim, clique em Continuar para iniciar as coletas parciais de dados.O MeshAndCollect, implementado no MXCuBE, foi utilizado para a coleta de conjuntos de dados de difração parcial de pequenos cristais de Cerulean localizados no mesmo suporte de amostra em que a identificação visual dos cristais era difícil. Para testar o suporte da amostra, uma grade foi desenhada sobre o centro do loop de malha e, com base no mapa de calor de pontuação do Dozer, foram coletados automaticamente 85 conjuntos de dados de difração parcial. Estes foram integrados individualmente e fundidos para produzir um conjunto de dados com 99,8% de completude em uma resolução de 1,7 angstroms.Como esperado, a estrutura cristalina de Cerulean poderia ser resolvida por substituição molecular usando o conjunto de dados gerado. Após o refinamento, foram obtidos R trabalho de 22,8% e R livre de 25,4%. A super posição da estrutura previamente determinada mostra um RMSD global em posições c-alfa de 0,1 angstroms.Para projetos onde a otimização da fase de crescimento do cristal, o MeshAndCollect oferece a possibilidade de obter um conjunto completo de dados com base na combinação desses conjuntos de dados parciais amorfos obtidos a partir de cristais menores. Esta técnica abriu caminho para biólogos estruturais resolverem uma estrutura a partir de amostras de peças onde apenas alguns décimos de micro cristais não puderam ser produzidos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Investigando a Seqüência de Proteínas - Estrutura-dinâmica Relacionamentos com Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Purificação da afinidade do cloroplasto Translocon proteínas complexos usando a marca de torneira

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Estudos estruturais de macromoléculas em solução usando o pequeno ângulo de espalhamento de raios-x

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Localização de proteínas SUMO-modificadas usando proteínas de captura de sumo fluorescentes

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Avaliação da oxidação celular usando uma proteína fluorescente verde específica do compartimento subcelular

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...