Name: structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect
Uploaded: 2019-03-19T13:00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect at JoVE.com

Мы благодарим Европейский центр синхротронного излучения для предоставления луч времени через программу собственных исследований.

<ol>
	<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeshAndCollect:+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines.">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Protection+of+Protein+Crystals+against+Radiation+Damage+in+Electron+and+X-Ray+Diffraction.">Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).</li><li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography.">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).</li><li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography:+the+first+five+years.">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).</li><li>Stellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+macromolecular+serial+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).</li><li>Coquelle, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-scanning+serial+protein+crystallography+using+micro-+and+nano-focused+synchrotron+beams.">Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).</li><li>Diederichs, K., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Synchrotron+X-Ray+Crystallography+(SSX).">Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX).</a> Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).</li><li>Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., B&#252;ldt, G., Gordeliy, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-Radiation-Induced+Changes+in+Bacteriorhodopsin+Structure.">X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (5), 813-825 (2011).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS+implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF.">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li><li>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+clustering+for+multiple-crystal+macromolecular+crystallography+experiments:+the+ccCluster+program.">Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844-1851 (2017).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+of+synchrotron+serial+crystallographic+data+by+a+genetic+algorithm.">Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).</li><li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography.">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength+mutations+and+posttranslational+autoxidation+of+green+fluorescent+protein.">Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12501-12504 (1994).</li><li>Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2:+Understanding+Structure-Function+Relationships+in+the+Aequorea+victoria+Green+Fluorescent+Protein.">Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein.</a> Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Lelimousin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Dynamics+in+ECFP+and+Cerulean+Control+Fluorescence+Quantum+Yield.">Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield.</a> Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).</li><li>Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromophore+Isomer+Stabilization+Is+Critical+to+the+Efficient+Fluorescence+of+Cyan+Fluorescent+Proteins.">Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins.</a> Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).</li><li>Rhodes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. , (2006).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Gabadinho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MxCuBE+a+synchrotron+beamline+control+environment+customized+for+macromolecular+crystallography+experiments.">MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).</li><li>De Santis, D., Leonard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notiziario+Neutroni+e+Luce+di+Sincrotrone.">Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone.</a> Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).</li><li>Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+mini-&#954;+goniometer+head+in+macromolecular+crystallography+diffraction+experiments.">The use of a mini-&#954; goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).</li><li>Evans, P. R., Murshudov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+are+my+data+and+what+is+the+resolution?.">How good are my data and what is the resolution?.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).</li><li>Taylor, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+phasing.">Introduction to phasing.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESRF+upgrade+programme+phase+II+(2015+-+2022).">ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022).</a> The orange book. , (2015).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать

Успех эксперимента MX обычно зависит от наличия относительно большой, хорошо Дифрагирующая кристаллов. Для проектов, где не оптимизации от небольших кристалл души в более крупные кристаллы MeshAndCollect предоставляет возможность получения полной дифракции набора данных для структуры решения через сочетание Изоморфное частичных наборов данных, собранных из серии мелких кристаллов. Метод совместим с Синхротронное излучение для MX, идеально с высоким фотонного потока и маленький луч диаметром, оснащен устройством дифрактометр состояние искусства и быстро индикация детектор. На конечной станции часть сбора данных такого эксперимента займет около 20 минут, в зависимости от числа частичных наборов данных должны быть собраны и количество кристалл содержащих держатели образца для анализа.
Наиболее важной предпосылкой для успеха MeshAndCollect эксперимента является наличие достаточного числа (по крайней мере 50, 100 идеально) из Дифрагирующая позиции на держателя образца. Из опыта минимальный размер кристаллов для анализа должна быть около 5 мкм в наименьший размер. Метод совместим с любой стандартной крио охлаждение совместимый образец Держатели с наилучшие результаты достигаются с помощью сетки ездовых животных, которые являются жесткие и прямые.
В Европейский центр синхротронного излучения MeshAndCollect реализуется в удобной для пользователя форме в Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) рабочего процесса30 из программного обеспечения управления MXCuBE2 излучение. Основным преимуществом по сравнению с другими методами SX MeshAndCollect что собранные данные могут быть обработаны стандартных программ и автоматизированных трубопроводов для монокристаллов MX.
Как показывает наш пример, MeshAndCollect очень легко применять и приводит к серию частичную дифракции наборов данных, обычно собирают из маленькие кристаллы, которые могут быть объединены производить полный набор данных для использования в структуре решения. Кроме того MeshAndCollect имеет потенциал, чтобы открыть пространство выборки кристаллография протеина, как он предоставляет способ для сбора полезной данных от процессов кристаллизации где последний шаг оптимизации, производство крупных кристаллов, неудачной.
В свете текущих событий к ярче рентгеновских источников (например, чрезвычайно блестящей источник (EBS) проекта/ESRF35) можно предположить, что из-за повышенной радиации повреждения, типа мульти кристально данных коллекции способствует MeshAndCollect станет стандартным методом сбора данных, а не исключение – как в настоящее время в случае - на основе Синхротронное излучение MX.

Макромолекулярной кристаллографии рентгеновского снимка (MX) является, безусловно, наиболее используемый метод для получения атомной резолюции проницательность в трехмерной структуры биологических макромолекул. Однако основных узких мест является требованием для относительно большой, хорошо Дифрагирующая кристаллов.
Часто и особенно при кристаллизации мембранных белков, только очень маленькие кристаллы несколько микрон в крупнейших измерения могут быть получены. Излучения ущерб, который эффекты предел разрешение полного дифракции данных набора, могут быть собраны из монокристаллов микро2и очень часто, это необходимо улучшить соотношение сигнал-шум и следовательно данные резолюции, путем слияния нескольких частичные дифракции наборы данных из разных, но изоморфных кристаллов. Увеличение плотности потока рентгеновских лучей на источники синхротронного и в других местах (например свободных электронах рентгеновские лазеры (X-Фельс)), означает, что наборы данных полезно частичное дифракции может быть собрана из даже очень маленькие кристаллы биологических макромолекул. Это, в свою очередь, привело к разработке новых методов для сбора и объединения частичных дифракции наборов данных собранных из многих различных кристаллов для того чтобы произвести полный набор данных для структуры решения. Такие методы часто называются серийный кристаллографии (SX)3,4,5,6,,78. Прототипом примером SX является использование устройств инжектор ввести узкий поток пульпы кристалл в рентгеновского луча3,4,5. Дифракционный рисунок регистрируется каждый раз, когда кристалл подвергается рентгеновских лучей, ведущих к коллекции, из многих тысяч отдельных кристаллов, «еще» дифракционного изображения, информация, которая затем объединяются для получения полного набора данных. Однако значительный недостаток этого типа коллекции последовательных данных является, что обработка неподвижных изображений может быть проблематичным. Значительно улучшено качество данных Если кристаллы можно вращать и/или несколько дифракции изображений собраны из же кристалл во время последовательного кристаллографии эксперименты6.
MeshAndCollect1 был разработан с целью объединения SX с «стандарт» MX вращение сбора данных и позволяет, в автоматической моды, экспериментаторов собирать наборы данных частично дифракции от многочисленных кристаллы же макромолекулярных целевого монтируется на одинаковые или разные держатели. Затем набор данных полный дифракции получается путем слияния наиболее Изоморфное частичных наборов данных, собранных. MeshAndCollect совместим с рентгеновское излучение любой-искусство синхротронного MX для (идеально объекта вставки устройства с относительно небольшим (20 мкм или менее) пучка размер позиции образца). Помимо компиляции полные наборы данных из ряда небольших, хорошо Дифрагирующая кристаллов метод также очень подходит для первоначальной экспериментальной оценки дифракционного качества микро-кристаллов и для обработки непрозрачными образцами, например, в мезо выросли микрокристаллов мембранных белков9.
В начале эксперимента MeshAndCollect позиции, в двух измерениях, каждого из многих кристалла, содержащихся в держатель единого образца определяется с помощью низкой дозы рентгеновского сканирования. Дифракционные изображения, собранные в ходе этой проверки автоматически анализируются программой дозор1, которая сортирует позиции кристаллов на держателя образца согласно их соответствующих дифракции прочность. Позиции для коллекции частичных наборов данных назначаются автоматически на основе отключения прочность дифракции и, в последнем шаге, небольшие клинья дифракции данных, обычно ±5 ° вращения, собраны из каждой выбранной позиции. Опыт показал, что этот диапазон вращения обеспечивает достаточное количество отражений на кристалл для частичного набора данных, масштабирование целей, хотя в то же время сокращение возможных кристалл центрирования вопросы и вероятность разоблачения несколько кристаллов в особенно тесно поддержка1. Клинья данных отдельных дифракции (частичное наборы данных), затем обрабатываются либо вручную или с помощью автоматизированной обработки данных трубопроводов10,11,12,13. Для определения нижнего течения структуры необходимо затем найти наилучшее сочетание частичных наборов данных для слияния в14,,1516 после чего полный результирующий набор данных может рассматриваться таким же образом как один из одного кристалла эксперимент.
В качестве примера MeshAndCollect на практике мы представляем здесь решение кристаллической структуре Лазурный голубой флуоресцентный белок (СПФ), с использованием набора данных дифракции, построенных из комбинации частичных наборов данных, собранных из серии микрокристаллы монтируется на такую же поддержку образца. Лазурный был инженерии от Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) от медузы Aequorea victoria17, чьи хромофора флуоресцентного autocatalytically формируется из циклизация трех последовательных аминокислотных остатков. Лазурный получается из GFP мутирует соответственно первый и второй остатки хромофора, серина и тирозина, треонин (S65T) и триптофан (Y66W) и адаптации среды хромофора с далее мутации (Y145A, N146I, H148D, M153T и V163A) производить значительные, но неоптимальный флуоресценции уровень QY = 0,4918,19,20. Неоптимальный флуоресцентные свойства Cerulean было предложено быть связаны с динамика сложных белков, с участием несовершенной стабилизации одного из одиннадцати β-нити белка21 и размещение двух различных хромофора изомеров в зависимости от рН и облучения условий22. Мы решили работать с Cerulean как модель белка, иллюстрирующие использование протокола MeshAndCollect из-за относительно простота настройки размер кристалла в зависимости от кристаллизации. В структуре Cerulean очень похож на что его родительского белка GFP, как он состоит из β-баррель формируется из одиннадцати β-нити вокруг α-спирали, которая несет хромофора.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline</td>
			<td>ESRF ID 23-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization plates XDXm with sealant</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Life Technologies Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>10-110-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroMeshes 700/25</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU:&#160;M3-L18SP-25L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 10/300 -GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5174-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9201-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186&#8211;3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aimless</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204&#8211;1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ccCluster</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844&#8211;1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeshAndCollect workflow</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328&#8211;2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCuBE2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700&#8211;707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24&#8211;226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>Max-Planck-Institut f&#252;r Medizinische Forschung</td>
			<td>Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125&#8211;132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect

Рентгеноструктурного анализа является основной метод, используемый для получения высокого разрешения информацию о 3-мерной структуры биологических макромолекул. До недавнего времени, одним из основных требований было наличие относительно большой, хорошо Дифрагирующая кристаллы, которые зачастую сложно получить. Однако появление серийный кристаллографии и возрождения в методах сбора данных несколькими кристально означает, что наличие крупных кристаллов больше не нужно быть ограничивающим фактором. Здесь мы иллюстрируют использование автоматизированных MeshAndCollect протокол, который сначала определяет позиции многих мелких кристаллов, установлен на том же держатель образца, а затем направляет коллекции из кристаллов из ряда частичных дифракции наборов данных для последующего слияния и использование в определении структуры. MeshAndCollect может применяться к любому типу микро кристаллы, даже если слабо Дифрагирующая. В качестве примера мы представляем здесь использование техники для решения Кристаллическая структура Лазурный голубой флуоресцентный белок (СПФ).

MeshAndCollect, как это реализовано в MXCuBE2 (см. рис. 1а), была использована для коллекции наборов данных частично дифракции от мелких кристаллов Cerulean расположен на же держатель образца, в котором визуальной идентификации кристаллов было трудно. Для держателя образца, мы обратили сетки над центром meshloop (см. рис. 1B) и на основании дозор Оценка тепла карта 85 частичной дифракции (см. цифры 1 c, 1 D) наборы данных автоматически были собраны. Эти индивидуально были интегрированы, то слияние (см. выше) для получения набора данных с 99,8% полноты в dмин = 1.7Å (см. таблицу 1). Половина набор корреляции (1/2CC)34 в оболочке высокой резолюции было 60% (= 4,7). Как и ожидалось, Кристаллическая структура Cerulean может быть прямолинейно решена путем молекулярной замена33 с помощью созданного набора данных. После уточнения мы получили Rработать 22,8% и Rбесплатно 25,4%. Суперпозиция с ранее определяется структурой (PDB 2WSO запись21) показывает глобальные rmsd на позицииα C 0,1 Å. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Статистика объединенного набора данных</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Кластеризация порог</td>
			<td>0,35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Количество частичных наборов данных</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Пространственная группа</td>
			<td>P212121</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ячейки (a, b, c)</td>
			<td>50.98, 62.76, 69.50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Резолюция диапазон</td>
			<td>46.58-1.70 (1,73-1,70)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmerge (все я + и -)</td>
			<td>0.133 (0,743)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (все я + & I-)</td>
			<td>0,142 (0.813)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim (все я + & I-)</td>
			<td>0.047 (0.318)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Замечания общего/уникальный</td>
			<td>220693/25129</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mean((I)/SD(I))</td>
			<td>13,8 (4,7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MN(I) половину набор корреляции CC(1/2)</td>
			<td>0.994 (0.602)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Полнота</td>
			<td>99,8 (99,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Кратность</td>
			<td>8.8 (6.5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Окончательный Rвече
</td>
			<td>22.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Окончательный Rбесплатно
</td>
			<td>25,4</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Сбор статистики объединенный набор данных, указывающий высокое качество данных.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58594/58594fig1.jpg"> Рисунок 1: использование MeshAndCollect для сбора ряда частичных наборов данных от ряда мелких кристаллов, содержащихся в том же держатель образца. A)-интерфейс MXCuBE2. Зеленый овал над полем на оси просмотра указывает инструмент «сетка». B) с ним сетка рисуется образ держатель образца в поле образ жизни. C) тепла карта дозор баллов. D) пример дифракционного изображения. E) дендрограмма после иерархический кластерный анализ. Наборы данных в красном были использованы для слияния. F) общая структура Cerulean. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58594/58594fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect at JoVE.com

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Мы представляем использование протокола MeshAndCollect, чтобы получить набор данных полный дифракции, для использования в определении последующих структуры, состоящий из частичного дифракции наборов данных, собранных от многих мелких кристаллов флуоресцентный белок Cerulean.

Структура решения Cerulean флуоресцентный белок, используя MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Автоматизированный протокол MeshAndCollect был разработан для объединения серийной кристаллографии со стандартным сбором данных вращения для измерения малых кристаллов из образцов шайбы. Метод сначала определяет положение кристаллов, установленных на том же держателе образца, чтобы затем направить сбор частичного набора данных, который впоследствии будет объединен и использован для решения структуры. MeshAndCollect является убедительным, как это позволяет делать эксперименты быстро и с той же установки, структура решения, лиганд скрининга, и все, что с крошечными кристаллами.Метод совместим с VMX синхротронной балки, идеально оснащенной высоким фотоном flex, диаметром небольшого луча и детектором быстрой перезагрузки. Во-первых, подключись к расширенной информационной системе базы данных белковой кристаллографии лучевой линии и выберите MX.Log с номером эксперимента и паролем из формы А. Далее выберите Shipment Add New и заполните запрашиваемую информацию.Выберите Добавить Частично и заполнить соответствующие данные. Выберите Add Container, выберите шайбу SC3 и заполните требуемую информацию, включая позиции держателей образца в шайбе. В экспериментальной загоне загрузите шайбу в пробу сменщика и обратите внимание на ее положение.Затем войдите в информационную систему базы данных белковой кристаллографии. Выберите «Подготовьй эксперимент», найдите отгрузку, выберите Next и укажите положение луча и шайбы в смене образца. Войдите в программное обеспечение управления лучом с экспериментальным номером и паролем, предоставленным на форме A.Нажмите sync для синхронизации программного обеспечения управления лучом с информационной системой для базы данных белковой кристаллографии лучевой линии. Используйте программное обеспечение для управления лучом, чтобы смонтировать держатель образца на гониометр. Затем нажмите правой кнопкой мыши в области смены выборки и выберите образец горы.Выберите центральную кнопку, а затем три клика по центру посередине края кончика петли. Сохраните центрированную позицию, выбрав Save. В рамках Advanced добавьте визуальную переориентацию рабочего процесса в очередь сбора данных.Затем запустите рабочий процесс, нажав на коллекционные очереди. Далее выберите одну из сохраненных центральных позиций, нажав на нее. Нажмите еще раз на центральную кнопку, а затем три клика центр в середине начала ствола цикла.Сохраните вторую позицию, нажав на Save. А затем нажмите на Продолжить. После того, как рабочий процесс выравнивает плоскость держателя образца с оси вращения гониометра, центр держатель образца снова где-то в середине сетки.Ориентируйте держатель образца так, чтобы лицо сетки перпендикулярно направлению рентгеновского луча, вращая ось омега с помощью программного обеспечения управления лучом. В программном обеспечении управления лучом нажмите на меню высадки диафрагмы и выберите значение. Затем нажмите на значок инструмента сетки, чтобы принести вверх окно инструмента сетки.В примере программного обеспечения управления лучом нарисуйте сетку левым нажатием и перетаскиванием мыши по области, содержащей кристаллы на держателе образца. Чтобы сохранить сетку, нажмите на кнопку плюс в окне инструмента сетки. В поле разрешения программного обеспечения управления лучевой линией введите разрешение, в котором должны быть собраны изображения дифракции.Если не известно никакой предварительной информации о качестве дифракции кристаллов, рекомендуется значение от двух до 2,5. Выберите MeshAndCollect во вкладке Расширенный сбор данных. Добавьте его в очередь и нажмите Соберите очередь.В окне параметра используйте зависящие от луча параметры по умолчанию. В эксперименте, описанном здесь, параметры по умолчанию 0,037 секунд времени экспозиции на точку сканирования сетки, 100% передачи, и один градус колебаний на линию сканирования сетки. Нажмите Продолжить.Сканирование сетки работает и дифракционные изображения, собранные в каждой точке сетки анализируются и ранжируются в соответствии с силой дифракции с программным обеспечением Dozer. После анализа Dozer генерируется тепловая карта и автоматически назначается порядок последующих частичных сборов данных на основе силы дифракции. Наконец, нажмите Продолжить запуск частичного сбора данных.MeshAndCollect, реализованный в MXCuBE, использовался для сбора частичных наборов данных дифракции из небольших кристаллов Cerulean, расположенных на том же держателе образца, в котором визуальная идентификация кристаллов была затруднена. Для проверки держателя выборки сетка была нарисована над центром цикла сетки, и на основе тепловой карты Dozer было автоматически собрано 85 наборов данных частичной дифракции. Они были индивидуально интегрированы, а затем объединены для получения набора данных с 99,8%полнотой при разрешении 1,7 ангстремов.Как и ожидалось, кристаллическая структура Cerulean может быть решена путем молекулярной замены с помощью набора данных, генерируемых. После уточнения, R работы 22,8% и R бесплатно 25,4%были получены. Супер положение ранее определяемой структуры показывает глобальный RMSD на c-альфа позиции 0,1 ангстремов.Для проектов, где оптимизация фазы роста кристалла, MeshAndCollect предоставляет возможность получить полный набор данных на основе комбинации этих аморфных частичных наборов данных, полученных из небольших кристаллов. Этот метод проложил путь для структурных биологов, чтобы решить структуру из частей образца, где только несколько десятых микро кристаллов не могут быть произведены.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Исследование последовательности протеинов-структуры-динамики Отношения с Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Очищение сродства хлоропласта Translocon белковых комплексов с помощью тега крана

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Структурные исследования макромолекул в решения с помощью небольшой угол рентгеновского рассеяния

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Проверка структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии изображений

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Локализация сумо-модифицированных белков с использованием флуоресцентного сумо-улавливания белков

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Оценка клеточного окисления с помощью подклеточного сулярного редокса-чувствительного зеленого флуоресцентного белка

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...