Name: structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect
Uploaded: 2019-03-19T13:00:00
Duration: 6 min 42 s
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Agradecemos el ESRF para proporcionar tiempo de rayo a través de su programa de investigación.

1. expresión y purificación de Cerulean
Nota: Esto se basa en el protocolo publicado por Lelimousin et al. 21
<ol><li>Expresar su etiquetado Cerulean en Escherichia coli BL21 las células cultivadas a 37 º C en 4 L de auto medio inducible23 hasta OD600= 1 y luego incubar durante una noche a 27 º C.</li>
	<li>Cosecha de las células bacterianas a 5.000 x g y lyse la células mediante sonicación (40%, 5 min, pulso s 10, 10 pausa s) en 200 mL de tampón de 20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl y 1 x inhibidores de la proteasa libre de EDTA.</li>
	<li>Carga el sobrenadante en una columna de su trampa Ni-NTA y eluir Cerulean con imidazol de 100 mM en las mismas condiciones de buffer.</li>
	<li>Las fracciones de color amarillo brillantes de la piscina. La proteína es intrínsecamente coloreada, por lo tanto son fácilmente distinguibles las fracciones que contienen cerúleo.</li>
	<li>Purificar la proteína (4 mL) en una columna de S75 en 20 mM Tris de pH 8,0.</li>
	<li>Las fracciones amarillo brillantes de la piscina y concentrar la solución 15 mg/mL de proteína.</li>
</ol>2. cristalización
<ol><li>Uso de la gota colgante difusión técnica24 a 20 ° C en placas Linbro de vapor. Llenar los pozos con 1 mL de una solución precipitante de 100 mM HEPES pH 6.75, 12% PEG8000 y 100 mM MgCl2. Para las gotas colgantes, mezcle 1 μl de proteína concentrada a 15 mg/mL con 1 μl de la solución precipitante. Cristales deben aparecer en 24 h.</li>
	<li>Los cristales obtenidos de la cosecha y traslado a 100 μl de un buffer de siembra compuesto por 0.1 M pH HEPES 6.75, 22% PEG 8000.</li>
	<li>Moler los cristales con un triturador de tejidos de 0,1 mL y diluir en el sembrador de búfer (proporción 1: 100).</li>
	<li>Digerir una alícuota de la solución madre de proteínas (15 mg/mL) con tripsina (0.5 mg/mL en el mismo buffer) para 1 h (1:10 (v/v)).</li>
	<li>Mezcle la solución de proteína digerida con 10% de semillas que contiene tampón (v/v).</li>
	<li>Crecer cristales (10 * 10 * 20 μm3) 0.1 M pH de HEPES 7, 14% PEG 8000, 0.1 MgCl2 en colgante de 1-1.5 μL gotas utilizando el método de difusión de vapor.</li>
</ol>3. cristal montaje
<ol><li>Utilizar un bucle adecuado, por ejemplo, un agujeros cuadrados lazo 700 malla de 25 μm montado en una columna muestra patrón titular25. Transferencia de cristales de la gota de cristalización (paso 2.6) en 1 μl de solución de crioprotector (la solución precipitante bien mezclada con glicerol (20% v/v final)).</li>
	<li>Montar la mezcla de cristal de la proteína en un bucle de acoplamiento moviendo el bucle bajo los cristales y elevación de la gota. Idealmente los cristales deben estar en el rango de tamaño de 5 μm, 30 μm en dimensión máxima ningún traslapo entre cristales montados en el circuito.</li>
	<li>Tocando el Monte rápidamente con papel de filtro del fieltro de exceso de líquido. Sedimentos los cristales para que se sientan en el plano del bucle rodeado por líquido de bulto tan poco como sea posible.</li>
	<li>Hunda el Monte en un unipuck lleno de nitrógeno líquido. Tienda el duende malicioso en 100 K en un recipiente adecuado hasta que el tiempo de la viga está disponible.</li>
</ol>4. línea preparación del experimento de sincrotrón
Nota: Solicitar tiempo de viga sincrotrón tan pronto como sea posible y seguir las instrucciones en línea para los tipos de acceso disponibles y sobre cómo presentar una solicitud de un sincrotrón dado. Las directrices ESRF pueden encontrarse en http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. Si un miembro de un grupo de asignación de bloque ESRF (bolsa), una aplicación para cada proyecto específico no es necesaria. En este caso experimentadores deberían dirigirse a su responsable de bolsa con respecto a la programación de tiempo de la viga.
<ol><li>Después de que la propuesta es aceptada y se recibe una invitación para el experimento, que todos los participantes complete entrenamiento de seguridad. Rellene la "uno-forma" (vía el portal de usuario ESRF, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) con la información de seguridad requerida en las muestras. Póngase en contacto con la persona de contacto local para discutir la experiencia. Una vez la forma proporcionada y validada le dará el número de experimento y la contraseña.</li>
	<li>Conéctese a extendido ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) y elegir MX.</li>
	<li>Inicie sesión con el número de experimento y la contraseña de la forma.</li>
	<li>Seleccione envío | Agregar nuevo y rellene la información solicitada.</li>
	<li>Seleccione Añadir parcela y rellenar los datos pertinentes. Seleccione Agregar contenedor, elegir un unipuck y rellene la información requerida, incluyendo las posiciones de los portamuestras en el disco.</li>
</ol>5. carga de la muestra en una línea de
<ol><li>En la unidad experimental de estantes, cargar el disco en el cambiador de muestras (SC) dewar y tome nota de su posición.</li>
	<li>Dispositivo de seguridad la cabina experimental y entrar en el aparador de control.</li>
	<li>Inicie sesión el ISPyB (https://esrf.fr/). Seleccione Preparar experimento, encontrar el envío, seleccione siguiente e indican la línea y la posición de puck en la SC.</li>
	<li>Sesión en el software de control de línea, aquí MXCuBE227,28 con el número experimental y la contraseña proporcionados en la forma.<ol>
<li>Pulse Sync para sincronizar el software de control de línea con la base de datos de ISPyB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilice el software de control de línea, para montar el soporte de la muestra en el goniómetro. En MXCuBE2, haga clic derecho en una posición en la zona de cambiador de muestra y seleccionar Muestra de montaje.</li>
	<li>Aprovechando el MK3 mini kappa goniómetro29 instalado en la mayoría de las líneas del ESRF MX, uso "visual realineación" flujo de trabajo30 de MXCuBE2 para alinear el plano de lo portamuestras con el eje de rotación del goniómetro.<ol>
<li>Seleccione el botón del Centro , luego 3 y haga clic en centro en el centro del borde de la punta del lazo. Guardar la posición centrada seleccionando Guardar.</li>
		<li>Vuelva a hacer clic en el botón central , luego 3 y haga clic en centro medio del inicio de la potencia del lazo. Guardar la segunda posición también haciendo clic en Guardar.</li>
		<li>Seleccione una de las posiciones centradas guardadas haciendo clic en él.</li>
		<li>En avanzado, añadir el flujo de trabajo Visual reorientación a la cola de colección de datos de MxCuBE2.</li>
		<li>Iniciar el flujo de trabajo haciendo clic en recoger la cola.</li>
		<li>Después de que el flujo de trabajo alinea el plano de lo portamuestras con el eje de rotación del goniómetro, centro el portamuestras nuevamente, esta vez en algún lugar en medio de la malla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oriente el sostenedor de la muestra para que la cara de la malla es perpendicular a la dirección del haz de rayos x girando el eje omega utilizando MXCuBE2.</li>
	<li>En MXCuBE2, seleccione el tamaño de la viga necesario para la exploración de lo portamuestras (sólo para líneas con tamaño variable de la viga).<ol>
<li>Haga clic en el desplegable de apertura de menú en el software de control de línea y seleccione un valor de, por ejemplo, 10 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definir una malla para el análisis de la malla.<ol>
<li>Haga clic en el icono de la herramienta malla en MXCuBE2. Aparecerá la ventana de la herramienta de malla.</li>
		<li>En la vista de la muestra de MXCuBE2, dibujar la malla click izquierdo y arrastrando el ratón sobre el área que contiene cristales en el portamuestras.</li>
		<li>Para guardar la malla haga clic en el botón Plus en la ventana de la herramienta de malla (malla se convierte en verde).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. preparar y ejecutar el flujo de trabajo de MeshAndCollect
<ol><li>En el campo de resolución de MXCuBE2, introduzca la resolución (dmin) en que difracción deben recoger imágenes, por ejemplo, aquí 1.8 Å.</li>
	<li>Seleccione MeshAndCollect en la ficha de recogida de datos avanzado , añadir a la cola y haga clic en recoger la cola.</li>
	<li>En la ventana de parámetro que aparece, utilice los parámetros de línea predeterminado dependiente. En el experimento descrito aquí valores predeterminados de parámetros son el tiempo de exposición de 0.037 s por punto de análisis de malla, 100% de transmisión (hacia en este caso 4 x 1011 ph/s), oscilación de 1 ° por acoplamiento de línea de exploración.</li>
	<li>Haga clic en Continuar. La exploración del acoplamiento funciona y las imágenes de difracción recogidas en cada punto de la red son analizadas y clasificadas según la fuerza de difracción con el software DOZOR1. Este proceso se ejecuta en segundo plano.</li>
	<li>Después del análisis DOZOR se genera un mapa de calor y el orden para las colecciones de datos parciales subsecuentes se asigna automáticamente en base a fuerza de difracción (ver figura 1). Nota: Los resultados de este paso también pueden ser examinados en ISPyB. Para la recolección parciales de conjuntos de datos que aparece una nueva pestaña con la configuración en el software de control de línea, seleccionar valores adecuados para la gama de la rotación (es decir, 0,1 °), número de imágenes (es decir, 100), tiempo de exposición, resolución, transmisión, Haz inversa etc. idealmente debería ser la dosis para cada cuña ser recogidos por debajo del límite de Garman (30 MGy). El tiempo de exposición aproximado por imagen es 0,037 s en 0,1 s en las condiciones experimentales descritas.</li>
	<li>Haga clic en continuar para lanzar las colecciones de datos parciales.</li>
</ol>7. procesamiento de datos
Nota: Los conjuntos de datos parciales se integran con un programa adecuado (XDS10). Para esto un script de Python se utilizará que reconoce cada conjunto de datos individual, integra y que indexación entre los diferentes conjuntos de datos parciales es constante.
<ol><li>Abra la carpeta que contiene las imágenes: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean.</li>
	<li>Hacer una copia de seguridad de la subcarpeta de proceso que puede encontrarse en la carpeta donde se recogen los conjuntos de datos parciales.<ol>
<li>En el terminal de Linux, utilice el comando cp – r proceso process_backup.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desplácese a la carpeta de proceso y lanzar el script de procesamiento.<ol>
<li>En el terminal de Linux, escribe el comando cd proceso y presiona enter.</li>
		<li>Tipo procMultiCrystalData y pulse Intro. Nota: El script pedirá un grupo de espacio y entrar en parámetros de la celda (esta información es opcional), ésos según las instrucciones. Después de una última confirmación de usuario, el script se ejecutará automáticamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Unión de conjuntos de datos
Nota: Después de todos los conjuntos de datos parciales se integran la mejor combinación de ellos se combinan para producir el conjunto final de datos para su uso en la determinación de la estructura y refinamiento. Diferentes objetivos de este proceso de fusión pueden ser para obtener integridad completa (muy recomendada), alta multiplicidad o las mejores estadísticas de datos (alta < I/σ(I) >, bajo factores de R, etc.). Este último puede ser a veces a expensas de la integridad y multiplicidad para que esta opción debe elegirse con cuidado.
<ol><li>Combinar los conjuntos parciales de datos utilizando el programa ccCluster14. Utiliza análisis de Cluster jerárquico (HCA) para determinar las combinaciones posibles de (isomorfas parcial conjuntos de datos).<ol>
<li>Escriba ccCluster en el terminal de Unix para abrir su interfaz gráfica de usuario (GUI). Nota: En la GUI de ccCluster se dibuja un dendrograma. Esto da una sugerencia en cuanto a que podría combinarán mejor parciales conjuntos de datos basada en el isomorfismo entre ellos.</li>
		<li>Haga clic en un nodo que corresponde a un valor de aproximadamente 0,4 en el eje vertical. Generalmente, los valores más altos incluirá datos más parciales conjuntos pero llevan a la peor combinación de estadísticas como conjuntos de datos parciales será menos isomórfica.</li>
		<li>Haga clic en combinar datos. Lo cluster seleccionado se tramitarán en el fondo y las estadísticas fusión estimadas aparecerán en una nueva pestaña en la interfaz gráfica. Este paso puede repetirse para diferentes combinaciones de conjuntos de datos. Para una buena combinación parciales de conjuntos de datos la integridad debe ser cercana al 100%, < I/σ(I) > valores altos (10 o más alto en la cáscara de resolución más baja) y los valores de R-meas31 bajo (alrededor del 5% en la cáscara de baja resolución).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para cada combinación seleccionado utilice el script de entrada generado para combinar los conjuntos de datos parciales, elegidos en un archivo único mtz (es decir, 32).</li>
	<li>Definitivamente la escala y combinar los datos de intensidad en este archivo usando un programa de escalado (es decir, sin rumbo32) y, como con un archivo que se origina de una colección de datos de solo cristal, utilizar la salida para posterior eliminación y solución de la estructura33 .</li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+phasing.">Introduction to phasing.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESRF+upgrade+programme+phase+II+(2015+-+2022).">ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022).</a> The orange book. , (2015).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar

El éxito de un experimento de MX depende generalmente de la existencia de relativamente grandes, bien diffracting cristales. Proyectos donde falla optimización de duchas de cristal a los cristales más grandes, MeshAndCollect ofrece una posibilidad de obtener un conjunto de datos de difracción completa para la solución de estructura mediante la combinación isomórfica parciales de conjuntos de datos recogidos de una serie de pequeños cristales. El método es compatible con beamlines del sincrotrón para MX, idealmente con un flujo de fotones alta y un pequeño haz de diámetro, equipado con un dispositivo de difractómetro de vanguardia y un detector de la rápido-lectura. Tal una estación final, la parte de la colección de datos de tal experimento tendrá unos 20 minutos, dependiendo el número parciales de conjuntos de datos a ser recogidos y el número de titulares de muestra que contiene el cristal a analizar.
El requisito más importante para el éxito de un experimento de MeshAndCollect es la existencia de un número suficiente (menos de 50, 100 idealmente) de diffracting posiciones en el portamuestras. De la experiencia, el tamaño mínimo de los cristales que se analizará debe ser aproximadamente 5 μm en la dimensión más pequeña. El método es compatible con cualquier tipo de estándar compatible con refrigeración cRIO los titulares de la muestra con los mejores resultados se consigue utilizando malla de monturas que son rígidas y rectas.
En el ESRF, MeshAndCollect se implementa de una manera fácil de usar en un pasarela (http://isencia.be/passerelle-edm-en) flujo de trabajo de30 en el software de control de línea de MXCuBE2. Una ventaja importante de MeshAndCollect en comparación con otros métodos SX es que los datos recogidos pueden ser procesados por programas estándar y automatizado de tuberías utilizadas para monocristal MX.
Como se muestra en nuestro ejemplo, MeshAndCollect es muy fácil de aplicar y conduce a una serie de conjuntos de datos de difracción parcial, generalmente recogidas de pequeños cristales, que pueden combinarse para producir un conjunto completo de datos para su uso en la solución de la estructura. Además, MeshAndCollect tiene el potencial para abrir el espacio de muestreo de Cristalografía de proteínas ya que proporciona una manera de recoger datos útiles de ensayos de cristalización donde el último paso de la optimización, la producción de cristales grandes, no tiene éxito.
A la luz de la actual evolución hacia fuentes de rayos x más brillantes (por ejemplo, extremadamente brillante fuente (EBS) proyecto/ESRF35) es previsible que debido a daño de la radiación creciente, el tipo de recogida de datos múltiples cristal facilitó por MeshAndCollect se convertirá en el método estándar de recolección de datos, en lugar de una excepción – como es el caso - a base de sincrotrón MX líneas.

Macromoleculares Cristalografía de rayos x (MX) es, de lejos, el método más utilizado para aumentar la comprensión de la resolución atómica en las estructuras tridimensionales de macromoléculas biológicas. Sin embargo, un cuello de botella importante es el requisito para cristales relativamente grandes, bien diffracting.
A menudo y particularmente cuando la cristalización de proteínas de la membrana, pueden obtenerse sólo muy pequeños cristales de pocos micrones en la dimensión más grande. Daño de la radiación efectos límite la resolución de datos de difracción completos se puede recoger de un solo cristal micro2y muy a menudo, es necesario mejorar la relación señal a ruido y por lo tanto, datos de resolución, por la fusión de varios conjuntos de datos de difracción parcial de cristales diferentes, pero isomorfos. Los aumentos en densidad del flujo de haces de rayos x en las fuentes del sincrotrón y en otros lugares (por ejemplo, electrones libres de rayos x láser (X-FELs)), han significado que los conjuntos de datos útiles difracción parcial se pueden recoger en incluso pequeños cristales de biológico macromoléculas. Esto, alternadamente, ha conducido al desarrollo de nuevas técnicas para la colección y fusión parcial de la difracción conjuntos de datos recogidos de diferentes cristales para producir un conjunto completo de datos para la solución de la estructura. Estas técnicas se refieren comúnmente como serial Cristalografía (SX)3,4,5,6,7,8. Un ejemplo prototípico de SX es el uso de dispositivos de inyector para introducir una corriente estrecha de una mezcla de cristal en el haz de rayos x3,4,5. Un patrón de difracción se registra cada vez que un cristal está expuesto a los rayos x hacia la colección, de muchos miles de cristales individuales de 'todavía' imágenes de la difracción, información que luego se fusiona para producir un conjunto completo de datos. Sin embargo, una desventaja considerable de este tipo de colección de datos en serie es que el procesamiento de imágenes puede ser problemático. La calidad de los datos es mejorada considerablemente si cristales pueden rotar varias imágenes de la difracción son recogidos desde el mismo cristal durante experimentos de Cristalografía serie6.
MeshAndCollect1 fue desarrollado con el objetivo de combinar SX con recopilación de datos de rotación de MX 'estándar' y permite, de manera automática, experimentadores recopilar conjuntos de datos de difracción parcial de numerosos cristales de la misma meta macromolecular montado sobre el mismo o distintos portamuestras. Un conjunto de datos de difracción completa entonces se obtiene por la fusión de la más isomórfica de los conjuntos de datos parciales recolectados. MeshAndCollect es compatible con cualquier línea de rayos x de sincrotrón de vanguardia para MX (idealmente una instalación de dispositivo de inserción con un relativamente pequeño (20 μm o menos) viga de tamaño en la posición de la muestra). Además de la recopilación de datos completos de una serie de pequeños cristales bien diffracting, el método también es muy adecuado para la evaluación experimental inicial de la calidad de la difracción de micro cristales y para el procesamiento de muestras opacas, por ejemplo, en meso crecido microcristales de proteínas de membrana9.
En el comienzo de un experimento de MeshAndCollect, las posiciones, en dos dimensiones, de cada uno de cristal muchos contenidos en un solo portamuestras se determinan usando una exploración de rayos x de dosis baja. Las imágenes de difracción recogidas durante esta exploración son analizadas automáticamente por el programa DOZOR1, que ordena las posiciones de los cristales en el sostenedor de la muestra según su fuerza de difracción correspondientes. Posiciones para la recolección parciales de conjuntos de datos se asignan automáticamente según un corte de la fuerza de difracción y, en el último paso, pequeñas cuñas de los datos de difracción, típicamente ±5 ° de rotación, se recogen de cada posición elegida. La experiencia ha demostrado que esta gama de rotación proporciona una cantidad suficiente de reflexiones por cristal para el conjunto de datos parcial escalado propósitos, mientras que al mismo tiempo, reducir problemas centrado cristal posible y la posibilidad de exponer múltiples cristales en una especialmente concurrida de apoyo1. Las cuñas de los datos de difracción individual (conjuntos de datos parciales) son entonces procesados ya sea manualmente o utilizando el tratamiento automatizado de datos de las tuberías10,11,12,13. Para la determinación de la estructura aguas abajo entonces es necesario encontrar la mejor combinación parciales de conjuntos de datos para ser combinado14,15,16 después de que el conjunto de datos completo resultante pueden ser tratado de la misma manera como se origina de un solo cristal del experimento.
Como ejemplo de MeshAndCollect en la práctica, aquí os presentamos la solución de la estructura cristalina de la proteína fluorescente ciánica (PPC) cerúleo, utilizando un conjunto de datos de difracción de la combinación parciales de conjuntos de datos recogidos de una serie de microcristales montan sobre el mismo soporte de la muestra. Cerúleo se ha diseñado de la proteína fluorescente verde (GFP) de las medusas Aequorea victoria17, cuyo cromóforo fluorescente está formado autocatalytically de la cyclisation de tres residuos de aminoácidos consecutivos. Cerúleo es obtenido de GFP por mutando respectivamente el primeros y segundo residuos del cromóforo, una serina y una tirosina, treonina (S65T) y triptófano (Y66W) y adaptar el entorno del cromóforo con más mutaciones (Y145A, N146I, H148D, M153T y V163A) para producir un nivel de fluorescencia significativo, pero subóptimo de QY = 0,4918,19,20. Se han propuesto las propiedades fluorescentes subóptimas de Cerulean para vincularse a la dinámica de proteínas complejas que implican la estabilización imperfecta de uno de los once β-filamentos de la proteína21 y a la comodidad de dos diferentes cromóforo isómeros dependiendo del pH y la irradiación condiciones22. Elegimos trabajar con cerúleo como una proteína modelo que ilustra el uso del Protocolo de MeshAndCollect debido a la relativamente facilidad de ajuste de tamaño de los cristales según la cristalización. La estructura del cerúleo es muy similar a que de la proteína GFP de padres, tal como está constituida de un β-barril formado por once β-filamentos que rodean una α-hélice, que lleva el cromóforo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline</td>
			<td>ESRF ID 23-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization plates XDXm with sealant</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Life Technologies Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>10-110-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroMeshes 700/25</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU:&#160;M3-L18SP-25L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 10/300 -GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5174-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9201-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186&#8211;3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aimless</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204&#8211;1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ccCluster</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844&#8211;1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeshAndCollect workflow</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328&#8211;2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCuBE2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700&#8211;707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24&#8211;226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>Max-Planck-Institut f&#252;r Medizinische Forschung</td>
			<td>Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125&#8211;132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect

Cristalografía de la radiografía es la técnica principal utilizada para obtener información de alta resolución sobre las estructuras 3-dimensionales de macromoléculas biológicas. Hasta hace poco, un requisito importante ha sido la disponibilidad de relativamente grandes, bien diffracting cristales, que son a menudo difíciles de obtener. Sin embargo, el advenimiento de la cristalografía serial y un renacimiento en métodos de recolección de datos multi-cristal ha significado que la disponibilidad de grandes cristales ya no necesita ser un factor limitante. Aquí ilustramos el uso del protocolo automatizado de MeshAndCollect, que primero identifica las posiciones de muchos pequeños cristales montados sobre el mismo soporte de muestra y luego dirige la colección de los cristales de una serie de conjuntos de datos de difracción parcial para fusión posterior y uso en la determinación de la estructura. MeshAndCollect puede aplicarse a cualquier tipo de micro cristales, aunque débil diffracting. Como ejemplo, presentamos aquí el uso de la técnica para resolver la estructura cristalina de la proteína fluorescente ciánica (PPC) cerúleo.

MeshAndCollect, como se implementó en MXCuBE2 (véase figura 1A), fue utilizado para la colección de conjuntos de datos de difracción parcial de pequeños cristales de Cerulean situado en el mismo portamuestras en la que era difícil identificación visual de cristales. Para el sostenedor de la muestra de la pantalla, dibujamos una cuadrícula sobre el centro de la meshloop (ver figura 1B) y basado en el DOZOR puntuación calor mapa difracción parcial 85 (ver figuras 1, D 1) conjuntos de datos fueron recogidos automáticamente. Éstos fueron integrados individualmente entonces combinado (véase arriba) para producir un conjunto de datos con integridad de 99.8% en dmin = 1.7Å (ver tabla 1). Correlación de medio juego (CC1/2)34 en la cáscara de resolución más alta fue 60% (= 4,7). Como era de esperarse, la estructura cristalina de Cerulean podría ser resuelto directamente por reemplazo molecular33 con el conjunto de datos generado. Después de refinamiento, se obtuvieron una Rtrabajo de 22,8% y un Rlibre de 25.4%. Superposición con la estructura previamente determinada (PDB entrada 2WSO21) muestra un rmsd global en C las posicionesα de 0.1 Å. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Estadísticas del conjunto combinado de datos</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Umbral de clustering</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Número de conjuntos de datos parciales</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grupo del espacio</td>
			<td>P212121</td>
		</tr>
<tr>
<td>Celda (a, b, c)</td>
			<td>50.98, 62.76, 69.50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rango Resolución</td>
			<td>46.58-1,70 (1,73-1,70)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmerge (todos lo + y -)</td>
			<td>0.133 (0.743)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (todos I + y I-)</td>
			<td>0.142 (0.813)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim (todos I + y I-)</td>
			<td>0.047 (0.318)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total observaciones, único</td>
			<td>220693/25129</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mean((I)/SD(I))</td>
			<td>13.8 (4.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MN(I) medio juego correlación CC(1/2)</td>
			<td>0.994 (0.602)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Integridad</td>
			<td>99.8 (99.5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multiplicidad</td>
			<td>8.8 (6,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Final RCrist
</td>
			<td>22.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Final Rgratis
</td>
			<td>25.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Estadísticas de la combinado conjunto de datos que indica la alta calidad de los datos recogieron.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58594/58594fig1.jpg"> Figura 1: usando MeshAndCollect para recoger una serie de conjuntos de datos parciales de una serie de pequeños cristales contenidos en el mismo portamuestras. A) interfaz de usuario de MXCuBE2. El óvalo verde sobre el campo del visor sobre el eje indica la herramienta de red. B) con él se dibuja una cuadrícula sobre la imagen del sostenedor de la muestra en el campo de la imagen de la vida. C) mapa de las puntuaciones DOZOR. D) ejemplo de una imagen de difracción. E) dendrograma después de análisis de conglomerados jerárquico. Conjuntos de datos en rojo fueron utilizados para la fusión. F) estructura total de Cerulean. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58594/58594fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Presentamos el uso del protocolo MeshAndCollect para obtener un conjunto de datos de difracción completa, para su uso en la determinación de la estructura posterior, compuesto por difracción parcial de conjuntos de datos recopilados de muchos pequeños cristales de la proteína fluorescente cerúleo.

Solución de la estructura de la proteína fluorescente Cerulean con MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

El protocolo automatizado MeshAndCollect fue desarrollado para combinar la cristalografía serial con la recopilación de datos de rotación estándar para medir pequeños cristales a partir de muestras de disco. El método identifica primero la posición de los cristales montados en el mismo soporte de muestra para luego dirigir la recopilación de conjunto de datos parciales que posteriormente se fusionará y utilizará para la solución de la estructura. MeshAndCollect es convincente, ya que le permite hacer experimentos rápidamente y con la misma configuración, solución de estructura, cribado de ligandos, y todo eso con cristales diminutos.El método es compatible con VMX de sincrotrón beamline idealmente equipado con alta flexión de fotones, un diámetro de haz pequeño y un detector de recarga rápida. En primer lugar, conéctese al sistema de información ampliado para la base de datos de la línea de efectos de cristalografía de proteínas y elija MX.Log con el número de experimento y la contraseña del formulario A. A continuación, seleccione Agregar envío nuevo y rellene la información solicitada.Seleccione Añadir parcial y rellene los datos relevantes. Seleccione Agregar contenedor, elija un disco SC3 y rellene la información necesaria, incluidas las posiciones de los portamuestras en el disco. En la cabaña experimental, cargue el disco en el hacedor del cambiador de muestras y observe su posición.A continuación, inicie sesión en el sistema de información para la base de datos de la línea de mar de cristalografía de proteínas. Seleccione Preparar experimento, busque el envío, seleccione Siguiente e indique la línea de viga y la posición del disco en el cambiador de muestras. Inicie sesión en el software de control de la línea de haz con el número experimental y la contraseña proporcionados en el formulario A.Pulse Sync para sincronizar el software de control de la línea de haz con el sistema de información para la base de datos de la línea de mar de cristalografía de proteínas. Utilice el software de control de la línea de haz para montar el portacuchillas en el goniómetro. A continuación, haga clic con el botón derecho en una posición en el área del cambiador de muestra y seleccione Montar muestra.Seleccione el botón central y luego tres clics en el centro en el centro del borde de la punta del bucle. Guarde la posición centrada seleccionando Guardar. En Avanzadas, agregue el flujo de trabajo Reorientación visual a la cola de recopilación de datos.A continuación, inicie el flujo de trabajo haciendo clic en Recopilar cola. A continuación, seleccione una de las posiciones centrales guardadas haciendo clic en ella. Haga clic de nuevo en el botón central, luego en un centro de tres clics en el centro del inicio del vástago del bucle.Guarde la segunda posición haciendo clic en Guardar. Y luego haz clic en Continuar. Después de que el flujo de trabajo alinee el plano del soporte de muestra con el eje de rotación del goniómetro, centre el soporte de muestra de nuevo en algún lugar en el centro de la malla.Oriente el soporte de muestra de modo que la cara de la malla sea perpendicular a la dirección del haz de rayos X girando el eje omega utilizando el software de control de la línea de haz. En el software de control de la línea de haz, haga clic en el menú desplegable Apertura y seleccione un valor. A continuación, haga clic en el icono de la herramienta de malla para abrir la ventana de herramientas de malla.En la vista de muestra del software de control de línea de haz, dibuje la malla haciendo clic con el botón izquierdo y arrastrando el ratón sobre el área que contiene cristales en el soporte de muestra. Para guardar la malla, haga clic en el botón más en la ventana de herramientas de malla. En el campo de resolución del software de control de la línea de haz, introduzca la resolución a la que se deben recopilar las imágenes de difracción.Si no se conoce información previa sobre la calidad de difracción de los cristales, se recomienda un valor entre dos y 2,5. Seleccione MeshAndCollect en la pestaña Recopilación avanzada de datos. Añádalo a la cola y haga clic en Recopilar la cola.En la ventana de parámetros, utilice los parámetros predeterminados dependientes de la línea de viga. En el experimento descrito aquí, los parámetros predeterminados son 0,037 segundos de tiempo de exposición por punto de escaneo de malla, 100% de transmisión y oscilación de un grado por línea de escaneo de malla. Haga clic en Continuar.El escaneo de malla se ejecuta y las imágenes de difracción recogidas en cada punto de cuadrícula se analizan y clasifican de acuerdo con la fuerza de difracción con el software Dozer. Después del análisis Dozer, se genera un mapa de calor y el orden para las colecciones de datos parciales subsiguientes se asigna automáticamente en función de la fuerza de difracción. Por último, haga clic en Continuar para iniciar las colecciones de datos parciales.MeshAndCollect tal como se implementó en MXCuBE se utilizó para la recopilación de conjuntos de datos de difracción parcial a partir de pequeños cristales de Cerulean ubicados en el mismo soporte de muestra en el que la identificación visual de cristales era difícil. Para examinar el soporte de muestra, se dibujó una cuadrícula sobre el centro del bucle de malla y, en función del mapa de calor de puntuación Dozer, se recopilaron automáticamente 85 conjuntos de datos de difracción parcial. Estos se integraron individualmente y luego se fusionaron para producir un conjunto de datos con una integridad del 99,8% con una resolución de 1,7 angstroms.Como era de esperar, la estructura cristalina de Cerulean podría resolverse mediante reemplazo molecular utilizando el conjunto de datos generado. Después del refinamiento, se obtuvo una R de trabajo del 22,8% y una R libre del 25,4%. La superposición de la estructura previamente determinada muestra un RMSD global en posiciones c-alfa de 0.1 angstroms.Para los proyectos en los que la optimización de la fase de crecimiento del cristal, MeshAndCollect ofrece la posibilidad de obtener un conjunto de datos completo basado en la combinación de estos conjuntos de datos parciales amorfos obtenidos a partir de cristales más pequeños. Esta técnica allanó el camino para que los biólogos estructurales resolvieron una estructura a partir de la muestra de piezas donde sólo unas décimas de micro cristales no podían ser producidos.

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Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medición de alta sensibilidad de transcripción DNA Factor obligatorio afinidades por valoración competitiva utilizando microscopía de fluorescencia

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondear la estructura y dinámica de nucleosomas utilizando imágenes de microscopía de fuerza atómica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Medidas solo de liposomas para el estudio de enzimas de membrana bombas de protones usando electroquímica y microscopia fluorescente

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Localización de proteínas de SUMO modificado utilizando proteínas de atrapamiento de sumo fluorescente

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Evaluación de la oxidación celular utilizando una proteína fluorescente verde sensible al redox específica del compartimento subcelular

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...