Name: structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect
Uploaded: 2019-03-19T13:00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect at JoVE.com

Vi tackar ESRF för att tillhandahålla beam tid genom dess egna forskningsprogram.

1. uttryck och rening av Cerulean
Obs: Detta är baserat på protokollet publiceras av Lelimousin et al. 21
<ol><li>Express hans-taggade Cerulean i Escherichia coli BL21 celler odlas vid 37 ° C i 4 L auto inducerbara medium23 tills OD600= 1 och sedan Inkubera över natten vid 27 ° C.</li>
	<li>Skörda bakteriecellerna på 5 000 x g och lysera celler via ultraljudsbehandling (40%, 5 min, 10 s puls, 10 s paus) i 200 mL buffert består av 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl och 1 x EDTA-fria proteashämmare.</li>
	<li>Ladda supernatanten på en hans-fälla Ni-NTA kolumn och eluera Cerulean med 100 mM Imidazol i samma buffert villkor.</li>
	<li>Pool, de ljusa gula färgade fraktionerna. Proteinet är naturligt färgad, därav Cerulean-innehållande fraktioner är lätt urskiljbara.</li>
	<li>Rena proteinet (4 mL) på en S75 kolumn i 20 mM Tris pH 8,0.</li>
	<li>Pool ljusa gula fraktioner och koncentrera sig på protein lösning 15 mg/ml.</li>
</ol>2. kristallisering
<ol><li>Använd den hängande droppe vapor diffusion teknik24 vid 20 ° C i Linbro plattor. Fyll brunnarna med 1 mL en fällningsmedel lösning bestående av 100 mM HEPES vid pH 6.75, 12% PEG8000 och 100 mM MgCl2. För den hängande droppar koncentrerad mix 1 µL av protein till 15 mg/mL med 1 µL fällningsmedel lösning. Kristaller bör visas i 24 h.</li>
	<li>Skörd av kristaller erhålls och överföra dem till 100 µL av en sådd buffert består av 0,1 M HEPES pH 6.75, 22% PEG 8000.</li>
	<li>Slipa kristaller med en 0,1 mL vävnad grinder och späd i sådd buffert (baserat på 1: 100).</li>
	<li>Smälta en alikvot av protein stamlösning (15 mg/mL) med trypsin (0,5 mg/mL i samma buffert) för 1 h (1:10 (v/v)).</li>
	<li>Blanda den smälta protein lösningen med 10% av utsäde-innehållande buffert (v/v).</li>
	<li>Odla kristaller (10 * 10 * 20 µm3) i 0,1 M HEPES pH 7, 14% PEG 8000, 0,1 MgCl2 i 1-1,5 μL hängande droppar med metoden vapor diffusion.</li>
</ol>3. Crystal montering
<ol><li>Använd en lämplig slinga, t.ex. en mesh loop 700 fyrkantiga hål 25 µm varje monterad på en RYGGRAD standardprov innehavaren25. Över kristaller från kristallisering drop (steg 2,6) till 1 µL frysskyddmedel lösning (väl fällningsmedel lösningen blandas med glycerol (20% v/v slutlig)).</li>
	<li>Montera den protein crystal flytgödsel på en mesh-loop genom att flytta slingan under kristallerna och lyfta dem ur rullgardinsmenyn. Idealiskt bör kristallerna i storleksintervallet 5 µm – 30 µm i maximal dimension med ingen överlappning mellan kristaller monterad i slingan.</li>
	<li>Transportera bort överflödig vätska genom att röra vid fästet snabbt med filterpapper. Sediment kristallerna så att de sitter i planet av slingan omgiven av så lite bulk vätska som möjligt.</li>
	<li>Störta fästet i en unipuck full av flytande kväve. Lagra pucken på 100 K i en lämplig lagring behållare tills strålen tid finns.</li>
</ol>4. offline beredning av synkrotron experimentet
Obs: Begära synkrotron beam tid så tidigt som möjligt och följ de online riktlinjerna för tillgängliga tillgång typer och hur du skickar in en ansökan om en viss synchrotron. ESRF riktlinjerna kan hittas på http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. Om en medlem av en ESRF Block Allocation grupp (påse), behövs inte en ansökan för varje specifikt projekt. I detta fall bör praktiker närma sin väska ansvarig om schemaläggningen av beam tid.
<ol><li>När förslaget accepteras och en inbjudan för experimentet mottas, har alla deltagare slutföra säkerhetsutbildning. Fyll i ”A-formulär” (via ESRF användarportal, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) med nödvändiga säkerhetsinformation om prover. Kontakta den lokala kontaktpersonen för att diskutera experimentet. När din A-formulär lämnas och validerade ger det dig det experiment nummer och lösenord.</li>
	<li>Utökade ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) och välja MX.</li>
	<li>Logga in med antalet experiment och lösenordet från A-formulär.</li>
	<li>Välj leverans | Lägg till nytt och fyll i den begärda informationen.</li>
	<li>Välj Lägg till skifte och fyll i relevanta uppgifter. Välj Lägg till behållare, välja en unipuck och fyll i den information som krävs, inklusive positionerna för innehavarna av prov i pucken.</li>
</ol>5. lastning av provet på en Beamline
<ol><li>I den experimentella hutch, läsa in pucken i provväxlare (SC) dewar och notera sin ståndpunkt.</li>
	<li>Interlock experimentella kabinen och ange den control hutch.</li>
	<li>Logga in på ISPyB (https://esrf.fr/). Välj Förbered Experiment, hitta transporten, Välj Nästa och ange beamline och pucken ställning i SC.</li>
	<li>Logga in i beamline kontroll mjukvaran, här MXCuBE227,28 med experimentella nummer och lösenord som finns på A-formulär.<ol>
<li>Tryck på Sync för att synkronisera beamline kontroll mjukvaran med databasen ISPyB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Använda programvaran beamline kontroll, för att montera provhållaren på goniometer. I MXCuBE2, högerklicka på en position i området sample changer och välj Mount provet.</li>
	<li>Dra nytta av MK3 mini kappa goniometer29 installerad på de flesta av den ESRF MX linjer, Använd MXCuBE2's ”visuella uträtning” arbetsflöde30 för att justera planet av provhållaren med rotation axel goniometer.<ol>
<li>Välj knappen i mitten , sedan 3-Klicka på centrera på mitten av kanten på spetsen av slingan. Spara den centrerade positionen genom att välja Spara.</li>
		<li>Klicka igen på knappen i mitten , sedan 3-Klicka på centrera mitten av början av stammen av slingan. Spara den andra positionen samt genom att klicka på Spara.</li>
		<li>Välj en av de spara centrerad positionerna genom att klicka på den.</li>
		<li>Under Avancerat, lägga till arbetsflödet visuella omorientering i MxCuBE2 data collection kön.</li>
		<li>Starta arbetsflödet genom att klicka på samla kö.</li>
		<li>När arbetsflödet justerar planet av provhållaren med rotation axel goniometer, center provhållaren igen, denna gång någonstans i mitten mesh.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Orient provhållaren så att ansiktet av mesh är vinkelrät mot X-ray balk av roterande omega axeln med MXCuBE2.</li>
	<li>I MXCuBE2, Välj beam krävs för skanning av provhållaren (endast för linjer med rörlig balk storlek).<ol>
<li>Klicka på bländare rullgardinsmenyn i programvaran beamline kontroll och välj ett värde, t.ex. 10 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definiera en maska för maska Skanna.<ol>
<li>Klicka på ikonen mesh verktyg i MXCuBE2. Mesh verktygsfönster visas.</li>
		<li>I vyn prov av MXCuBE2 Rita maskor genom att vänster klicka och dra musen över det område som innehåller kristaller på provhållaren.</li>
		<li>För att spara mesh Klicka på Plus -knappen i fönstret mesh verktyg (mesh blir gröna).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Förbered och köra MeshAndCollect arbetsflödet
<ol><li>I fältet upplösning av MXCuBE2 ange upplösning (dmin) vid vilken diffraktion bilder bör samlas, exempelvis här 1,8 Å.</li>
	<li>Välj MeshAndCollect på fliken Avancerat data insamling, lägga till kön och klicka på samla den kö.</li>
	<li>I parameterfönstret som visas, Använd beamline beroende standardparametrar. I experimentet beskrivs här defaults parametrar är 0,037 s exponeringstid per scan nätpunkt, 100% transmission (som i detta fall leder till 4 x 1011 ph/s), 1 ° svängning per scan nätlinje.</li>
	<li>Klicka på Ctt. Mesh genomsökningen körs och diffraktion bilderna samlas på varje punkt i rutnätet analyseras och rankas enligt diffraktion styrka med programvaran DOZOR1. Denna process körs i bakgrunden.</li>
	<li>Efter DOZOR analysen en intensitetskarta genereras och tilldelas ordern för efterföljande ofullständiga datainsamlingar automatiskt baserat på diffraktion styrka (se figur 1). Obs: Resultaten av detta steg kan också inspekteras i ISPyB. För insamling av partiell datamängder som en ny flik med inställningar dyker upp i programvaran beamline kontroll, Välj lämpliga värden för antal bilder (dvs 100), upplösning, exponeringstid, rotation intervallet (dvs. 0,1 °), överföring, inverterad beam etc. helst dosen för varje wedge samlas bör vara under Garman gränsen (30 MGy). Ungefärlig exponeringstid per bild är 0.037 s till 0,1 s i de beskrivna försöksbetingelser.</li>
	<li>Klicka på Fortsätt för att starta de ofullständiga data-samlingarna.</li>
</ol>7. databearbetning
Obs: Partiell datauppsättningar är integrerade med ett passande program (XDS10). För detta används ett Python-skript som erkänner varje enskild datamängd, integrerar det och ser till att indexering mellan uppsättningar av olika delvis är konsekvent.
<ol><li>Öppna mappen som innehåller bilderna: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean.</li>
	<li>Göra en säkerhets kopia av undermappen process som kan hittas i mappen där de delvis datauppsättningarna samlas.<ol>
<li>På Linux terminal, använder du det kommandot cp – r processen process_backup.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Navigera till mappen processen och starta bearbetningsskriptet.<ol>
<li>På Linux terminal, skriv kommandot cd processen och tryck enter.</li>
		<li>Typ procMultiCrystalData och tryck enter. Obs: Skriptet frågar efter en utrymmegruppen och cell parametrar (denna information är valfritt), ange de enligt instruktionerna. Efter en sista bekräftelse från användaren, ska skriptet köras automatiskt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. sammanslagning av datauppsättningar
Obs: Efter alla partiella datauppsättningar är integrerade är den bästa kombinationen av dem samman för att producera den slutliga datauppsättningen för strukturbestämning och förfining. Olika syften av denna fusionerande process kan vara att få full fullständighet (rekommenderas), hög multiplicity eller bästa data statistiken (hög < I/σ(I) >, låg R-faktorer, etc.). Det senare kan ibland vara på bekostnad av fullständighet och/eller multiplicity så detta alternativ bör väljas med omsorg.
<ol><li>Sammanfoga partiell datauppsättningar med hjälp av programmet ccCluster14. Hierarkisk kluster analys (HCA) används för att bestämma möjliga kombinationer av isomorft partiell datauppsättningar ().<ol>
<li>Skriv ccCluster i Unix-terminalen öppna dess grafiskt användargränssnitt (GUI). Obs: I ccCluster GUI dras ett dendrogram. Detta ger ett förslag om vilken partiell datauppsättningar kan slås samman bäst baserat på isomorfi mellan dem.</li>
		<li>Klicka på en nod som motsvarar ett värde av cirka 0,4 på den lodräta axeln. Allmänhet, högre värden kommer att innehålla mer ofullständiga data set men leda till värre sammanslagning statistik som partiell datamängder kommer att vara mindre isomorft.</li>
		<li>Klicka på sammanfoga DATA. Det markerade klustret kommer att bearbetas i bakgrunden och uppskattade fusionerande statistiken visas i en ny flik i GUI. Detta steg kan upprepas för olika kombinationer av datamängder. En bra kombination av partiell datauppsättningar fullständighet bör vara nära 100%, den < I/σ(I) > höga värden (10 eller högre i lägsta upplösning shell) och R-meas31 värdena låg (runt 5% i låg upplösning shell).</li>
	</ol>
</li>
	<li>För varje kombination som valt att använda skriptet genererade ingående samman delvis datauppsättningar valt till en enda mtz fil (dvs meningslöst32).</li>
	<li>Slutgiltigt skala och koppla intensitet data i denna fil med ett skalning program (dvs planlös32) och som med en fil som kommer från en enda kristall datainsamling, använda utdata för efterföljande utfasningen och struktur lösning33 .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeshAndCollect:+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines.">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Protection+of+Protein+Crystals+against+Radiation+Damage+in+Electron+and+X-Ray+Diffraction.">Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).</li><li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography.">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).</li><li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography:+the+first+five+years.">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).</li><li>Stellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+macromolecular+serial+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).</li><li>Coquelle, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-scanning+serial+protein+crystallography+using+micro-+and+nano-focused+synchrotron+beams.">Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).</li><li>Diederichs, K., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Synchrotron+X-Ray+Crystallography+(SSX).">Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX).</a> Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).</li><li>Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., B&#252;ldt, G., Gordeliy, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-Radiation-Induced+Changes+in+Bacteriorhodopsin+Structure.">X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (5), 813-825 (2011).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS+implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xia2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF.">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li><li>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+clustering+for+multiple-crystal+macromolecular+crystallography+experiments:+the+ccCluster+program.">Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844-1851 (2017).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+of+synchrotron+serial+crystallographic+data+by+a+genetic+algorithm.">Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).</li><li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography.">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength+mutations+and+posttranslational+autoxidation+of+green+fluorescent+protein.">Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12501-12504 (1994).</li><li>Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2:+Understanding+Structure-Function+Relationships+in+the+Aequorea+victoria+Green+Fluorescent+Protein.">Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein.</a> Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li><li>Lelimousin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Dynamics+in+ECFP+and+Cerulean+Control+Fluorescence+Quantum+Yield.">Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield.</a> Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).</li><li>Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromophore+Isomer+Stabilization+Is+Critical+to+the+Efficient+Fluorescence+of+Cyan+Fluorescent+Proteins.">Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins.</a> Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).</li><li>Rhodes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. , (2006).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB:+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Gabadinho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MxCuBE+a+synchrotron+beamline+control+environment+customized+for+macromolecular+crystallography+experiments.">MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).</li><li>De Santis, D., Leonard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notiziario+Neutroni+e+Luce+di+Sincrotrone.">Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone.</a> Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).</li><li>Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+mini-&#954;+goniometer+head+in+macromolecular+crystallography+diffraction+experiments.">The use of a mini-&#954; goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).</li><li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography.">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li><li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography.">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).</li><li>Evans, P. R., Murshudov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+are+my+data+and+what+is+the+resolution?.">How good are my data and what is the resolution?.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).</li><li>Taylor, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+phasing.">Introduction to phasing.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).</li><li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality.">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li><li>Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESRF+upgrade+programme+phase+II+(2015+-+2022).">ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022).</a> The orange book. , (2015).</li></ol>

Författarna har ingenting att avslöja

Framgången för ett MX experiment beror oftast på förekomsten av relativt stora, väl diffracting kristaller. För projekt där optimering från liten kristall duschar till större kristaller misslyckas, ger MeshAndCollect en möjlighet att få en komplett diffraktion datamängd för struktur lösning via kombinationen av isomorft datauppsättningar med delvis insamlade från en serie av små kristaller. Metoden är kompatibel med synkrotron linjer för MX, helst med en hög photon flux och en liten stråle diameter, utrustad med en toppmodern diffractometer enhet och en snabb-avläsning detektor. På sådan en slutstation tar den data collection del av sådant experiment cirka 20 minuter, beroende på antalet partiella data set som ska samlas in och antalet crystal-innehållande prov innehavare ska analyseras.
Den viktigaste förutsättningen för att lyckas med ett MeshAndCollect experiment är förekomsten av tillräckligt många (minst 50, 100 idealiskt) av diffracting positioner på provhållaren. Från erfarenhet, bör kristaller analyseras vara minst cirka 5 µm i den minsta dimensionen. Metoden är kompatibel med någon slags standard cryo-kylning kompatibel prova innehavare med bästa resultat uppnås med hjälp av mesh fästen som är stel och rak.
Vid ESRF implementeras MeshAndCollect på ett användarvänligt sätt i ett arbetsflöde Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en)30 tillgängliga från MXCuBE2 beamline kontroll mjukvaran. En stor fördel med MeshAndCollect jämfört med andra SX-metoder är att insamlade data kan bearbetas av vanliga program och automatiserade rörledningar som används för enda kristall MX.
Vårt exempel visar MeshAndCollect är mycket lätt att applicera och leder till en rad delvis diffraktion datauppsättningar, vanligtvis samlas in från små kristaller, som kan slås samman för att producera en fullständig uppsättning data för användning i struktur lösning. MeshAndCollect har dessutom potential att öppna upp provtagning utrymme av röntgenkristallografi eftersom det ger ett sätt att samla användbara data från kristallisering prövningar där det sista steget-optimering produktionen av stora kristaller, är misslyckat.
Mot bakgrund av den aktuella utvecklingen mot ljusare röntgenkällor (t.ex. extremt lysande källa (EBS) projektet/ESRF35) är det kan förutses att på grund av ökad strålning skada, typ av flera kristall datainsamling underlättas genom MeshAndCollect blir standardmetoden för datainsamling, snarare än ett undantag – som för närvarande är fallet - på synkrotron-baserade MX linjer.

Makromolekylär röntgenkristallografi (MX) är den överlägset den mest använda metoden för att få atomär upplösning insikt i den tredimensionella strukturen av biologiska makromolekyler. En större flaskhalsar är dock kravet på relativt stora, väl diffracting kristaller.
Ofta, och särskilt när utkristalliseras membranproteiner, bara mycket små kristaller på några mikrometer i den största dimensionen kan erhållas. Strålskador effekter gräns resolutionen av en komplett diffraktion data som kan samlas in från en enda micro crystal2, och mycket ofta, är det nödvändigt att förbättra signal-brusförhållande och därmed data ange upplösning, genom en sammanslagning av flera partiell diffraktion datauppsättningar från olika, men isomorfa kristaller. Ökningarna i flödestäthet av röntgen strålar på synkrotron källor och annorstädes (t.ex. röntgen gratis-elektron lasrar (X-FELs)), har inneburit att användbar partiell diffraktion datauppsättningar kan hämtas från även mycket små kristaller av biologiska makromolekyler. Detta, i sin tur har lett till utvecklingen av ny teknik för insamling och sammanslagning av partiell diffraktion datauppsättningar samlas in från många olika kristaller för att framställa en komplett datauppsättning för struktur lösning. Sådana tekniker är vanligen kallad seriell kristallografi (SX)3,4,5,6,7,8. En prototypiska exempel på SX är användning av injektor enheter att införa en smal ström av en kristall slurry i X-ray balk3,4,5. En diffraktionsmönster registreras varje gång en kristall utsätts för röntgen leder till samlingen, från många tusentals enskilda kristaller, '' diffraktion stillbilder, information som är sedan samman för att producera en fullständig uppsättning data. En betydande nackdel med denna typ av insamling av seriell data är dock att behandlingen av stillbilder kan vara problematiskt. Kvaliteten på uppgifterna är betydligt bättre om kristaller kan roteras eller flera diffraktion bilder samlas in från samma kristallen under seriell kristallografi experiment6.
MeshAndCollect1 utvecklades i syfte att kombinera SX med 'standard' MX rotation datainsamling och tillåter, i ett automatiskt sätt, praktiker att samla partiell diffraktion datamängder från många kristaller av samma makromolekylära mål monterade på samma eller olika prov innehavare. En komplett diffraktion datauppsättning erhålls sedan genom en sammanslagning av den mest isomorft av de partiella data samlas in. MeshAndCollect är kompatibel med alla state-of-the-art synkrotron röntgen beamline för MX (helst en infogning enhet anläggning med en relativt liten (20 µm eller mindre) balk storlek vid provposition). Förutom att sammanställningen av komplett datamängder från en serie av små, väl diffracting kristaller är metoden också mycket lämplig för den första experimentella bedömningen av diffraktion kvaliteten på mikro-kristaller och för behandling av ogenomskinlig prover, t.ex. i meso vuxit microcrystals av membranet proteiner9.
I början av ett MeshAndCollect experiment fastställs positionerna, i två dimensioner, för var och en av många kristallen som ingår i en enda provhållare med en låg dos röntgen scan. Diffraktion bilder som samlats in under genomsÃ¶kningen analyseras automatiskt av programmet DOZOR1, vilket sorterar placerar av kristallerna på provhållaren enligt deras respektive diffraktion styrka. Positioner för insamling av partiell datauppsättningar tilldelas automatiskt baserat på en diffraktion styrka cut-off och, i det sista steget, små kilar av diffraktion data, typiskt ±5 ° rotation, samlas in från varje vald position. Erfarenheten har visat att denna rotation urval ger en tillräcklig mängd reflektioner per crystal för ofullständig uppsättning uppgifter skalning ändamål, medan på samma gång, minska möjligt crystal centrering frågor och chansen att exponera flera kristaller i en särskilt trångt stöd1. Enskilda diffraktion data kilar (partiell datauppsättningar) är sedan bearbetas antingen manuellt eller med hjälp av automatisk databehandling rörledningar10,11,12,13. För strukturbestämning av nedströms är det då nödvändigt att hitta den bästa kombinationen av partiell datauppsättningar vara sammanslagna14,15,16 varefter den resulterande komplett datauppsättningen kan behandlas på samma sätt som en med ursprung från en enda kristall experimentera.
Som ett exempel på MeshAndCollect i praktiken presenterar vi här lösningen av kristallstrukturen i den Cyan fluorescerande Protein (GFP) Cerulean, använder en diffraktion datauppsättning tillverkade av kombinationen av partiell uppsättningar data som samlats in från en rad microcrystals monterad på samma prov stöd. Cerulean har utvecklats från det grönt fluorescerande Protein (GFP) från maneter Aequorea victoria17, vars fluorescerande Kromoforen bildas autocatalytically från cyklisering av tre på varandra följande aminosyra rester. Cerulean erhålls från GFP genom muterar de första och andra resterna av Kromoforen, en serin och en tyrosin, treonin (S65T) och tryptofan (Y66W) respektive och anpassa kromofor miljön med ytterligare mutationer (Y145A, N146I, H148D, M153T och V163A) att producera en betydande, men ändå suboptimala fluorescens nivå av QY = 0.4918,19,20. Suboptimal fluorescerande egenskaperna för Cerulean har föreslagits att kopplas till komplexa protein dynamics som involverar ofullkomlig stabiliseringen av en av de elva β-delarna av protein21 och inkvartering av två olika kromofor isomerer beroende på pH och bestrålning villkor22. Vi valde att arbeta med Cerulean som en modell protein som illustrerar användningen av protokollet MeshAndCollect tack vare den relativt enkel trimning crystal storlek beroende på kristallisation. Strukturen i Cerulean påminner mycket om att dess överordnade protein GFP, som det utgörs av en β-fat bildat av elva β-trådar kring en α-helix, som bär Kromoforen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline</td>
			<td>ESRF ID 23-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization plates XDXm with sealant</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA- free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4,693,159,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Life Technologies Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals Prolabo</td>
			<td>14388.29T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>10-110-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-trap HP</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroMeshes 700/25</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU:&#160;M3-L18SP-25L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator vibra cell 75/15</td>
			<td>SONICS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 10/300 -GL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-5174-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9201-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unipuck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Solange Delageni&#232;re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, St&#233;phanie Veyrier, Jos&#233; Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Se&#225;n M. McSweeney, St&#233;phanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186&#8211;3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aimless</td>
			<td>MRC Laboratory of Molecular Biology</td>
			<td>Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204&#8211;1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ccCluster</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844&#8211;1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOZOR</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Bourenkov and Popov, unpublished</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeshAndCollect workflow</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328&#8211;2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MXCuBE2</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700&#8211;707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24&#8211;226 (2014).</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XDS</td>
			<td>Max-Planck-Institut f&#252;r Medizinische Forschung</td>
			<td>Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125&#8211;132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structure solution of the fluorescent protein cerulean using meshandcollect

Röntgenkristallografi är den stora teknik som används för att få hög upplösning upplysningar om de 3-dimensionella strukturerna av biologiska makromolekyler. Tills nyligen, har en större kravet varit tillgången på relativt stora, väl diffracting kristaller, som ofta är utmanande att få. Men har tillkomsten av seriell kristallografi och en renässans i flera kristall datainsamlingsmetoder inneburit att tillgängligheten av stora kristaller inte längre behöver vara en begränsande faktor. Här, illustrera vi användningen av de automatiserade MeshAndCollect-protokollet, som först identifierar många små kristaller som monteras på samma provhållaren ståndpunkter och sedan leder samlingen från kristaller i en serie av partiell diffraktion datauppsättningar för efterföljande sammanslagning och användning i strukturbestämning. MeshAndCollect kan tillämpas på någon typ av mikro-kristaller, även om svagt diffracting. Som ett exempel presenterar vi här användningen av teknik för att lösa kristallstrukturen i den Cyan fluorescerande Protein (GFP) Cerulean.

MeshAndCollect, som genomförts i MXCuBE2 (se figur 1A), användes för insamling av partiell diffraktion datauppsättningar från små kristaller av Cerulean ligger på samma provhållaren där visuell identifiering av kristaller var svårt. Skärm provhållaren, vi drog ett rutnät över mitten av meshloop (se figur 1B) och utifrån DOZOR poäng värme karta (se figurer 1 c, 1 D) 85 partiska diffraktion uppsättningar data samlades in automatiskt. Dessa var individuellt integrerade då samman (se ovan) för att producera en uppsättning data med 99,8% fullständighet dmin = 1.7Å (se tabell 1). Halv-set korrelation (CC1/2)34 i högsta upplösning shell var 60% (= 4,7). Som väntat kunde kristallstrukturen i Cerulean lösas rakt genom molekylär ersättning33 använder de uppgifter som genereras. Efter förfining erhöll vi en Rarbeta 22,8% och en Rgratis 25,4%. Överlagring med tidigare fastställd struktur (PDB inträde 2WSO21) visar en global rmsd på Cα positioner 0,1 Å. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Statistik över de sammanslagna uppgifter som</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Klustring tröskel</td>
			<td>0,35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antal partiell datamängder</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Utrymmegruppen</td>
			<td>P212121</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enhet Cell (a, b, c)</td>
			<td>50.98, 62.76, 69,50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Upplösning utbud</td>
			<td>46.58-1,70 (1,73-1,70)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmerge (alla jag + och -)</td>
			<td>0,133 (0.743)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (alla jag + & jag-)</td>
			<td>0,142 (0.813)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim (alla jag + & jag-)</td>
			<td>0,047 (0.318)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Observationer totalt/unika</td>
			<td>220693/25129</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mean((I)/SD(I))</td>
			<td>13,8 (4,7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mn(I) halv-set korrelation CC(1/2)</td>
			<td>0.994 (0.602)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fullständighet</td>
			<td>99,8 (99,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multiplicity</td>
			<td>8,8 (6,5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Slutliga Rkristall
</td>
			<td>22,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Slutliga Rgratis
</td>
			<td>25,4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Statistik över de sammanslagna uppgifter som indikerar den höga kvaliteten på data som samlas in.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58594/58594fig1.jpg"> Figur 1: hjälp MeshAndCollect samla en rad delvis datamängder från en serie av små kristaller som finns i samma provhållaren. (A) användargränssnitt för MXCuBE2. Den gröna ovalen över fältet på-axeln tittaren anger rutnätsverktyget. (B) med det dras ett rutnät på bilden av provhållaren i livet bildfältet. (C) värme karta över DOZOR poängen. (D) exempel på en diffraktion bild. (E) Dendrogram efter hierarkiska klusteranalys. Datauppsättningar i rött användes för sammanslagning. (F) övergripande struktur Cerulean. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58594/58594fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect at JoVE.com

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Vi presenterar användning av protokollet MeshAndCollect att erhålla en komplett diffraktion datamängd, för användning i efterföljande strukturbestämning, sammansatt av partiell diffraktion uppsättningar data som samlats in från många små kristaller av fluorescerande protein Cerulean.

Struktur lösning av den fluorescerande Protein Cerulean använder MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Det automatiserade MeshAndCollect-protokollet utvecklades för att kombinera seriekristallografi med standarduppsamlande rotationsdata för att mäta små kristaller av från puckprover. Metoden identifierar först positionen för kristaller monterade på samma provhållare för att sedan styra insamling av partiell datamängd som kommer att därefter slås samman och användas för lösningen av strukturen. MeshAndCollect är övertygande eftersom det tillåter dig att göra experiment snabbt och med samma setup, struktur lösning, ligand screening, och allt det med små kristaller.Metoden är kompatibel med Synkrotron beamlines VMX idealiskt utrustad med hög fotonflex, en liten stråldiameter och en snabb omladdningsdetektor. Anslut först till det utökade informationssystemet för proteinkristallografi beamlines databas och välj MX.Logga in med experimentnumret och lösenordet från A-formuläret. Därefter väljer du Försändelse Lägg till nytt och fyll i den begärda informationen.Välj Lägg till partiell och fyll i relevanta data. Välj Lägg till behållare, välj en SC3 puck och fyll i den information som krävs inklusive positionerna för provhållarna i pucken. I den experimentella hutch, ladda pucken i provet växlare doer och notera dess position.Därefter logga in på informationssystemet för proteinkristallografi beamlines databas. Välj Förbered Experiment, hitta Försändelsen, välj Nästa och ange beamline och puckposition i provbytesapparaten. Logga in på programvaran för strållinjekontroll med det experimentella nummer och lösenord som finns på A-formuläret.Tryck på Sync för att synkronisera programvaran beamline control med informationssystemet för proteinkristallografi beamlines databas. Använd programvaran för strållinestyrning för att montera provhållaren på goniometern. Högerklicka sedan på en position i provändringsområdet och välj Montera prov.Välj mittknappen och sedan tre klick i mitten av kanten av öglans spets. Spara den centrerade positionen genom att välja Spara. Under Avancerat lägger du till arbetsflödet Visuell omorientering i datainsamlingskön.Starta sedan arbetsflödet genom att klicka på Samla in kö. Därefter väljer du en av de sparade centerpositionerna genom att klicka på den. Klicka igen på mittknappen, sedan en tre-klicka centrum på mitten av starten av stjälken av slingan.Spara den andra positionen genom att klicka på Spara. Och klicka sedan på Fortsätt. När arbetsflödet har justerat provhållarens plan med goniometerns rotationsaxel centrerar du samplingshållaren igen någonstans i mitten av nätet.Orientera provhållaren så att nätets ansikte är vinkelrätt mot röntgenstråleriktningen genom att omega-axeln roteras med hjälp av programvaran för strållinjestyrning. I beamline kontroll programvara, klicka på Aperture dropdown menyn och välj ett värde. Klicka sedan på nätverktygsikonen för att få upp nätverktygsfönstret.I provvyn av programvaran för strållinjens kontroll, ritar du nätet genom att vänsterklicka och dra musen över det område som innehåller kristaller på provhållaren. För att spara nätet, klicka på plusknappen i nätverktygsfönstret. I upplösningsfältet för programvaran för strållinjestyrning, ange den upplösning vid vilken diffraktionsbilder ska samlas in.Om ingen förhandsinformation är känd om kristallernas diffraktionskvalitet, rekommenderas ett värde mellan två och och 2,5. Välj MeshAndCollect i fliken Avancerad datainsamling. Lägg till den i kön och klicka på Samla in kön.I parameterfönstret använder du de beamline-beroende standardparametrarna. I experimentet som beskrivs här är standardparametrar 0,037 sekunders exponeringstid per nätgenomsökningspunkt, 100%-överföring och en grads svängning per nätskanningslinje. Klicka på Fortsätt.Nätskanningen körs och diffraktionsbilderna som samlas vid varje rutnätspunkt analyseras och rangordnas enligt diffraktionsstyrka med programvaran Dozer. Efter Dozer-analysen genereras en värmekarta och beställningen för efterföljande partiella datasamlingar tilldelas automatiskt baserat på diffraktionsstyrka. Klicka slutligen på Fortsätt för att lansera de partiella datasamlingarna.MeshAndCollect som genomförts i MXCuBE användes för insamling av partiell diffraktion datamängder från små kristaller av Cerulean ligger på samma provhållare där visuell identifiering av kristaller var svårt. För att avskärma provhållaren, drogs ett rutnät över mitten av nätslingan och baserat på Dozer score heat map samlades 85 partiella diffraktionsdatauppsättningar in automatiskt. Dessa var individuellt integrerade sedan samman för att producera en datauppsättning med 99,8%fullständighet med en upplösning på 1,7 ångström.Som väntat kunde kristallstrukturen i Cerulean lösas genom molekylär ersättning med hjälp av den genererade datamängden. Efter förfining erhölls ett R-arbete på 22,8%och ett R fritt från 25,4%. Super position av den tidigare fastställda strukturen visar en global RMSD på c-alpha positioner på 0,1 ångström.För projekt där optimeringen av kristalltillväxtfasen ger MeshAndCollect möjlighet att få en komplett datamängd baserad på kombinationen av dessa amorfa partiella datamängder som erhållits från mindre kristaller. Denna teknik banade väg för strukturella biologer att lösa en struktur från delar prov där endast några tiondelar av mikrokristaller inte kunde produceras.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Undersökande Proteinsekvens-struktur-dynamik Förhållanden med Bio3D-webben

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rening av kloroplast Translocon proteinkomplex med taggen TAP

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturella studier av makromolekyler i lösningen med små Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondera strukturen och dynamiken i Nucleosomes med hjälp av Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enda Liposom mätningar för studien av Proton-pumpning membran enzymer med elektrokemi och fluorescerande mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifierade proteiner med fluorescerande Sumo-fångst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Bedömning av cellulär oxidation med hjälp av ett subcellulärt fackspecifikt Redox-sensitive green fluorescerande protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...