Name: optimized interferon-gamma elispot assay to measure t cell responses in the guinea pig model after vaccination
Uploaded: 2019-01-20T12:30:00
Duration: 8 min 13 s
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हम उत्कृष्टता पशुपालन सेवा प्रदान करने के लिए Acculab की तकनीकी सहायता और स्टाफ के लिए Inovio फार्मास्यूटिकल्स आर & डी विभाग के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा । विशेष रूप से हम पांडुलिपि को ठीक करने के लिए Alysha नजरों से देख और जो एग्नेस शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम वित्त पोषण एजेंसियों से किसी भी विशिष्ट अनुदान द्वारा वित्त पोषित नहीं था सार्वजनिक, वाणिज्यिक, या नहीं के लिए लाभ क्षेत्रों ।

यहां बताए गए सभी तरीकों को Acculab की एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी (ACUC) ने मंजूरी दे दी है ।
नोट: प्रोटोकॉल संभावित खतरनाक सामग्री के उपयोग की आवश्यकता है । कृपया निर्माता के MSDS को देखें और प्रक्रिया के दौरान उचित व्यक्तिगत उपकरण (पीपीई) पहनें ।
1. गिनी-पिग प्रतिरक्षण स्थल, intradermal Mantoux-इंजेक्शन और CELLECTRA-3P-EP-प्रक्रिया की तैयारी
<ol><li>
गिनी पिग पर उपचार स्थल की तैयारी ।
	<ol>
<li>एक प्रेरण कक्ष में गिनी पिग प्लेस और 5% Isoflurane-वाष्प पर anaesthetize ।</li>
		<li>स्थिति में कक्ष और जगह नाक शंकु से पशु निकालें, 2% Isoflurane भाप प्रदान करने के लिए प्रक्रिया भर में संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए ।</li>
		<li>पेट के पार्श्व पर लगभग 4 सेमी2 की दाढ़ी क्षेत्र ।</li>
		<li>इथेनॉल-झाड़ू के साथ संक्रमित मुंडा क्षेत्र.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
pDNA के इंजेक्शन-तैयार करने और electroporation प्रक्रिया ।
	<ol>
<li>Mantoux तकनीक द्वारा dermis में १०० µ एल तैयार करने के लिए एक इंसुलिन-सिरिंज का प्रयोग करें । सुई बेवल डाला है जानवर के शरीर के साथ एक 10 डिग्री के कोण पर ।</li>
		<li>सुई निकालें और तुरंत CELLECTRA ®-3P इलेक्ट्रोड सरणी इंजेक्शन-wheal भर में डालें और बिजली के क्षेत्र लागू होते हैं ।</li>
		<li>संज्ञाहरण से पशु निकालें और इसकी वसूली की निगरानी ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. गैर टर्मिनल भरो
<ol><li>
anaesthetized गिनी पिग की jugular नस से रक्त संग्रह ।
	<ol>
<li>एक प्रेरण कक्ष में गिनी पिग प्लेस और anaesthetize पशु के रूप में 1.1.1 में वर्णित</li>
		<li>एक 27G 1/2inch सुई के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करना, anaesthetized जानवर की jugular नस में विराम और रक्त के 3 मिलीलीटर इकट्ठा ।</li>
		<li>तुरंत K2EDTA रक्त संग्रह ट्यूब, पलटन ट्यूब में रक्त विरोधी कौयगुलांट और बर्फ पर जगह के साथ रक्त मिश्रण करने के लिए कई बार स्थानांतरण । नोट: रक्त के थक्के से बचाव के सफल बहाव के प्रसंस्करण के लिए रक्त के नमूने के लिए महत्वपूर्ण है ।</li>
		<li>पशुओं की वसूली पर नजर रखें ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. रक्त नमूना प्रसंस्करण
<ol><li>
घनत्व-ढाल केंद्रापसारक द्वारा पूरे रक्त से PBMCs की जुदाई
	<ol>
<li>है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ रक्त 1:1 पतला । नोट: संदूषण से बचने के लिए यहां से सभी काम पर एक अपूतित तकनीक लागू करने के लिए एक सुरक्षा के मंत्रिमंडल में किया जाना चाहिए ।</li>
		<li>एक 15 मिलीलीटर-शंकु ट्यूब में ४.५ मिलीलीटर Ficoll-Paque प्लस से अधिक धीरे खून पतला परत । इंटरफेस की अशांति से बचें । नोट: उचित जुदाई सुनिश्चित करने के लिए, Ficoll-Paque कमरे के तापमान पर होना चाहिए ।</li>
		<li>बंद के साथ 30 मिनट के लिए ८०० आरसीएफ पर ट्यूब केंद्रापसारक । नोट: एक विकल्प के रूप में, SepMate ™ ट्यूबों (STEMCELL टेक्नोलॉजीज) PBMC-जुदाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । HBSS-पतला रक्त ३.५ मिलीलीटर Ficoll-Paque प्लस से भरा 15 मिलीलीटर SepMate ट्यूब में जोड़ा जाता है और फिर 10 मिनट के लिए १२०० आरसीएफ में केंद्रापसारक (पर ब्रेक) । इस समय समान व्यवहार्यता में ढाल केंद्रापसारक तकनीक परिणाम की बचत, कोशिका उपज और जगह-गठन ।</li>
		<li>हार्वेस्ट Buffy-कोट परत और R10 मध्यम में पतला (10% (v/v) ताप-निष्क्रिय FBS और 1% (v/v) पेन/Strep में RPMI1640 मीडियम) की कुल मात्रा को 15 मि.</li>
		<li>5 मिनट के लिए ४५० आरसीएफ पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं ।</li>
		<li>R10 माध्यम से दो बार कोशिकाओं को धो लें ।</li>
		<li>1 मिलीलीटर R10 और पास सेल-निलंबन के माध्यम से ७० µm सेल-एक नई ट्यूब में छलनी में कोशिकाओं को फिर से निलंबित ।</li>
		<li>कोशिकाओं गिनती और Trypan द्वारा जीवित कोशिकाओं की संख्या निर्धारित-ब्लू धुंधला ।</li>
		<li>R10 माध्यम के साथ कोशिकाओं को पतला 1x10 की एकाग्रता के लिए ^ 6 जी कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ELISpot-प्लेट्स और सेल-उत्तेजना की तैयारी
<ol><li>
कोट और एक ९६ के ब्लॉक कुओं-अच्छी तरह से ELISpot PVDF-झिल्ली प्लेट PBMCs बोने से पहले ।
	<ol>
<li>प्लेटें ६० सेकंड के लिए पूर्व इलाज किया जाना चाहिए । इथेनॉल पूर्व उपचार कम विशिष्ट स्थान-गठन और बेहतर परिभाषा के साथ स्पॉट में परिणाम होगा । नोट: अतिरिक्त ध्यान रखना सुनिश्चित करने के लिए पूरा झिल्ली 15 µ एल ३५% इथेनॉल के साथ संपर्क में आता है ।</li>
		<li>६० सेकंड के बाद अच्छी तरह से प्रति १५० µ एल 1x पंजाबियों जोड़ने के लिए, और फिर प्लेटों औंधा द्वारा कुओं को खाली । नोट: इथेनॉल पूर्व उपचार बहुत समय के प्रति संवेदनशील है । अच्छी तरह से-झिल्ली नहीं गर्मी ६० sec. झिल्ली की प्रक्रिया के बाद निंनलिखित चरणों के दौरान बाहर शुष्क नहीं होना चाहिए ।</li>
		<li>धो प्लेटें अच्छी तरह से प्रति २५० µ एल 1x पंजाबियों के साथ तीन बार ।</li>
		<li>कोट के साथ १०० µ l/5 µ g/एमएल के अच्छी तरह से कब्जा विरोधी गिनी पिग IFN-γ एंटीबॉडी वी-E4 में पंजाबियों.</li>
		<li>4 डिग्री सेल्सियस से कम 12 बजे के लिए मशीन प्लेटें</li>
		<li>२५० µ l/अच्छी तरह से पंजाब तीन बार जोड़कर प्लेटें धो लें ।</li>
		<li>जोड़ें २०० µ एल/अच्छी तरह से अवरुद्ध बफर (10% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज और 2% (डब्ल्यू/वी) BSA में) और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए मशीन ।</li>
		<li>२५० µ एल के साथ प्लेटें धो/</li>
	</ol>
</li>
	<li>
प्लेट PBMCs antigen-विशिष्ट पेप्टाइड्स, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ ।
	<ol>
<li>R10 में प्रोटीन पेप्टाइड पूल वांछित अंतिम पेप्टाइड एकाग्रता को पतला ।</li>
		<li>परख triplicates में नमूना PBMCs । नोट: पहले ELISpot प्लेटों के लिए उत्तेजक के साथ मध्यम जोड़ें और PBMC निलंबन दूसरा जोड़ें ।</li>
		<li>संकेत कुओं के लिए पेप्टाइड-R10 माध्यम के ५० µ एल जोड़ें ।</li>
		<li>नकारात्मक नियंत्रण के लिए जोड़ें ५० µ एल R10 में खाली पेप्टाइड निर्माण संकेत कुओं में ।</li>
		<li>सकारात्मक नियंत्रण के लिए संकेत कुओं में R10 माध्यम में 5 µ जी/एमएल Concanavalin ए (ConA) जोड़ें ।</li>
		<li>PBMC सेल के १०० µ l को जोड़ें-सभी कुओं को सस्पेंशन</li>
		<li>18 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर humidified 5% सीओ 2 वायुमंडल में मशीन प्लेट । नोट: एक भी सतह पर प्लेस ELISpot प्लेटें/मशीन में रैक और मशीन समय के दौरान प्लेटों के किसी भी अशांति से बचें ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. इंटरफेरॉन-गामा सकारात्मक धब्बे का पता लगाने
<ol><li>
पता लगाने एंटीबॉडी और थाली विकास के साथ मशीन । नोट: इस खंड में सभी चरणों के लिए कोई अपूतित तकनीक की आवश्यकता है ।
	<ol>
<li>ध्यान से मशीन से प्लेटें हटाने, और सुरक्षित रूप से खाली कुओं । तीन बार के लिए २५० µ एल/अच्छी तरह से पंजाबियों जोड़कर प्लेटें धो लें ।</li>
		<li>जोड़ें १०० µ एल के/अच्छी तरह से 2 µ जी/एमएल biotinylated डिटेक्शन विरोधी गिनी पिग IFN-γ एंटीबॉडी एन G3 अवरुद्ध बफर में पतला । नोट: पृष्ठभूमि को कम करने के लिए फ़िल्टर (22 µm) एंटीबॉडी समाधान ।</li>
		<li>कमरे के तापमान पर 2 बजे के लिए पता लगाने एंटीबॉडी के साथ मशीन ।</li>
		<li>supernatant को छोड़ दें और २५० µ l/अच्छी तरह से पंजाब तीन बार जोड़कर प्लेटें धो लें ।</li>
		<li>जोड़ें १०० µ एल/अच्छी तरह से alkaline फॉस्फेट (ALP)-संयुग्मित streptavidin बफर अवरुद्ध में पतला । नोट: पृष्ठभूमि को कम करने के लिए फ़िल्टर (22 µm) समाधान.</li>
		<li>कमरे के तापमान पर 1 hr के लिए ALP-Streptavidin संयुग्मी के साथ मशीन ।</li>
		<li>ALP-Streptavidin समाधान छोड़ें और प्लेटों को जोड़कर धो लें २५० µ l/खैर पंजाब दो बार, और प्लेट को पलटने से अतिरिक्त पंजाबियों को हटाने और एक साफ कागज तौलिया के खिलाफ सोख्ता ।</li>
		<li>२५० µ को जोड़कर प्लेटें धोएं l/अच्छी तरह से UltraPure DI पानी एक बार, और प्लेट को पलटने से अतिरिक्त पानी निकालें और इसे एक साफ कागज तौलिया के खिलाफ सोख्ता ।</li>
		<li>Add १०० µ l of BCIP/एनबीटी (सावधानी) सब्सट्रेट समाधान में एक अच्छी तरह से. चेतावनी: BCIP/एनबीटी अत्यधिक ज्वलनशील और विषाक्त अगर निगल लिया, त्वचा के साथ संपर्क में है, या साँस । उपयोग करने से पहले MSDS को देखें ।</li>
		<li>प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन ।</li>
		<li>थाली कुल्ला पानी के साथ 4 बार । प्लेट पलटना और अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए टैप करें ।</li>
		<li>ELISpot प्लेटों के नीचे से प्लास्टिक की निकासी निकालें और प्लेटें सूखी अनुमति देते हैं ।</li>
		<li>धब्बों को मैंयुअल रूप से या एक स्वचालित ELISpot रीडर का उपयोग करके, उदाहरण के लिए CTL-Immunospot S6 प्लेट रीडर ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Laddy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+protection+against+pathogenic+human+and+avian+influenza+viruses+via+in+vivo+electroporation+of+synthetic+consensus+DNA+antigens.">Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens.</a> PloS One. 3 (6), 2517 (2008).</li><li>Lee, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+immunobiology+of+human+skin+and+functional+specialization+of+skin+dendritic+cell+subsets+to+innovate+intradermal+vaccination+design.">Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+prototype+device+for+electroporation-enhanced+DNA+vaccine+delivery+simultaneously+to+both+skin+and+muscle.">A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle.</a> Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).</li><li>Laddy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+synthetic+DNA+antigens+offers+protection+in+nonhuman+primates+challenged+with+highly+pathogenic+avian+influenza+virus.">Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus.</a> Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Electroporation-Enhanced+Intradermal+Delivery+of+DNA+Vaccine+Using+a+Minimally+Invasive+Surface+Device.">Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).</li><li>Kichaev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+mediated+DNA+vaccination+directly+to+a+mucosal+surface+results+in+improved+immune+responses.">Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).</li><li>Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+reactions+of+CD4-+and+CD8-positive+T+cell+subpopulations+in+spleen+and+lymph+nodes+of+guinea+pigs+after+vaccination+with+Bacillus+Calmette+Guerin.">Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin.</a> Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).</li><li>Shedlock, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Broad+Cytotoxic+T+Cells+by+Protective+DNA+Vaccination+Against+Marburg+and+Ebola.">Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola.</a> Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).</li><li>Hensel, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Herpes+Simplex+Virus+2+(HSV-2)+Vaccines+Adjuvanted+with+Stable+Emulsion+and+Toll-Like+Receptor+9+Agonist+Induce+a+Robust+HSV-2-Specific+Cell-Mediated+Immune+Response,+Protect+against+Symptomatic+Disease,+and+Reduce+the+Latent+Viral+Reservoir.">Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02257 (2017).</li></ol>

लेखक कैथरीन Schultheis, होली एम Pugh, ब्रायन एस युंग, जेनेट ओह, होली एम. Pugh, Jacklyn गुयेन, लौरेंत Humeau, केट ई. Broderick, और ट्रेवर R.F. Smithare और Inovio फार्मास्यूटिकल्स के कर्मचारियों के रूप में ऐसे वेतन और लाभ प्राप्त करने के स्वामित्व सहित, स्टॉक और स्टॉक विकल्प, कंपनी से ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित इंटरफेरॉन-गामा (IFN-γ) का पता लगाने परमिट एक परिधीय रक्त mononuclear कोशिका (PBMC) Hartley गिनी सूअरों से काटा गया antigen याद करने के बाद कोशिकाओं स्रावित । हम परख के लिए आवेदन किया है कैनेटीक्स और प्रतिजन के परिमाण-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं के लिए एक इंफ्लूएंजा टीकाकरण गिनी पिग में आहार । हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल काफी इस उच्च प्रासंगिक पशु मॉडल में टीकाकरण कार्यक्रमों के पूर्व नैदानिक विकास प्रेरित करेंगे ।
टी टीके द्वारा बटोरी गई कोशिकाओं संक्रामक एजेंटों और immunotherapeutic अंय रोगों के साथ जुड़े रास्ते के खिलाफ संरक्षण में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं । टी कोशिकाओं के महत्व को कई वैक्सीन अध्ययन में डाला गया है । एक प्लाज्मिड डीएनए के साथ ferrets और चूहों का प्रतिरक्षण (pDNA) H5 hemagglutinin और N1 neuraminidase के लिए एंकोडिंग एक इंफ्लूएंजा वायरस चुनौती में रुग्णता और मृत्यु से एंटीबॉडी बेअसर के अभाव में सुरक्षा प्रदान की, के महत्व का संकेत टी सेल उन्मुक्ति1. मजबूत विनोदी प्रतिक्रिया को बेअसर करने के अलावा, टी कोशिकाओं न केवल वायरल मंजूरी2 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, लेकिन यह भी चूहों में श्वसन syncytial वायरस (RSV) के साथ संक्रमण से सुरक्षा3. मनुष्यों में, पूर्व मौजूदा सीडी 8 + टी कोशिकाओं २००९4में H1N1 महामारी के दौरान कम रोग गंभीरता के साथ जुड़े थे । CD4 + टी कोशिका एक साथ कुछ cytokine प्लाज्मा एकाग्रता के साथ गिना जाता है RSV-संक्रमित बच्चों में रोग गंभीरता के साथ संबंधित हैं5.
गिनी पिग इस तरह के त्वचा संवेदीकरण के रूप में चिकित्सा के विभिंन क्षेत्रों में अनुसंधान और विकास के लिए एक प्रयोगशाला मॉडल के रूप में प्रसिद्धि प्राप्त की है, पोषण अनुसंधान, श्रवण प्रणाली के अध्ययन और, इस काम के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक, संक्रामक रोगों । यह तपेदिक और डिप्थीरिया के खिलाफ टीके की खोज के लिए महत्वपूर्ण था । हाल ही में गिनी पिग इंफ्लूएंजा6 और Ebola7के लिए एक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है । इसके अलावा, मानव त्वचा के लिए शारीरिक समानताएं रखने8, गिनी पिग चमड़े की दवा वितरण विधियों के लिए एक सुलभ छोटे जानवर मॉडल प्रदान करता है । एक प्रयोगशाला मॉडल के रूप में अपने महत्व के विपरीत, गिनी पिग विशिष्ट परख और जांच की उपलब्धता के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं विशेषताएं9सीमित रहता है । ऐसे IFN के रूप में बुनियादी सेलुलर परख-γ एंजाइम से जुड़े immunospot (ELISpot-परख) है कि नियमित रूप से पूर्व में प्रयोग किया जाता है नैदानिक और नैदानिक अनुसंधान टी सेल प्रतिक्रियाओं की गणना करने के लिए उपलब्ध नहीं किया गया है ।
पहली ठोस चरण एंजाइम से जुड़े immunospot परख के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की संख्या में एक विविध बी सेल में गुप्त कोशिकाओं-जनसंख्या10,11निर्धारित किया गया । प्रारूप साइटोकिंस के आईएल-1, आईएल-2, आईएल-4, आईएल-5, आईएल-6, आईएल-10, जीएम-सीएसएफ, TNF-अल्फा, TNF-बीटा, granzyme बी, और IFN-γ सहित स्रावित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उन्नत किया है । ELISpot परख उच्च संवेदनशीलता के पास; संभावित रूप से प्रत्येक cytokine-उत्पादक सेल का पता लगाया जा सकता है । ELISpot परख के लिए पता लगाने की सीमा १००,००० PBMCs12प्रति 10 स्थानों से कम होना बताया गया है । हाल ही में एक गिनी-पिग IFN-γ विशिष्ट एंटीबॉडी जोड़ी13उपलब्ध कराया गया था, और इस क्षेत्र में इस कमी को हल करने का अवसर खुल गया है ।
IFN-γ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण प्रभाव अणु माना जाता है; यह उत्पादन किया जा सकता है और सक्रियण पर दोनों CD4 और सीडी 8 टी कोशिकाओं द्वारा स्रावित । IFN-γ एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के संदर्भ में जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला है एक वायरस संक्रमण के लिए, मैक्रोफेज के सक्रियकरण और प्रमुख histocompatibility परिसर (MHC) मैं और MHCII अभिव्यक्ति के ऊपर विनियमन के रूप में । यह भी बी सेल भेदभाव को बढ़ावा देता है, टी सहायक-2 सेल विकास को रोकता है, और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं को सक्रिय करता है । IFN-γ ब्लॉक संक्रमित दैहिक कोशिकाओं में वायरल प्रतिकृति और MHC अणुओं की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है । इस प्रकार, IFN-γ का उत्पादन एक टीका या रोगज़नक़ के लिए टी सेल प्रतिक्रिया की गुणवत्ता का एक बहुत ही महत्वपूर्ण संकेत है ।
यहाँ प्रस्तुत IFN का एक महत्वपूर्ण पहलू है-γ ELISpot१३splenocytes के बजाए PBMCs का प्रयोग है. PBMCs एक गैर टर्मिनल एकत्र रक्त नमूना प्रसंस्करण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जबकि splenocytes के संग्रह तिल्ली की कटाई से पहले पशु euthanization की आवश्यकता है । PBMCs का उपयोग सक्षम बनाता है IFN-γ टी-सेल प्रतिक्रियाओं के समय की अवधि पर नजर रखने के लिए और प्रधानमंत्री के रूप में टी-सेल प्रतिक्रियाओं पर प्रभाव का मूल्यांकन-बढ़ावा14.
शोधकर्ताओं जो वर्तमान में एक पशु मॉडल के रूप में गिनी पिग का उपयोग कर रहे है के लिए, IFN-γ ELISpot विधि वैज्ञानिक डेटा वे प्राप्त कर सकते है की सीमा को व्यापक होगा । इसकी उपलब्धता अब लक्ष्य रोग है, जो पहले सेलुलर प्रतिक्रियाओं की परीक्षा के लिए एजेंट की उपलब्धता के कारण चुना गया के लिए कम प्रासंगिक पशु मॉडलों के साथ अध्ययन करने की आवश्यकता को कम कर सकते हैं । तिल्ली या लिम्फ नोड्स के बजाय PBMCs का उपयोग गैर टर्मिनल प्रयोगों और व्यक्तिगत जानवरों की सतत निगरानी के लिए अनुमति देता है ।
नीचे हम एक IFN का पता लगाने में शामिल कदम का एक विस्तृत विवरण प्रदान-गिनी सूअर में γ सेलुलर प्रतिक्रिया pDNA वैक्सीन के लिए । हम अपने विशिष्ट वितरण प्रक्रिया रूपरेखा और सामांय ELISpot परख शामिल रक्त नमूना, रक्त प्रसंस्करण, PBMC फसल, परख प्रक्रिया, और डेटा विश्लेषण । ELISpot परख के एक योजनाबद्ध चित्र 1में दर्शाया गया है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig1.jpg"> चित्रा 1 : गिनी पिग ELISpot प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">Cellectra-3P</td>
			<td style="width:215px;">Inovio Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td style="width:167px;">ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&#38;D-only</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">K2EDTA blood collection tube</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td>367844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Plus</td>
			<td style="width:215px;">GE Healthacre&#160;</td>
			<td>17144003</td>
			<td>density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SepMate tube</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:192px;">85415</td>
			<td>PBMC-isolation device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">RPMI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heat-deactivated FBS&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:192px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:192px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:215px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:192px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well ELISpot PVDF-membrane&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Millipore</td>
			<td style="width:192px;">MSIPS4W10</td>
			<td>ELISpot assay plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td>459844-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">UPDI</td>
			<td style="width:215px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:192px;">10977-015</td>
			<td>Ultra-Pure DI water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:192px;">S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:192px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">10x PBS</td>
			<td style="width:215px;">HyClone</td>
			<td style="width:192px;">SH30378.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Concanavalin A (ConA)&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td>C5275-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems Inc.&#160;</td>
			<td style="width:192px;">SEL002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCIP/NBT&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems Inc.&#160;</td>
			<td style="width:192px;">SEL002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">capture anti-guinea pig IFN-&#947; antibody V-E4</td>
			<td style="width:215px;">GenScript</td>
			<td style="width:192px;">Order #:U5472CE080-3</td>
			<td>LOT # A217071153</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biotinylated detection anti-guinea pig IFN-&#947; antibody N-G3&#160;</td>
			<td style="width:215px;">GenScript</td>
			<td style="width:192px;">Order #:U5472CE080-1</td>
			<td>LOT # A21700598</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">CTL S6 Micro Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot</td>
			<td>#S6MIC12</td>
			<td>automated ELISpot plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">Vi-CELL XR</td>
			<td style="width:215px;">Beckman-Coulter</td>
			<td align="right" style="width:192px;">731050</td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">ImmunoSpot 5.1</td>
			<td style="width:215px;">ImmunoSpot</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>assay analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">ESCO Class II Type A2</td>
			<td style="width:215px;">ESCO</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>Biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon cell strainer</td>
			<td style="width:215px;">Corning, Inc.</td>
			<td>VWR cat# 21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exel Comfort Point Insulin syringe</td>
			<td style="width:215px;">MedLab Supply&#160;</td>
			<td align="right" style="width:192px;">26028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">Rotanta 460R</td>
			<td style="width:215px;">Hettich</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">383722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">Incu Safe</td>
			<td style="width:215px;">Panasonic-Healthcare</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">22&#181;m Filter</td>
			<td style="width:215px;">ThermoScientific&#160;</td>
			<td style="width:192px;">VWR act# 597-4520</td>
			<td>22&#181;m Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KimWipes</td>
			<td style="width:215px;">Kimberly-Clark Professional&#160;</td>
			<td>VWR cat# 21903-005&#160;</td>
			<td>paper towels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized interferon-gamma elispot assay to measure t cell responses in the guinea pig model after vaccination

गिनी पिग ऐसे तपेदिक, इंफ्लूएंजा, डिप्थीरिया, और वायरल रक्तस्रावी बुखार के रूप में संक्रामक रोगों के लिए टीके के विकास में एक प्रासंगिक छोटे जानवर मॉडल के रूप में एक निर्णायक भूमिका निभाई है । हम प्रदर्शन किया है कि प्लाज्मिड-डीएनए (pDNA) त्वचा में वैक्सीन वितरण गिनी पिग में मजबूत विनोदी प्रतिक्रियाएं बटोरता है । हालांकि, इस जानवर का उपयोग करने के लिए मॉडल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कुछ हद तक सीमित था के कारण उपलब्ध एजेंट और प्रोटोकॉल की कमी के लिए टी सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन । टी कोशिकाओं immunoprophylactic और immunotherapeutic दोनों तंत्र में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं । टी सेल प्रतिक्रियाओं को समझना संक्रामक रोग और कैंसर विज्ञान टीकों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है और वितरण उपकरणों मिलनसार । यहां हम गिनी पिग परिधीय रक्त ELISpot कोशिकाओं (mononuclear) के लिए एक इंटरफेरॉन-गामा (IFN-γ) एंजाइम से जुड़े immunospot (PBMCs) परख का वर्णन करते हैं । परख इस महत्वपूर्ण कुतर मॉडल में वैक्सीन-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं की विशेषता के लिए शोधकर्ताओं को सक्षम बनाता है । परख परिधीय रक्त से अलग कोशिकाओं को करने की क्षमता को व्यक्तिगत पशुओं में immunogenicity ट्रैक अवसर प्रदान करता है ।

यहां प्रस्तुत परिणामों की उंमीद परिणामों के लिए एक संदर्भ के रूप में इस प्रोटोकॉल के उपयोग के बाद सेवा, महत्वपूर्ण कदम के महत्व पर बल और वर्णित अनुकूलन के लाभों की पुष्टि ।
के बाद घनत्व-ढाल केंद्रापसारक, प्रोटोकॉल के चरण ३.१ में वर्णित के रूप में, ट्यूब के तल पर लाल चिपचिपा तरल लाल रक्त कोशिकाओं के सबसे अधिक हो जाएगा । जैसा चित्र 2एमें दिखाया गया है, लाल रक्त कोशिकाओं के ऊपर घनत्व-मध्यम की एक परत है । शीर्ष पर स्पष्ट या पीले प्लाज्मा की एक परत और घनत्व ढाल माध्यम के बीच सफेद या हल्के भूरे रंग के buffy कोट परत है, जो सफेद रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेटों की सबसे शामिल है । अपूर्ण जुदाई घनत्व के शीर्ष पर लाल रक्त कोशिकाओं की उपस्थिति-ढाल माध्यम के रूप में प्रकट होता है । चित्रा 2एक में प्लाज्मा के लाल रंगाई सबसे शायद hemolysis के कारण है, के रूप में इस रक्त का नमूना संग्रह ट्यूब १.५ एच में संग्रहीत किया गया था पहले संसाधित किया जा रहा है । चित्रा 2 बी से पहले ढाल दिखाता है (बाएं) और के बाद (दाएं) PBMC-अलगाव डिवाइस में केंद्रापसारक । चित्रा 2बी में रक्त का नमूना रक्त संग्रह के बाद न्यूनतम देरी के साथ संसाधित किया गया था, और प्लाज्मा रंगाई पीला है.
इथेनॉल के साथ झिल्ली को पूर्व गीला करने का प्रभाव (प्रोटोकॉल के चरण ४.१ देखें) मौके पर विकास चित्रा 3में दिखाया गया है । पूर्व उपचारित कुओं में धब्बे बेहतर परिभाषा प्रदर्शित करते हैं, और मध्यम/DMSO नकारात्मक नियंत्रण वेल्स (चित्रा 3ए) में धब्बों की संख्या में कमी है । प्रसंस्कृत गिनी पिग PBMCs की विशिष्ट व्यवहार्यता ९०% के आसपास पर्वतमाला और दोनों नियमित रूप से 15 मिलीलीटर ट्यूबों और PBMC-अलगाव उपकरणों (चित्रा 3बी) के लिए समान है । एक 3 मिलीलीटर रक्त के नमूने से व्यवहार्य कोशिकाओं की उपज आमतौर पर 3 x 106 और 5 x 106के बीच पर्वतमाला ।
पशु प्लाज्मिड डीएनए के साथ प्रतिरक्षित थे nucleoprotein (NP) H1N1 इंफ्लूएंजा तनाव ए/PuertoRico8 के । चित्रा 4 टी-सेल IFN की गणना दिखाता है-γ एक टीकाकरण आहार की अवधि के पार उत्पंन स्थान बनाने इकाइयों (SFU) के रूप में प्रस्तुत प्रतिक्रियाओं । गैर प्रतिरक्षित पशुओं से काटा PBMCs के साथ ELISpot परख नगण्य स्थान गिनती (कोई tx) में परिणाम है । प्रथम प्रतिरक्षण (प्राइम) के चौदह दिन बाद, औसतन ९७० IFN-γ धब्बे प्रति लाख PBMCs immunogenic उत्तेजना के बाद गिने जाते थे. सात दिन द्वितीय प्रतिरक्षण (बूस्ट) के बाद, सभी तीन पूल के विरुद्ध टी-सेल प्रतिक्रियाओं का विस्तार किया गया, ५०२० IFN-γ SFUs/106 PBMCs के एक औसत तक पहुंचने के ४६ दिन बाद द्वितीय प्रतिरक्षण (मेमोरी) के औसत कुल ६३१० IFN-γ SFUs 10/ 6 PBMCs परिधीय रक्त में गिने जाते थे ।
चित्र लेजेंड:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig2.jpg"> चित्रा 2 : घनत्व के बाद परतों के प्रतिनिधि छवियां-ढाल केंद्रापसारक । (एक) रक्त के नमूने से पहले (बाएं) और के बाद (सही) नियमित ट्यूबों में केंद्रापसारक । (ख) रक्त के नमूने से पहले (बाएं) और बाद (दाएं) PBMC-अलगाव उपकरणों में केंद्रापसारक । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig3.jpg"> चित्रा 3 : प्रोटोकॉल का अनुकूलन । (एक) IFN की विशिष्ट उपस्थिति-एक ELISpot परख प्लेट में γ सकारात्मक धब्बे अच्छी तरह से प्रोटोकॉल के अनुसार विकसित की है । उदाहरण तपसिल कुओं के बाद इथेनॉल के साथ पूर्व उपचार (सही) या पूर्व उपचार के बिना (बाएं) दिखाया जाता है । कक्ष या तो DMSO (ऊपर) के साथ कोई उत्तेजना नियंत्रण, प्रतिजन मिलान पेप्टाइड्स (मध्य), या mitogen ConA (नीचे) के रूप में रात भर की मशीन थे । PBMCs एक ही व्यक्ति जानवर से उत्पंन । वेल्स एक स्वचालित प्लेट-स्कैनर का उपयोग कर छवि थे । (ख) प्रसंस्कृत कोशिकाओं पर विभिन्न घनत्व-ढाल ट्यूबों की तुलना. 3 व्यक्तिगत गिनी सूअरों से रक्त के नमूनों की 3 मिलीलीटर एकत्र किए गए । प्रत्येक नमूने के १.५ मिलीलीटर या तो नियमित ट्यूबों (घनत्व ढाल माध्यम) या PBMC-अलगाव उपकरणों का उपयोग कर संसाधित किया गया । व्यवहार्यता (छोड़ दिया,% ± sem) और जीवित कोशिकाओं की संख्या (ठीक है, x 106 ± SEM) एक स्वचालित सेल गिनती प्रणाली और trypan-नीले अपवर्जन परख का उपयोग कर निर्धारित किया गया । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig4.jpg"> चित्र 4 : एक टीकाकरण आहार के पाठ्यक्रम पर मजबूत सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का पता लगाने । दिनों पर 1 और 15, pDNA एंकोडिंग इंफ्लूएंजा के 30 µ जी एक nucleoprotein (एनपी) दिया था इंट्रा-चमड़े का Hartley गिनी सूअरों के पेट के पार्श्व में तुरंत त्वचा के बाद electroporation । IFN-γ ELISpot रिस्पांस पहले प्रतिरक्षण (प्रधानमंत्री) के 14 दिनों के बाद मापा गया था, और दूसरे प्रतिरक्षण के बाद 7 दिन (बूस्ट) और ४६ दिन (मेमोरी). मतलब SFUs + SEM 5 इलाज गिनी सूअर और 2 अनुपचारित गिनी सूअर (कोई tx) के लिए साजिश रची गई । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

गिनी पिग PBMCs के लिए इंटरफेरॉन-गामा ELISpot परख के विकास के संक्रामक रोगों का अध्ययन करने के लिए इस बेहद प्रासंगिक मॉडल में टी-सेल प्रतिक्रियाओं के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है । हम टी सेल डीएनए टीके के intradermal वितरण के साथ जुड़े प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए परख लागू किया है ।

टीकाकरण के बाद गिनी पिग मॉडल में टी सेल प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए अनुकूलित इंटरफेरॉन-गामा ELISpot परख

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

अतीत में गिनी पिग मॉडल में इम्यूनोथेरपीटिक्स का लक्षण वर्णन विनोदी प्रतिरक्षा को मापने तक सीमित था। ELISpot परख है कि सीमा पर काबू पा और यह शोधकर्ताओं को मदद मिलेगी कि पशु मॉडल में और अधिक सार्थक डेटा उत्पन्न करने के लिए । इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि कोशिकाओं को परिधीय रक्त से प्राप्त किया जाता है।किसी नेक्रॉप्सी की आवश्यकता नहीं है। यह न सिर्फ परिमाण के मापन के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक प्राकृतिक संक्रमण के दौरान या एक टीका आहार भर में व्यक्तिगत गिनी सूअरों में टी सेल प्रतिक्रियाओं की गतिज । प्रक्रिया का प्रदर्शन होली Pugh होगा ।वह इनोवियो के प्रीक्लिनिकल आर और डी डिपार्टमेंट से रिसर्च एसोसिएट हैं । एक ELISpot परख प्लेट के प्रत्येक कुएं में 35% इथेनॉल के 15 माइक्रोलीटर जोड़ना शुरू करने के लिए। 60 सेकंड के बाद प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें।और इथेनॉल प्रीट्रीटमेंट को रोकने के लिए प्लेट को उलट दें। संदूषण से बचने या झिल्ली को नुकसान पहुंचाने के लिए ELISpot परख प्लेटों को संभालते समय भी बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए। प्लेट को धोने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें।दो बार धोने को दोहराने के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से एंटी-गिनी पिग इंटरफेरॉन इंटरफेरॉन गामा एंटीबॉडी VE4 कैप्चर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर थाली को कम से कम 12 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन अवधि के बाद प्लेटों को तीन बार धोएं।प्रत्येक अच्छी तरह से बफर को अवरुद्ध करने के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट। इसके बाद प्लेट्स को तीन बार और धोएं।कमरे के तापमान घनत्व ढाल माध्यम के 4.5 मिलीलीटर के साथ शंकु ट्यूब तैयार करें। फिर रक्त के साथ हैंक्स संतुलित नमक समाधान की एक समान मात्रा मिलाएं। घनत्व ढाल माध्यम पर धीरे-धीरे पतला रक्त परत, इंटरफेस परेशान करने के लिए नहीं ध्यान दे रही है।इसके बाद, कमरे के तापमान पर ब्रेक के बिना 30 मिनट के लिए 800 x g पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। परतों को परेशान न करने का ध्यान रखते हुए अपकेंद्रित्र से ट्यूब निकालें। परतों की सही ढंग से पहचान करने के बाद पीबीएमसी की फसल के लिए पूर्ण बफी कोट परत को एस्पिरेट करें।धीरे-धीरे घनत्व ढाल माध्यम पर एचबीएसएस पतला रक्त परत। ट्यूब की किसी भी गड़बड़ी से बचें और सेंट्रलाइज ब्रेक बंद कर दें। कोशिकाओं को एक नई 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।फिर R10 माध्यम में कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर की कुल मात्रा में पतला करें। कोशिकाओं को गोली लगाने के बाद, सुपरनैंट को त्यागें और कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर R10 माध्यम में फिर से खर्च करें। एक नई ट्यूब में एक 70 माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन पास करें।कोशिकाओं की गणना करें और ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन परीक्षण के साथ जीवित कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें। फिर R10 माध्यम के साथ कोशिकाओं को पतला। सबसे पहले ब्लॉकिंग बफर को हटाएं और प्लेट्स को धो लें।प्रत्येक पीबीएमसी नमूने के लिए सकारात्मक नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण, और प्रत्येक प्रयोग-विशिष्ट उत्तेजक के ट्रिपलीकेट्स इंगित करते हैं। R10 माध्यम में प्रोटीन पेप्टाइड पूल को तीन गुना वांछित अंतिम एकाग्रता से पतला करें। इसके बाद प्लेट के उत्तेजक परीक्षण कुओं में पेप्टाइड आर10 मध्यम मिश्रण के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें।फिर प्लेट के नकारात्मक नियंत्रण कुओं में R10 माध्यम में एमटी पेप्टाइड फॉर्मूलेशन के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। थाली के सकारात्मक नियंत्रण कुओं के लिए R10 माध्यम में ConA जोड़ें, तो कुओं के सभी के लिए PBMC निलंबन के १०० माइक्रोलीटर जोड़ें । एलिस्पॉट प्लेट को इनक्यूबेटर में एक भी सतह पर रखें और इनक्यूबेशन अवधि के दौरान प्लेट को परेशान करने से बचें।ध्यान से इनक्यूबेटर से प्लेट हटाने के बाद, सुपरनेट को हटाने के लिए प्लेट को उलटें। इसके बाद थाली को तीन बार धोएं। पतला बायोटिनाइलेटेड डिटेक्शन कैप्चर एंटी-गिनी पिग इंटरफेरॉन गामा एंटीबॉडी एन-जी 3 के 100 माइक्रोलीटर प्रत्येक कुएं में जोड़ें।फिर दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट। एंटीबॉडी सॉल्यूशन को हटाने के लिए प्लेट को उलटें और वॉश को तीन बार दोहराएं। प्लेट से पीबीएस को हटाने के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से बफर को अवरुद्ध करने में पतला एएलपी कंजूस स्ट्रेप्टाविडिन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।फिर एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट। प्लेट को उलटें एएलपी स्ट्रेप्टाविडिन घोल को त्यागने के लिए और प्लेट को दो बार धोएं। थाली उलटा और यह एक साफ कागज तौलिया के खिलाफ दाग किसी भी अतिरिक्त PBS को दूर करने के लिए ।इसके बाद प्लेट को अल्ट्रापुरे डीआई पानी के 250 माइक्रोलीटर के साथ अच्छी तरह से धोएं। थाली को उलटें और साफ कागज के तौलिये से अतिरिक्त पानी निकाल लें। इसके बाद प्रत्येक कुएं में बीसीआईपी/एनबीटी सब्सट्रेट समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।प्रकाश से सुरक्षित 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। डीआई के पानी से चार बार थाली कुल्ला। इसके बाद उलटा और अतिरिक्त पानी निकालने के लिए प्लेट पर टैप करें।अंत में, प्लेट के नीचे से प्लास्टिक जल निकासी को हटा दें और झिल्ली को पूरी तरह से सूखने दें। सफल घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र के बाद जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था, ट्यूब के तल पर लाल चिपचिपा तरल में अधिकांश लाल रक्त कोशिकाएं होनी चाहिए। बफी कोट परत प्लाज्मा की परत और घनत्व ढाल माध्यम के बीच है।कब्जा एंटीबॉडी जोड़ने से पहले कुओं का पूर्वउतापीकरण, परख नकारात्मक नियंत्रण कुओं में अविशिष्ट स्थानों की संख्या में कमी के साथ सुधार परिभाषा प्रदर्शित की । स्पॉट पीबीएमसी आबादी के भीतर टी-सेल का उत्पादन करने वाले इंटरफेरॉन गामा के संकेत हैं। इस तकनीक का प्रयास करते समय, रक्त को ध्यान से लेकिन जल्दी से संसाधित करना याद रखना महत्वपूर्ण है।इससे सेल व्यवहार्यता में सुधार होगा, स्पॉट गठन में सुधार होगा, और गैर-विशिष्ट स्थानों के गठन को कम किया जा सकेगा। यह न भूलें कि रक्त और बीपीआईपी/एनबीटी सब्सट्रेट के साथ काम करना खतरनाक हो सकता है और इस प्रक्रिया को करते समय उचित पीपीई पहनने जैसी सावधानियां हमेशा बरती जानी चाहिए । मेरा मानना है कि यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को टीबी, इबोला और एचएसवी जैसे महत्वपूर्ण टी-सेल घटक के साथ बीमारियों का अध्ययन करने की अनुमति देता है ।महत्वपूर्ण बात यह है कि यह गिनी पिग मॉडल में वैक्सीन प्रोटोकॉल के विकास को परिष्कृत करेगा और इससे कम प्रासंगिक पशु मॉडलों का उपयोग कम हो जाएगा ।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

एनजाइम से जुड़े Immunospot (ELISPOT) परख: TH-1 माइक्रोबियल प्रतिजनों के खिलाफ सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की मात्रा

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

माउस टी कोशिकाओं में टी सेल रिसेप्टर्स की रेट्रोवायरल transduction

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

इन विट्रो परख में एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी सेल effector समारोह पर immunoregulatory रास्ते के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

टी सेल प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए फ्लोरोसेंट लक्ष्य सारणियों का प्रयोग करें<em&gt; में विवो</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

चूहे में allogeneic सीडी 4 टी सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए तेल त्वचा का प्रत्यारोपण

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

माउस भोले सीडी 4<sup&gt; +</sup&gt; टी सेल अलगाव और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; टी सेल सबसेट में भेदभाव

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Nanoparticle के टीकाकरण के बाद के विश्लेषण से प्रतिजन विशेष CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया के लिए पूरे पशु इमेजिंग और प्रवाह cytometric तकनीकों

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Vivo में एक टीकाकरण मॉडल का उपयोग कर प्रतिजन-विशिष्ट टी-सेल Cytolytic फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए परख

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Vivo में मानव टी सेल याद प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक चूषण छाला प्रोटोकॉल

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...