Name: optimized interferon-gamma elispot assay to measure t cell responses in the guinea pig model after vaccination
Uploaded: 2019-01-20T12:30:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить членов Inovio фармацевтической R & D Департамента по оказанию технической помощи и сотрудников Acculab для обслуживания животноводства передового опыта. В частности мы хотели бы поблагодарить Алиша Vu и Джо Агнес для корректуры рукопись. Эта работа финансировалась не каких-либо конкретных грант от финансирующих учреждений в государственных, коммерческих, или не для некоммерческих секторах.

Все методы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование Комитета (ACUC) Acculab.
Примечание: Протокол требует использования потенциальных опасных материалов. Пожалуйста, обратитесь к MSDS производителя и носить надлежащего личного оборудования (СИЗ) на протяжении всей процедуры.
1. Подготовка сайта иммунизации-свинка, внутрикожные инъекции Манту и CELLECTRA-3P-EP-процедура
<ol><li>
Подготовка сайта лечения на морской свинки.
	<ol>
<li>Морская свинка в камеру всасывание и обезболивают в 5% изофлюрановая пара.</li>
		<li>Удаление животных из камеры и место носовой конус в положении, обеспечивая 2% изофлюрановая паров для поддержания анестезии во всей процедуре.</li>
		<li>Бритье области приблизительно 4 см2 на брюшной фланге.</li>
		<li>Продезинфицируйте бритая области этанола-тампоном.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Инъекции pDNA разработка и электропорации процедуры.
	<ol>
<li>Используйте инсулин шприц для вставки 100 мкл формулировка в дерму методом Манту. Игла вводится наклонной вверх на угол 10 градусов с телом животного.</li>
		<li>Извлеките иглу и сразу вставить в массив электрод CELLECTRA® - 3 P через инъекции пшеничная и применять электрического поля.</li>
		<li>Удаление животных из наркоза и контролировать его восстановления.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Non терминал кровоточить
<ol><li>
Сбор крови от яремной анестезированные морской свинки.
	<ol>
<li>Морская свинка в камеру всасывание и обезболивают животных, как описано в 1.1.1</li>
		<li>С помощью 3 мл шприца с иглой 27 g 1/2 дюйма, перемежать яремной анестезированные животного и собирать 3 мл крови.</li>
		<li>Сразу передача крови в K2EDTA пробирка, инвертировать трубки несколько раз перемешать крови с анти коагулянта и место на льду. Примечание: Предотвращения свертывания крови имеет решающее значение для успешной обработке образца крови.</li>
		<li>Мониторинг животных восстановления.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. обработка образцов крови
<ol><li>
Разделение получения из цельной крови центрифугированием градиент плотности
	<ol>
<li>Разбавления крови 1:1 с Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS). Примечание: Чтобы избежать загрязнения, все работы здесь на должны выполняться в кабинете биобезопасности, применяя асептической техники.</li>
		<li>Слой разбавленной крови постепенно более 4,5 мл Ficoll-Paque плюс в 15 мл Конические трубки. Во избежание нарушения интерфейса. Примечание: Для обеспечения надлежащего разделения, Ficoll-Paque должна быть при комнатной температуре.</li>
		<li>Центрифуга трубы на 800 РРС для 30 мин с тормозом выкл. Примечание: как альтернатива, SepMate™ трубы (ПРОВОДЯЩЕМ технологии) могут быть использованы для КСДОР разделения. HBSS разбавленной крови добавляется 15 мл SepMate, заполнены с 3,5 мл Ficoll-Paque Plus и затем центрифугировали в 1200 РРС для 10 мин (тормоз). Этот метод градиентного центрифугирования экономии времени приводит к равных жизнеспособности, клетки доходность и спот формирование.</li>
		<li>Урожай Баффи-слой и разбавленных в R10 среднего (10% (v/v) тепло деактивирована FBS и 1% (v/v) перо/воспаление в RPMI1640 среде) к общим объемом 15 мл.</li>
		<li>Пелле клетки центрифугированием в 450 РРС за 5 мин.</li>
		<li>Вымойте клетки дважды с R10 среднего.</li>
		<li>Вновь приостановить клеток в 1 мл R10 и передайте суспензию клеток через 70 мкм клеток-сетчатый фильтр в новой трубки.</li>
		<li>Подсчитать ячейки и определить количество живых клеток путем пятнать Трипановый синий.</li>
		<li>Разбавить клетки с R10 среднего до концентрации 1 x 10 ^ 6 живых клеток / мл.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Подготовка ELISpot пластины и ячейки стимуляции
<ol><li>
Пальто и блок скважин 96-луночных ELISpot PVDF мембраной пластины перед посевом репликацию.
	<ol>
<li>Плиты должны быть предварительно обработанных за 60 секунд. Этанол до лечения приведет к менее неспецифических спот формирование и пятна с улучшение определения. Примечание: Принять дополнительные меры для обеспечения полного мембраны соприкасается с 15 мкл 35% этанола.</li>
		<li>После 60 секунд добавить 150 мкл ПБС в колодец, а затем очистить из скважин, инвертирование пластины. Примечание: Предварительная обработка этанола очень срочным. Не инкубировать дольше, чем 60 секунд мембраны не должна высыхать на следующих этапах процедуры хорошо мембраны.</li>
		<li>Мыть тарелки три раза с 250 мкл ПБС за хорошо.</li>
		<li>Пальто с 100 мкл/хорошо 5 мкг/мл захвата против свинки антитела V-E4 ИФН γ в PBS.</li>
		<li>Инкубировать пластины для по крайней мере 12 часов на 4° C.</li>
		<li>Мыть тарелки, добавив 250 мкл/хорошо PBS три раза.</li>
		<li>Добавить 200 мкл/хорошо блокирующий буфер (10% (w/v) сахарозы и 2% (w/v) BSA в PBS) и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.</li>
		<li>Мыть тарелки с 250 мкл/хорошо PBS три раза.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Пластина репликацию с пептидами антиген специфические, положительной и отрицательной контроля.
	<ol>
<li>Разбавьте белка пептид бассейн в R10 до желаемого окончательный пептид концентрации.</li>
		<li>Пробирного получения образцов в triplicates. Примечание: Сначала добавьте носитель с стимуляторы ELISpot пластины и добавить КСДОР подвеска второй.</li>
		<li>50 мкл пептид R10 среды указанных скважинах.</li>
		<li>Для отрицательного контроля добавьте 50 мкл пустой пептид формулировка в R10 в указанных скважинах.</li>
		<li>Для позитивного управления добавьте 5 мкг/мл конканавалина А (Кона) в среде R10 в указанных скважины.</li>
		<li>100 мкл суспензии клеток КСДОР для всех скважин</li>
		<li>Инкубировать пластин в увлажненные 5% СО2 атмосфере при 37° по Цельсию на 18 часов. Примечание: Место ELISpot плиты на даже поверхность/стойку в инкубаторе и избежать каких-либо нарушений плит во время инкубации.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Обнаружение интерферона гамма позитивные пятна
<ol><li>
Инкубация с обнаружения антител и пластины развития. Примечание: Для всех шагов в этом разделе не асептической техники не требуется.
	<ol>
<li>Осторожно извлеките пластины из инкубатора и безопасно очистить скважин. Мыть тарелки, добавив 250 мкл/хорошо PBS в три раза.</li>
		<li>Добавьте 100 мкл/хорошо 2 мкг/мл биотинилированным обнаружения анти свинки ИФН γ антитела которые разбавлять N-G3 в блокирующем буфере. Примечание: Раствор антител (22 мкм) фильтр для уменьшения фона.</li>
		<li>Проинкубируйте с обнаружения антител для 2 часов при комнатной температуре.</li>
		<li>Выбросите супернатанта и мыть тарелки, добавив 250 мкл/хорошо PBS три раза.</li>
		<li>Добавить 100 мкл/хорошо щелочной фосфатазы (ALP)-конъюгированных стрептавидина, разбавленных в блокирующем буфере. Примечание: Фильтр (22 мкм) решение для уменьшения фона.</li>
		<li>Инкубируйте с ALP-стрептавидина конъюгата 1 час при комнатной температуре.</li>
		<li>Отменить решения стрептавидина ALP и мыть тарелки, добавив 250 мкл/хорошо PBS в два раза и удалите избыток PBS, инвертирование пластину и промокательной его с чистым бумажным полотенцем.</li>
		<li>Мыть тарелки, добавив 250 мкл/хорошо сверхчистого DI воды один раз и удалите избыток воды, инвертирование пластину и промокательной его с чистым бумажным полотенцем.</li>
		<li>100 мкл раствора субстрата ПКВП/НБТ (осторожно), в каждой скважине. Предупреждение: ПКВП/НБТ высоко горючих и токсичных если проглотил, при контакте с кожей, или вдыхают. Перед использованием обратитесь к MSDS.</li>
		<li>Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре в защищенном от света.</li>
		<li>Промойте пластину 4 раза с дейонизированной водой. Инвертировать пластины и нажмите, чтобы удалить лишнюю воду.</li>
		<li>Удалите пластиковые дренажные из нижней части ELISpot пластины и позволяют пластины для просушки.</li>
		<li>Количественно пятна, вручную или с помощью автоматизированных ELISpot читатель, например S6 CTL-Immunospot пластина читателя.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Laddy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+protection+against+pathogenic+human+and+avian+influenza+viruses+via+in+vivo+electroporation+of+synthetic+consensus+DNA+antigens.">Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens.</a> PloS One. 3 (6), 2517 (2008).</li><li>Lee, J. Y., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+baculovirus-based+vaccine+expressing+M2+protein+induces+protective+CD8++T-cell+immunity+against+respiratory+syncytial+virus+infection.">Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).</li><li>Kinnear, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+T+cells+protect+against+RSV+infection+in+the+absence+of+antibody.">Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody.</a> Mucosal Immunology. , (2017).</li><li>Sridhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+immune+correlates+of+protection+against+symptomatic+pandemic+influenza.">Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).</li><li>Brand, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++T-cell+counts+and+interleukin-8+and+CCL-5+plasma+concentrations+discriminate+disease+severity+in+children+with+RSV+infection.">CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection.</a> Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).</li><li>Bouvier, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+influenza+virus+transmission+studies:+a+historical+perspective.">Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective.</a> Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).</li><li>St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Ebolavirus+Infection.">Animal Models of Ebolavirus Infection.</a> Comparative Medicine. 67 (3), 253-262 (2017).</li><li>Todo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdermal+Permeation+of+Drugs+in+Various+Animal+Species.">Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species.</a> Pharmaceutics. 9 (3), 33 (2017).</li><li>Schafer, H., Burger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+cellular+immunology+and+vaccine+research+the+in+the+guinea+pig:+monoclonal+antibodies+to+cell+surface+antigens+and+cell+lines.">Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines.</a> Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).</li><li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+(ELISPOT)+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells.">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).</li><li>Sedgwick, J. D., Holt, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solid-phase+immunoenzymatic+technique+for+the+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells.">A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).</li><li>Moodie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+definition+criteria+for+ELISPOT+assays+revisited.">Response definition criteria for ELISPOT assays revisited.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).</li><li>Gillis, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel,+guinea+pig-specific+IFN-gamma+ELISPOT+assay+and+characterization+of+guinea+pig+cytomegalovirus+GP83-specific+cellular+immune+responses+following+immunization+with+a+modified+vaccinia+virus+Ankara+(MVA)-vectored+GP83+vaccine.">Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine.</a> Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).</li><li>Schultheis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+guinea+pig+T+cell+responses+elicited+after+EP-assisted+delivery+of+DNA+vaccines+to+the+skin.">Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin.</a> Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).</li><li>. Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One) Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf">https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf</a> (2013)</li><li>Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Terminal+Blood+Sampling+Techniques+in+Guinea+Pigs.">Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51982 (2014).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability.">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).</li><li>Lewis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+hematology:+studies+on+guinea-pigs+(Cavia+porcellus).">Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus).</a> Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).</li><li>Flecknell, P., Flecknell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). , 77-108 (2016).</li><li>Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+guinea+pig+interferon-gamma:+tools+for+cytokine+detection+and+neutralization.">Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization.</a> Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).</li><li>Lipiainen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+stability+of+cytokine+therapeutics.">Formulation and stability of cytokine therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).</li><li>Wang, X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-Specific+CD8+T+Cells+in+Peripheral+Tissues+Are+More+Resistant+to+Apoptosis+Than+Those+in+Lymphoid+Organs.">Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs.</a> Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).</li><li>Veron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Sequencing+of+T+Cell+Receptor+in+Peripheral+Blood+and+Muscle+from+Adeno-Associated+Virus+Vector-Injected+Subjects+Reveals+Differences+in+T+Cell+Clonality+Between+the+Two+Compartments.">Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments.</a> Molecular Therapy. 23, 210 (2015).</li><li>Sckisel, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phenotypes+of+memory+CD4+and+CD8+T+cells+in+the+spleen+and+peripheral+tissues+following+immunostimulatory+therapy.">Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33 (2017).</li><li>Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Dendritic+Cells+and+Their+Role+in+Cutaneous+Carcinoma+and+Cancer+Immunotherapy.">Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy.</a> Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123 (2013).</li><li>Amante, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Transfection+of+Dendritic+Cells+in+the+Epidermis+After+Plasmid+Delivery+Enhanced+by+Surface+Electroporation.">Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).</li><li>Mahe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+targeting+of+vaccine+compounds+to+skin+antigen-presenting+cells+by+hair+follicles+and+their+transport+in+mice.">Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).</li><li>Vandermeulen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-specific+promoters+for+genetic+immunisation+by+DNA+electroporation.">Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation.</a> Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).</li><li>Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+DNA+vaccination+using+skin+electroporation+promotes+poly-functional+CD4+T-cell+responses.">Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses.</a> Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).</li><li>Romani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+skin+dendritic+cells+to+improve+intradermal+vaccination.">Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).</li><li>Smith, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccination+strategy+targets+epidermal+dendritic+cells,+initiating+their+migration+and+induction+of+a+host+immune+response.">DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response.</a> Molecular Therapy Methods &amp; Clinical Development. 1, 14054 (2014).</li><li>Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+immunobiology+of+human+skin+and+functional+specialization+of+skin+dendritic+cell+subsets+to+innovate+intradermal+vaccination+design.">Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+prototype+device+for+electroporation-enhanced+DNA+vaccine+delivery+simultaneously+to+both+skin+and+muscle.">A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle.</a> Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).</li><li>Laddy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+synthetic+DNA+antigens+offers+protection+in+nonhuman+primates+challenged+with+highly+pathogenic+avian+influenza+virus.">Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus.</a> Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Electroporation-Enhanced+Intradermal+Delivery+of+DNA+Vaccine+Using+a+Minimally+Invasive+Surface+Device.">Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).</li><li>Kichaev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+mediated+DNA+vaccination+directly+to+a+mucosal+surface+results+in+improved+immune+responses.">Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).</li><li>Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+reactions+of+CD4-+and+CD8-positive+T+cell+subpopulations+in+spleen+and+lymph+nodes+of+guinea+pigs+after+vaccination+with+Bacillus+Calmette+Guerin.">Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin.</a> Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).</li><li>Shedlock, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Broad+Cytotoxic+T+Cells+by+Protective+DNA+Vaccination+Against+Marburg+and+Ebola.">Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola.</a> Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).</li><li>Hensel, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Herpes+Simplex+Virus+2+(HSV-2)+Vaccines+Adjuvanted+with+Stable+Emulsion+and+Toll-Like+Receptor+9+Agonist+Induce+a+Robust+HSV-2-Specific+Cell-Mediated+Immune+Response,+Protect+against+Symptomatic+Disease,+and+Reduce+the+Latent+Viral+Reservoir.">Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir.</a> Journal of Virology. 91 (9), 02257 (2017).</li></ol>

Авторы Кэтрин Шультхайз, Холли м. Пью, Брайан S. Yung, Джанет Oh, Холли м. Pugh, Нгуен Jacklyn, Лоран Humeau, Кейт E. Бродерик и Тревор Smithare р.ф. сотрудники Inovio фармацевтических препаратов и таким образом получают зарплату и пособия, включая владение акций и опционов, от компании.

Морской свинки является ценным животных модель развития доклинических вакцин и внутрикожное введение стратегий. Вышеупомянутый Протокол описывает методологию для оценки реакции антиген специфические Т-клеток в этой весьма актуальны модели. Assay обеспечивает четкое перечисление периферийных устройств T-клетки, вырабатывающие интерферона-гамма при стимуляции с пептидами антиген специфические. Кинетика иммунного ответа может контролироваться забора крови-терминал.
Мы оптимизированный протокол и определили важнейшие аспекты для получения оптимальных результатов, используя этот assay. Например образование тромбов в коллекции трубки приведет к неоптимальной КСДОР восстановления и жизнеспособности. Морская свинка тромбов очень быстро18. Важно быстро выполнить розыгрыш крови. Au-камень et al. обеспечивают полное руководство для кровотечение методов в модели свинка16. Поскольку сбор крови требует общей анестезии, рекомендуется рассмотреть применимые стандартные оперативные процедуры этого аспекта процедуры19. Недостаточно анестезированные морских свинок будет реагировать, перемещая их ноги или вокализация после краткого щепотка ткани между пальцами с ваши ногти или дрогнув свои уши и поступательного продвижения их усы после щипать их уха. Немедленную передачу крови в трубку с антикоагулянтами и перемешать тщательно путем прокатки или инвертирование трубке несколько раз является важным шагом в этом протоколе. Здесь описывается протокол ЭДТА трубы были использованы, и без других антикоагулянты были протестированы. Пожалуйста, обратите внимание, что ЭДТА гипертонический, трубы должны идеально быть заполнены более чем наполовину и поэтому соответствующие трубы размер объем образца должны быть использованы.
Когда выполнена правильно, плотность градиентного центрифугирования неизменно приводит к чистой КСДОР подготовки. Средний градиент плотности должны быть при комнатной температуре, когда слои градиента перед центрифугированием, а тормоза не должны использоваться для остановки центрифуги при использовании регулярных трубы. Значительное улучшение с точки зрения практичности КСДОР-обработки было сочетание градиентного центрифугирования плотности с устройствами КСДОР изоляции. Это позволяет сократить время центрифугирования. Плотность градиентного центрифугирования в устройствах КСДОР изоляции и результаты регулярных трубы в аналогичных жизнеспособности, живой клетки подсчитывает обработанных репликацию, и пятно формирования. Независимо от типа труб, используемых для разделения, урожай Баффи пальто должны следовать сразу. Течение длительного периода времени контакта с средний градиент плотности цитотоксических для получения.
Точный подсчет жизнеспособных получения имеет важное значение для семян последовательно равное количество клеток в Пробирной тарелка скважин. Некоторые метод жить/мертвые дискриминации должны применяться. В нашей лаборатории мы используем Трипановый синий исключения пробирного и автоматизированных-счетчик соматических клеток.
Пятно качества, определяется как острые и высокой противопоставляется пятна, приведет к повышается точность и последовательное пятно подсчета голосов, особенно при использовании автоматизированной системы подсчета голосов. В соответствии с рекомендациями изготовителя мы наблюдали этанола до лечения ELISpot плит, чтобы стать решающим шагом уменьшить количество пятен фоновый и улучшить определение пятна. Настоятельно рекомендуется использовать пластину читателя образ ELISpot assay пластин в конце протокола. Оригинальные образы каждой скважины может быть легко и эффективно получены и хранятся. Использование изображений программное обеспечение для анализа цифровых изображений также позволяют для объективного анализа и пятно подсчета голосов по сравнению с ручной подсчет отдельными операторами.
Абсолютная необходимость для развития assay, описанные здесь был поколения подходящие анти свинки интерферона гамма антитела пара. Моноклональные антитела мыши V-E4 и N-G3 были разработаны путем гибридомной техника с клонами B-клетки от мышей, которые были сделаны прививки с рекомбинантным свинки интерферона гамма20. Сообщается, что V-Е4, которая изотипа IgG1, и N-G3, который IgG2a, связать оба антигена рекомбинантных и родной. Присвоение V-E4 как захват антитела и биотинилированным N-G3 как обнаружение антител привели к высокой чувствительности для рекомбинантных и родной белка при сохранении низких фонового сигнала в формате сэндвич ELISA. Обе антитела доступны для научного сообщества через производственные соглашения, во главе с лабораторией доктор Хьюберт Шефер, который является соавтором данного издания. Запросы будут получены лабораторией доктор Шефер и затем производимых коммерческим партнером.
Сообщается, что интерферон гамма быть неустойчивым в обычных буферов или СМИ21. Шефер 20 et al. сообщили лишь умеренное снижение темпов восстановления, при использовании деградировавших ИФН y, которая потеряла биологических функций, в формате ELISA, с использованием антител V-E4 и N-G3. Однако увеличивая время инкубации пептид стимулирования получения более 18 h должны тщательно проверяться.
Преимущества использования получения был обсужден. Однако здесь описано assay отражает только отзывы антиген специфические циркулирующих Т-клеток в периферии. Проникают в ткани Т-клетки или клетки изолированы от лимфатических органов, например, селезенке и лимфатических узлах, могут демонстрировать различные свойства22,23,24. Никаких существенных различий в клеточных реакций были замечены на сравнение интерферона гамма пятна от получения и splenocytes от морских свинок, которые были сделаны прививки с же pNP гриппа вакцины14.
В этом протоколе мы описали процедуру внутрикожные вакцинации. Главным обоснованием ID иммунизации является ориентация высокой плотности дендритных клеток в коже25. Мы и другие показали, что эти клетки могут быть конкретно адаптации метод доставки26, формулировка27или28наркотиков дизайн. Активированные профессиональный антиген представляющих клеток может перейти на Дренажный лимфатический узел и активировать адаптивной иммунной системы29,30,,3132. Дендритные клетки являются клетки тип представления основных антигена для грунтования продуктивной сотовых иммунных реакций.
Для этого исследования, которые были сделаны прививки животных с плазмидной ДНК кодирования Нуклеопротеиды гриппа H1N1 штамма A/PuertoRico/8. Кожи доставки этой вакцины pDNA (pNP) в сочетании с электропорации было показано, чтобы выявить антиген специфические гуморальные ответы в морских свинок33, хорьки и нечеловеческих приматов (Евросоюзе)1,34. Кроме того эта вакцина вызвала надежные ответы Т-клеток мышей после доставки в эпидермис35, которая может объясняться CD4 и CD8 Т-клеток, стимулируя с пептидами, представляющих конкретные epitopes для популяции этих клеток. Иммуногенность после слизистой доставки, как продемонстрировано поколения гуморальные ответы в кроликов и морских свинок, а также клеточного и гуморального ответы в мышей36pNP вакцины. Совсем недавно наша группа смогла продемонстрировать поколения ИФН γT-клеток ответов в кролика после межмышечная доставки (неопубликованные данные).
В настоящее время наблюдаемых пятен интерферона гамма в морской свинки ELISpot не могут выделяться подмножества CD4 + и CD8 + Т-клеток. Специально для проектирования и разработки иммунной терапии, ориентация на кожу было бы очень полезно определить ли наблюдаемые интерферона гамма пятно частоты вызваны расширением одного конкретного подмножества или сбалансированный ответ как для того чтобы Оцените эффективность вакцинации вызвать кросс презентация. Это ограничение можно преодолеть отрицательное сортировки клеток CD4 и CD8 до заполнения ячеек на плите или идентификации MHC класса II (CD4 ответы) или MHC класса I (для ответов CD8) ограничено epitopes.
Здесь описаны интерферона гамма ELISpot assay с использованием морской свинки получения устраняет необходимость оценки курс клеточных реакций в модели Лаборатория морской свинки. Это будет совершенствовать разработку вакцин и кожи протоколы доставки. Мы считаем, что она позволяет для трудоустройства этой соответствующих животных модели изучения заболеваний с важными компонентами Т-клеток как ТБ37, Эбола38,39HSV и другие. Это позволит сократить использование менее соответствующих животных моделей.

Протокол, описанные здесь позволяет обнаружить интерферона-гамма (ИФН γ) секреции клетки после отзыва антигена в периферической крови мононуклеарных клеток (КСДОР) населения, добываемых из морских свинок Хартли. Мы применили assay охарактеризовать кинетику и величины антиген специфические Т-клеток ответов схема вакцинации против гриппа в морской свинки. Мы считаем, что этот протокол будет значительно продвинуть доклинические развития программ вакцинации в этой весьма актуальны модели на животных.
Т-клетки, вызвал вакцины играть важную роль в деле защиты против инфекционных агентов и иммунотерапевтических пути, связанные с другими заболеваниями. В нескольких исследованиях вакцины была подчеркнута важность Т-клеток. Иммунизации хорьки и мышей с плазмида ДНК (pDNA) кодирования для H5 гемагглютинин и N1 нейраминидазы представил защите от заболеваемости и смертности в вызов вирус гриппа в отсутствие нейтрализующих антител, указывая значение Т-клеток иммунитета1. В дополнение к сильным нейтрализации гуморального иммунного ответа, Т-клетки играют важную роль не только Вирусный Распродажа2 , но и защиту от инфекции с респираторно-синцитиальный вирус (RSV) в мышей3. В организме человека, ранее существовавших CD8 + Т-клетки были связаны с снижение болезнь тяжести во время H1N1 пандемии в 20094. CD4 + Т-клеток вместе с плазменной концентрации некоторых цитокинов коррелируются с тяжести заболевания в RSV-инфицированных детей5.
Морская свинка приобрела известность как модель лаборатория для исследований и разработок в различных областях медицины, такие как чувствительность кожи, питанием исследования, исследования слуховой системы и, что наиболее актуальными для этой работы, инфекционные заболевания. Это имеет решающее значение для открытия вакцин против туберкулез и дифтерия. Совсем недавно морской свинки используется в качестве модели для гриппа6 и7Эбола. Кроме того обладая физиологического сходства для кожи человека8, морская свинка предлагает модель доступной малых животных для методов доставки дермального наркотиков. В отличие от его важность как модель лаборатории наличие конкретных анализов морских свинок и зонды характеризовать иммунных реакций остается ограниченным9. Основные сотовой анализов, например энзим соединенный immunospot ИФН γ (ELISpot проба), обычно используется в доклинических и клинических исследований для перечисления Т-клеток ответы не были доступны.
Первый immunospot энзим соединенный твердофазный анализов были использованы для определения числа конкретных антитела секретирующих клеток в клетки B населения10,11. Формат расширенный обнаружить клетки секретирующие цитокинов, включая IL-1, IL-2, IL-4, Ил-5, IL-6, Ил-10, ГМ-КСФ, ФНО альфа, TNF-бета, Гранзим B и ИФН γ. ELISpot assay обладает высокой чувствительностью; потенциально могут быть обнаружены каждой ячейки производство цитокинов. Сообщается, что предел обнаружения для ELISpot анализов будут ниже, чем 10 спотов в 100000 получения12. Недавно пару специфическое антитело ИФН γ-свинки был сделан доступны13, и это открыло возможность для решения этого дефицита в области.
ИФН γ считается важным эффекторные молекулы в адаптивного иммунного ответа; Это могут быть произведены и выделяется клетками CD4 и CD8 T после активации. ИФН γ имеет широкий спектр биологических функций в контексте иммунного ответа к вирусной инфекции, такие как активация макрофагов и вверх регулирование комплекс гистосовместимости (MHC) я и MHCII выражения. Он также способствует B-клеточной дифференцировки, подавляет рост клеток T-помощник-2 и активирует естественных клеток-киллеров. ИФН γ блокирует репликацию вируса в зараженных соматические клетки и upregulates экспрессии молекул MHC. Таким образом производство ИФН γ является очень важным показателем качества Т-клеток реакции на вакцину или патогена.
Важным аспектом здесь представлена ELISpot ИФН γ является использование репликацию, вместо того, чтобы splenocytes13. Репликацию можно получить путем обработки-терминал сбора крови, тогда как сбор splenocytes требует животных euthanization до сбора урожая в селезенке. Использование получения позволяет ИФН γ T-клеток ответов на наблюдение за определенный период времени и оценки воздействия на Т-клеток ответов, таких как премьер boost схемы14.
Для исследователей, которые в настоящее время используют морскую свинку в животной модели метод ELISpot ИФН γ расширит спектр научных данных, которые они могут получить. Его доступность теперь может уменьшить необходимость проведения исследований с менее соответствующих животных моделей для целевого болезни, которые ранее были выбраны из-за наличия реагента для изучения клеточных реакций. Использование репликацию вместо селезенки и лимфатических узлов позволяет для экспериментов-терминал и непрерывный мониторинг отдельных животных.
Ниже мы предоставляем подробное описание этапов обнаружения ИФН γ клеточного ответа в морских свинок pDNA вакцины. Мы изложить наши процедуры доставки и описать общие ELISpot assay, охватывающих проб крови, анализ крови, КСДОР урожай, процедура анализа и анализа данных. Схема ELISpot assay изображен на рисунке 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig1.jpg"> Рисунок 1 : Схематичный обзор свинки протокол ELISpot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:969px;" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">Cellectra-3P</td>
			<td style="width:215px;">Inovio Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td style="width:167px;">ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&#38;D-only</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">K2EDTA blood collection tube</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td>367844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Plus</td>
			<td style="width:215px;">GE Healthacre&#160;</td>
			<td>17144003</td>
			<td>density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SepMate tube</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:192px;">85415</td>
			<td>PBMC-isolation device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">RPMI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heat-deactivated FBS&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:192px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:192px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:215px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:192px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well ELISpot PVDF-membrane&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Millipore</td>
			<td style="width:192px;">MSIPS4W10</td>
			<td>ELISpot assay plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td>459844-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">UPDI</td>
			<td style="width:215px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:192px;">10977-015</td>
			<td>Ultra-Pure DI water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:192px;">S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:192px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">10x PBS</td>
			<td style="width:215px;">HyClone</td>
			<td style="width:192px;">SH30378.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Concanavalin A (ConA)&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td>C5275-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems Inc.&#160;</td>
			<td style="width:192px;">SEL002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCIP/NBT&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems Inc.&#160;</td>
			<td style="width:192px;">SEL002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">capture anti-guinea pig IFN-&#947; antibody V-E4</td>
			<td style="width:215px;">GenScript</td>
			<td style="width:192px;">Order #:U5472CE080-3</td>
			<td>LOT # A217071153</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biotinylated detection anti-guinea pig IFN-&#947; antibody N-G3&#160;</td>
			<td style="width:215px;">GenScript</td>
			<td style="width:192px;">Order #:U5472CE080-1</td>
			<td>LOT # A21700598</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">CTL S6 Micro Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot</td>
			<td>#S6MIC12</td>
			<td>automated ELISpot plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">Vi-CELL XR</td>
			<td style="width:215px;">Beckman-Coulter</td>
			<td align="right" style="width:192px;">731050</td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">ImmunoSpot 5.1</td>
			<td style="width:215px;">ImmunoSpot</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>assay analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">ESCO Class II Type A2</td>
			<td style="width:215px;">ESCO</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>Biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon cell strainer</td>
			<td style="width:215px;">Corning, Inc.</td>
			<td>VWR cat# 21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exel Comfort Point Insulin syringe</td>
			<td style="width:215px;">MedLab Supply&#160;</td>
			<td align="right" style="width:192px;">26028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">Rotanta 460R</td>
			<td style="width:215px;">Hettich</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td align="right">383722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">Incu Safe</td>
			<td style="width:215px;">Panasonic-Healthcare</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td>incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">22&#181;m Filter</td>
			<td style="width:215px;">ThermoScientific&#160;</td>
			<td style="width:192px;">VWR act# 597-4520</td>
			<td>22&#181;m Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KimWipes</td>
			<td style="width:215px;">Kimberly-Clark Professional&#160;</td>
			<td>VWR cat# 21903-005&#160;</td>
			<td>paper towels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized interferon-gamma elispot assay to measure t cell responses in the guinea pig model after vaccination

Морская свинка играл ключевую роль как модель соответствующих мелких животных в разработке вакцин против инфекционных заболеваний, как туберкулез, гриппа, дифтерии и вирусных геморрагических лихорадок. Мы продемонстрировали, что плазмида ДНК (pDNA) вакцинации в кожу вызывает надежные гуморальные ответы в морской свинки. Однако использование этого животного к модели иммунные реакции было несколько ограничены в прошлом из-за отсутствия доступных реагентов и протоколов для изучения ответов Т-клеток. Т-клетки играют ключевую роль в иммунопрофилактики и иммунотерапевтических механизмов. Понимание Т-клеток ответов имеет решающее значение для развития инфекционных заболеваний и онкологии вакцин и размещения поставки устройств. Здесь мы описываем assay энзим соединенный immunospot (ELISpot) интерферона гамма (ИФН γ) для морской свинки мононуклеаров периферической крови (получения). Assay позволяет исследователям характеризуют вакцины специфических Т-клеток ответов в этой важной грызунов модели. Способность к assay клетки изолированы от периферической крови предоставляет возможность отслеживать иммуногенности в отдельных животных.

Результаты, представленные здесь служить отправной точкой для ожидаемых результатов после использования этого протокола, подчеркивая важность кардинальные шаги и подтверждает преимущества описанных оптимизации.
После центрифугирования градиент плотности как описано в шаге 3.1 протокола, красный вязкой жидкости в нижней части трубки будет содержать большую часть красных кровяных клеток. Как показано на рисунке 2A, выше красные кровяные клетки — это слой, плотность-среды. Между слоем ясно или желтый плазмы на вершине и плотность градиента среда является белый или светло коричневый Баффи слой, который содержит большую часть белых кровяных клеток и тромбоцитов. Неполного разделения будет проявляться как наличие красных кровяных клеток на вершине градиент плотности среды. Красная окраска плазмы в рисунке 2A является наиболее вероятно вследствие гемолиза, как этот образец крови хранится в коллекции трубки 1,5 h перед обработкой. Рисунок 2 B показывает градиента до (слева) и после (справа) центрифугирования в устройстве КСДОР изоляции. Образец крови в рисунке 2B был обработан с минимальной задержкой после забора крови и плазмы окраска желтая.
Влияние предварительного замачивания оболочек с этанолом (см. шаг 4.1 протокола) на месте развитие показано на рисунке 3. Пятна в предварительно обработанных скважин отображения улучшение определения, и есть сокращение числа мест в средних/ДМСО отрицательный контроль скважины (рисA). Типичный жизнеспособность обработанной морской свинки получения колеблется около 90% и аналогичные регулярные 15 мл пробирок и КСДОР изоляции устройства (рис. 3B). Доходность жизнеспособных клеток из 3 мл крови обычно колеблется от 3 х 106 и 5 x 10-6.
Животные были иммунизированы с плазмидной ДНК кодирования Нуклеопротеиды (NP) штамма гриппа H1N1 A/PuertoRico8. На рисунке 4 показано перечисление Т-клеток ИФН γ ответов, представленных как спот формирование единиц (ЮФУ), получаемых через продолжительность режима вакцинации. ELISpot проба с получения заготавливаемым от-иммунизированных животных приводит к незначительным пятно графов (не tx). Четырнадцать дней после первого иммунизации (премьер), в среднем 970 ИФН γ пятна на миллион получения были подсчитаны после иммуногенность стимуляции. Через семь дней после второй иммунизации (boost), Т-клеточных реакций против всех трех бассейнах были расширены, достигнув в среднем SFU/106 получения 5020 ИФН γ. сорок шесть дней после второй иммунизации (память), среднее количество 6310 ИФН γ SFU/10 6 получения были подсчитаны в периферической крови.
РИСУНОК ЛЕГЕНДЫ:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig2.jpg"> Рисунок 2 : Представитель изображения слоев после центрифугирования градиент плотности. Образец крови (A) до (слева) и после (справа) центрифугирования в регулярных трубы. (B) крови образца до (слева) и после (справа) центрифугирования в устройствах КСДОР изоляции. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig3.jpg"> Рисунок 3 : Оптимизация протокола. (A) типичный вид ИФН γ позитивные пятен в пластине Пробирная ELISpot хорошо разработана в соответствии с протоколом. Пример тройные колодцев показываются после предварительной обработки с этанолом (справа) или без предварительной обработки (слева). Клетки инкубировали ночь либо с ДМСО (вверху) как без стимул управления, антиген согласованной пептидов (средний) или Митоген ConA (внизу). Получения от же отдельных животных. Колодцы были образы с помощью автоматизированных пластины сканер. (B) сравнение различных градиент плотности труб на обработанные клетки. 3 мл образцов крови от 3 отдельных морских свинок были собраны. 1,5 мл каждого образца были обработаны с помощью регулярных трубы (градиент средней плотности) или КСДОР изоляции устройства. Жизнеспособность (левый, % ± SEM) и количество живых клеток (справа, x 106 ± SEM) были определены с использованием автоматической клеток, считая системы и пробирного Трипановый синий исключения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig4.jpg"> Рисунок 4 : Обнаружение надежные сотовых иммунных реакций в течение режим вакцинации. 1 и 15 дни 30 мкг pDNA кодирования гриппа A Нуклеопротеиды (NP) был доставлен внутри внутрикожно брюшной фланг Хартли морских свинок, сразу же после кожи электропорация. ИФН γ ELISpot ответ была измерена 14 дней после первого иммунизации (премьер) и 7 дней (boost) и 46 (память) после второй иммунизации. Средняя SFU + SEM были нанесены 5 очищенных морских свинок и 2 необработанных морских свинок (не tx). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination at JoVE.com

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Разработка интерферона гамма ELISpot assay для морской свинки получения позволяет характеристик Т-клеток ответов в этой весьма актуальны модели для изучения инфекционных заболеваний. Мы применили assay для измерения Т-клеток ответов, связанных с внутрикожное введение вакцины ДНК.

Оптимизированный интерферона гамма ELISpot Assay мера Т-клеток ответов в модели морской свинки после вакцинации

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

В прошлом характеристика иммунотерапии в модели морских свинок ограничивалась измерением гуморального иммунитета. Анализ ELISpot преодолевает это ограничение, и это поможет исследователям генерировать более значимые данные в этой модели животных. Основным преимуществом этой техники является то, что клетки получены из периферической крови.Некропсия не требуется. Это позволяет измерять не только величину, но и кинетику Т-клеточных реакций у отдельных морских свинок во время естественной инфекции или на протяжении всего режима вакцинации. Демонстрацией процедуры будет Холли Пью.Она научный сотрудник доклинического отдела R и D Inovio. Для начала добавьте 15 микролитров 35% этанола к каждой пластине анализа ELISpot. Через 60 секунд добавьте 150 микролитров PBS к каждой колодец.И инвертировать пластины, чтобы остановить этанол предварительной обработки. Большой уход также следует проявлять при обработке пластин анализа ELISpot, чтобы избежать загрязнения или повреждения мембраны. Для мытья пластины добавить 250 микролитров PBS к каждому хорошо.После повторения мытья еще два раза, добавить 100 микролитров захвата анти-морской свинки интерферона гамма-антитела VE4 к каждому хорошо. Затем инкубировать пластину, по крайней мере 12 часов при 4 градусах по Цельсию. После инкубационого периода мыть тарелки три раза.Добавьте 200 микролитров блокирующего буфера к каждой колодец. Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение двух часов. Затем мыть тарелки еще три раза.Подготовка конических трубок с 4,5 мл градиентной среды плотности комнатной температуры. Затем смешайте равный объем раствора соли Hanks'Balanced с кровью. Слой разбавленной крови постепенно над плотностью градиента среды, заботясь, чтобы не нарушить интерфейс.После этого центрифуга труб при температуре 800 х г в течение 30 минут без тормозов при комнатной температуре. Снимите трубку с центрифуги, заботясь о том, чтобы не беспокоить слои. После правильной идентификации слоев аспирировать полный слой баффи пальто для сбора ПХМ.Медленно слой HBSS разбавленной крови на плотность градиента среды. Избегайте каких-либо нарушений трубки и выключите центрифугу тормоза. Перенесите клетки в новую трубку по 15 мл.Затем разбавить клетки в R10 среды до общего объема 15 мл. После гранулирования клеток, отбросить супернатант и повторного высасывания клеток в 15 мл R10 среды. Перейдите подвеску клетки через 70-метровый клеточный ситечко в новую трубку.Подсчитайте клетки и определите количество живых клеток с помощью теста trypan blue exclusion Test. Затем разбавьте клетки со средой R10. Сначала снимите блокирующий буфер и вымойте пластины.Для каждого образца PBMC указывают трипликаты положительного контроля, отрицательного контроля и каждого стимулятора, специфичного для эксперимента. Разбавить белковый пептидный бассейн в R10 среды до трех раз желаемой конечной концентрации. После этого добавьте 50 микролитров пептидной средней смеси R10 в стимулирующие испытательные скважины пластины.Затем добавьте 50 микролитров пептидной формулировки МТ в R10 medium к отрицательным контрольным скважинам пластины. Добавьте ConA в R10 средних к положительному контролю скважин пластины, а затем добавить 100 микролитров подвески PBMC для всех скважин. Поместите пластину ELISpot на овеную поверхность в инкубаторе и не нарушайте пластину в инкубационный период.После тщательного удаления пластины из инкубатора, инвертировать пластину, чтобы удалить супернатант. Затем мыть тарелку три раза. Добавьте 100 микролитров разбавленного биотинилированного обнаружения захвата анти-морской свинки интерферона гамма-антитела N-G3 к каждой хорошо.Затем инкубировать пластину при комнатной температуре в течение двух часов. Инвертировать пластину, чтобы удалить раствор антитела и повторить мыть три раза. После удаления PBS из пластины, добавить 100 микролитров ALP конъюгированных стрептавидин разбавленных в блокирующий буфер для каждой хорошо.Затем инкубировать тарелку при комнатной температуре в течение одного часа. Инвертировать пластину, чтобы отказаться от раствора АЛП стрептавидина и мыть пластину дважды. Инвертировать пластину и пятно его против чистого бумажного полотенца, чтобы удалить излишки PBS.После этого мыть пластины с 250 микролитров Ultrapure DI воды на колодец. Инвертировать тарелку и удалить избыток воды с чистым бумажным полотенцем. Далее добавьте 100 микролитров субстратного раствора BCIP/NBT к каждой колодец.Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 20 минут, защищенных от света. Промыть тарелку четыре раза с DI воды. Затем инвертировать и нажмите пластину, чтобы удалить избыток воды.Наконец, удалите пластиковый дренаж со дна пластины и дайте мембране полностью высохнуть. После успешной градиентной центрифугации плотности, как было попродемонстрировано ранее, красная вязкая жидкость в нижней части трубки должна содержать большую часть красных кровяных телец. Слой буйного слоя находится между слоем плазмы и градиентной средой плотности.Предварительная обработка скважин до добавления улавливания антитела, анализ отображается улучшение определения наряду с сокращением числа неспецифических пятен в отрицательном контроля скважин. Пятна указывают на интерферон гамма производства Т-клеток в популяции PBMC. При попытке этого метода, важно помнить, чтобы тщательно, но быстро обрабатывать кровь.Это улучшит жизнеспособность клеток, улучшит образование пятен и уменьшит образование неспецифических пятен. Не забывайте, что работа с кровью и BCIP / NBT субстрат может быть опасным и меры предосторожности, такие как ношение соответствующих СИЗ всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры. Я считаю, что этот протокол позволяет исследователям изучать болезни с важным Т-клеточным компонентом, таким как туберкулез, Эбола и ВПГ.Важно отметить, что он будет усовершенствовать разработку протоколов вакцинации в модели морских свинок и сократит использование менее актуальных моделей животных.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Фермент связанных Immunospot анализ (ELISPOT): Количественная оценка Th-1 клеточного иммунного ответа против микробных антигенов

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Анализ in vitro для оценки влияния иммунорегуляторных Пути на ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток эффекторной функцией

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Клеточная проточной цитометрии измерить цитотоксическую активность

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Использование флуоресцентных целевых массивов для оценки Т-клеточные ответы<em&gt; В естественных условиях</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Трансплантация кожи хвоста изучать Аллогенная лимфоцитов CD4 ответов у мышей

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Мышь наивного CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток Выделение и<em&gt; В пробирке</em&gt; Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

В естественных условиях Assay для обнаружения антиген специфические Т-лимфоцитов цитолитического функции с помощью вакцинации модели

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Всасывания блистер протокол для изучения человеческий Т-клеточный вспомнить ответы в естественных условиях

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...