Name: detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr
Uploaded: 2018-11-10T12:30:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR at JoVE.com

Wij zijn dankbaar aan het Instituut voor veterinaire Bacteriologie, de Vetsuisse faculteit, de Universiteit van Bern voor hun steun. Dit werk werd gefinancierd door de Commissie voor de academische promotie van vroege carrière onderzoekers en gender gelijkheid aan de faculteit Vetsuisse, Universiteit van Bern met 120% model financiering toegekend aan PN. WS en PR worden ondersteund door Center for Advanced Studies voor landbouw en voeding, Institute for Advanced Studies, Universiteit van de Kasetsart, Bangkok, Thailand onder de bevordering van het hogeronderwijs onderzoek en nationale onderzoek Universiteit Project van Thailand, Office van het hoger onderwijs Commissie, ministerie van onderwijs, Thailand. We zouden graag bedanken Dr. Kwanrawee Sirikanchana voor haar verhaal en Piyawatchara Sikarin voor het bewerken van de video.

De auteurs hebben niets te onthullen.

TiLV werd voor het eerst gemeld in 2014 in Israël14 , en sindsdien is het aangewezen in meerdere landen, waaronder Egypte, Colombia, India, Maleisië, Oeganda, Tanzania en Thailand15,16,18, 35 , 48. Mondiaal bewustzijn, met name, tilapia producerende landen heeft geplaatst meer aandacht over het virus en diverse beperkingen en controlemaatregelen van overheidsinstanties zijn doorgevoerd probeert te voorkomen dat de verspreiding van TiLV. Hier, is een gedetailleerd protocol voor de detectie van de TiLV in tilapia weefsel, die betrekking hebben op sample collectie, isolatie van RNA, cDNA synthese, PCR en qPCR testen uiteengezet. Er zijn diverse aspecten aan deze methoden die specifieke discussie rechtvaardigen. TiLV is geconstateerd in vis spanning een verschillende maten9,12,14,15,49 en soorten tilapia tot nu toe, met inbegrip van gekweekte hybride tilapia (O. niloticus x O. aureus)11,14, Nijl tilapia (O. niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 en rood tilapia (Labeo sp.)16,33,48,51, zoals alsook in wild Nile tilapia9,12, zwart Tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, O. aureus en T. simonis intermedia14 en zeer onlangs TiLV werd geïdentificeerd in wild carp (Barbonymus schwanenfeldii)52. Weefselmonsters van inwendige organen (gill, milt, lever, hart, hoofd nier) of slijm37 kunnen worden verkregen van zowel de gezonde als de stervende tilapia ongeacht leeftijd, grootte of soorten en verwerkt voor RNA isolatie. Het totale RNA extractie protocol beschreven gebruikt hier een monofasische oplossing van kaliumthiocyanaat van fenol en guanidinium, die een chaotropic denatureren agent is. De weefsels zijn direct gehomogeniseerd in deze oplossing, gevolgd door de toevoeging van chloroform en centrifugeren om fase-separatie zichtbaar waarin een duidelijke RNA met bovenste waterfase, een interfase en een lagere organische fase wordt gegenereerd. RNA is geïsoleerd van de waterige fase door isopropanol en neerslag, gevolgd door het wassen van de herstelde RNA om zich te ontdoen van verontreinigingen. Isolatie van RNA door deze methode werd ontwikkeld door Piotr Chomczynski en Nicoletta Sacchi en was bedoeld als guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie53,54. Dit soort reagens gebruikt voor RNA extractie kan commercieel worden gekocht of worden gemaakt in het laboratorium (Zie de Tabel van materialen voor meer informatie). Dit protocol duurt iets langer dan kolom gebaseerde methoden zoals de zuivering van silica gebaseerde, maar in het algemeen, het is rendabeler en levert meer RNA.
In dit protocol, kwantificeren van RNA met behulp van de A260 waarden werd geschetst waarbij spectrofotometrie waarden RNA kwaliteit aangeven kunnen (A260/A280 = 1.9-2.1). Terwijl deze methode een goede indicatie van de zuiverheid van de steekproef geeft, kan niet het absoluut informeren over de kwaliteit van de uitgepakte RNA. Controleer goed of het RNA intact of gedeeltelijk aangetaste is, kunnen monsters scheiding door agarose gelelektroforese waarin 18S smeren van de EtBr gekleurd en 28 rRNA banden geven de aantasting van het RNA. Verdere verificatie van de kwaliteit van het RNA kan zijn met het gebruik van een lab-on-a-chip-instrument. Daarnaast is het ook belangrijk om te verteren de gezuiverde RNA met DNase ik verwijderen besmetten host genomic DNA, die afhankelijk van de downstream toepassingen tot onjuiste resultaten leiden kan. Als gastheer gDNA is nog steeds verontreiniging van het RNA-monster voor een groot deel, een extra DNaseI behandeling kan ook worden uitgevoerd aan het einde van de RNA extractie procedure (Zie Tabel van materialen).
Complementaire DNA-herstelsynthese kan grote invloed hebben op de algemene resultaten van de qPCR en is een aspect van de methode die variatie kan invoeren. Het protocol van de cDNA bepleit hier bestaat uit een enkelvoudige component set-up met behulp van oligo (dT) en dus alleen transcribeert mRNAs met polyA staarten. Het staat de gebruikerscontrole van precies welke onderdelen te gebruiken in de reactie van de omgekeerde transcriptie en deze modus van cDNA synthese een succes voor TiLV detectie32 gebleken is. Een alternatief voor deze set-up is een commercieel gekocht meester-mix bevat alle onderdelen die nodig zijn voor de reactie van omgekeerde transcriptie en is zeer snel en eenvoudig zonder het gebruikelijke scriptingregel, pipetting en multi temperatuur protocol. Dit is voordelig omdat het behandeling minimaliseert en bevordert de uniformiteit in verschillende alle steekproeven. Deze master-mixen bevatten vaak zowel oligo(dT) als willekeurige inleidingen voor verschillende RNA-sjablonen te maken, en genereren van representatieve cDNA kopieën van sequenties van de gehele lengte van de RNAs in een populatie (virale en tilapia host mRNA) en in theorie, elke gewenste soort RNA kan vervolgens worden gemeten door conventionele PCR of qPCR uit dergelijke een monster. Deze veelzijdigheid is het belangrijkste voordeel van een 2-step RT-PCR benadering; Het biedt een lange zwembad dat kan worden gebruikt voor vele verschillende experimenten. In de resultaten een one-step RT-PCR aanpak is vertegenwoordigd waarin reeks specifieke primers (tabel 1) werden gebruikt en de RT en PCR werden uitgevoerd in één buis (Zie materiële lijst). In het algemeen, reeks specifieke primers voorzien in een hogere efficiëntie van de RT van het specifieke doel RNA dan het gebruik van willekeurige priming, maar de specifieke doelstelling RNA is de enige die kunnen worden gekwantificeerd in dergelijke een cDNA monster die het enige doel van bepaalde laboratoria wellicht (Zie Tabel van materialen voor cDNA synthese product suggesties).
Terwijl conventionele rechts-PCR lijkt te worden veelgebruikte tot nu toe in de TiLV diagnose9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR heeft aangetoond dat een meer krachtige tool voor de detectie en kwantificering van kleine hoeveelheden TiLV in vis weefsels of slijm32,37. In het algemeen, wordt qPCR veel gebruikt in de diagnostische laboratoria klinische virologie vanwege haar hoge gevoeligheid, specificiteit, goede reproduceerbaarheid, breed dynamisch bereik en snelheid21. Terwijl qPCR kan in eerste instantie duurder te implementeren dan conventionele rechts-PCR, biedt het veel belangrijke voordelen ten opzichte van conventionele PCR; het heeft een snellere turn-around tijd uit monster tot resultaten en op doet niet vergen ieder post-PCR de stappen. Dit laatste punt betekent dat er minimaal risico voor besmetting van het laboratorium en het gemakkelijker aangepast aan hoge-doorvoer situaties zoals bij een uitbraak worden kan. Bovendien is het inherent gevoeliger dan conventionele rechts-PCR, die van vitaal belang voor het detecteren van lage virale belastingen in21van de infecties subklinisch. Dit zou vereisen een geneste PCR aanpak vereisen van omgekeerde transcriptie, twee verdere PCR reacties en vervolgens analyse door agarose gel elektroforese. Deze vele stappen nemen veel tijd en verhogen de kans op fouten of besmetting. Niettemin, als gevolg van de hoge gevoeligheid, RT-qPCR vraagt nauwgezette proefopzet en een grondige kennis van kwantificering technieken voor het genereren van precieze resultaten56,57.
De DNA-bindende fluorophore, SYBR Green ik is aangetoond in dit protocol. Het is een dsDNA aspecifieke DNA binden kleurstof en dus de specificiteit van de bepaling ligt geheel in de reeks inleidingen, die valse positieven58kan genereren. Dus, terwijl de dsDNA smelten kromme analyse uitgevoerd aan het einde van elke PCR een bijzonder belangrijk onderdeel van de PCR reactie is omdat het bevestigt dat slechts één PCR amplicon van de juiste Tm wordt geproduceerd (dit moet ook worden bereikt door gel elektroforese wanneer nieuwe testen worden uitgevoerd). De T-m van een fragment van DNA is afhankelijk van een aantal functies zoals lengte, GC samenstelling, reeks strand complementariteit, concentratie zo goed als op buffer onderdelen en de versterkers van de PCR. De smeltende analyses van de curve in het representatieve resultaten getoond van twee laboratoria deed niet onthullen de aanwezigheid van inleidingsdimeer of andere ongewenste PCR producten maar indien dit wordt waargenomen met andere monsters en/of experimentele opstellingen, dan zou de bepaling moeten opnieuw geoptimaliseerd. Meer geavanceerde qPCR-technologieën vereisen geen dergelijke smeltende kromme stap en inderdaad, sinds deze methoden papier werd geschreven, een TaqMan op basis TiLV RT-qPCR ontwikkeld met behulp van twee inleidingen en een sonde, waardoor het zeer specifieke TiLV34.
Ongetwijfeld, de inleidingen ontworpen voor RT-qPCR testen zijn fundamenteel voor het succes van de bepaling en de inleidingen hier waren ontworpen op basis van de openbaar beschikbare TiLV genomic gegevens op de tijd-32. RNA virussen zijn bekende hoge mutatie tarieven vertonen echter en mogelijke stammen zal ontsnappen de huidige diagnostische tests, zoals voor ISAV59werd waargenomen. Het zal altijd moeilijk zijn voor dergelijke typen van het virus voor het genereren van een universele pan-TiLV-RT-qPCR assay en deze gehaltebepalingen zal alleen worden voortdurend verbeterd als meer TiLV genomic gegevens van verregaande locaties en de termijnen beschikbaar komen.
Tot slot is het essentieel te starten dubbele of indien mogelijk, drievoudige reacties in zowel intra en inter qPCR testen. Als de Ct -waarden zeer hoog zijn, dan is het gebruik van replicaat-organismen is vooral belangrijk om te constateren dat de PCR reactie betrouwbare en reproduceerbare. In het algemeen, als gegevens uit repliceren reacties varieert meer dan 0.5 cycli, de reacties moeten worden herhaald en als de C-t -waarden variëren consequent > 0,5 cycli in repliceert, de bepaling moet opnieuw worden geoptimaliseerd. Het gebruik van een geïntegreerde qPCR pipetting robot helpt enorm met dit probleem, maar het is een luxe-tool. Als met een experiment zijn de opneming adequate en passende controles van het grootste belang aan de ontwikkeling van robuuste moleculaire tests, met name in de diagnostische laboratoria waar deze gehaltebepalingen moeten worden geaccrediteerd. Besturingselementen moeten positieve (positief TiLV monster, TiLV plasmide standaard) en negatieve controles (NTC en -RT) monsters evenals de detectie van endogene tilapia huishouding genen bevatten. Dergelijke controles niet onderschat mag worden en moeten worden opgenomen in elke assay goed inzicht hebben in de kwaliteit van elke stap van de test en de resultaten correct te interpreteren.

Het hoofd van de wereldwijde bevolking vis aanbod bereikt een nieuw record van 20 kg in 2014, en dit was als gevolg van de krachtige groei van de aquacultuur. Aquacultuur blijft een van de snelst groeiende dierlijk voedsel producerende sectoren wereldwijd en is de enige dierlijke voedselproducerende sector die sneller dan de menselijke populatie1 groeit. Tilapiine cichilds omvatten de tweede belangrijkste zoetwatervis gekweekt wereldwijd met een totale mondiale productie van 6,4 miljoen ton (MT) en een geschatte waarde van 9,8 miljard Amerikaanse dollars in 20152. De producenten van de top tien van tilapia zijn China (1.78 MT), Indonesië (1.12 MT) en Egypte (0.88 MT), gevolgd door Bangladesh, Vietnam, de Filippijnen, Brazilië, Thailand, Colombia en Oeganda2. Verwacht wordt dat globale tilapia productie ongeveer 7,3 zullen MT door 20303. Tilapia zijn dergelijke een belangrijke wereldwijde voedingsbron geworden, niet alleen omdat ze een goedkope bron van eiwit4 maar ook omdat ze gemakkelijk te kweken in capaciteit onder een brede waaier van water en klimaat voorwaarden5,6. Slechts een paar decennia geleden, men geloofde dat er maar weinig commercieel belangrijke ziekten bedreigend tilapia landbouw maar dit niet langer waar is. Een opkomende virale ziekte heet het syndroom tilapia lake virus ziekte (TiLVD) is de eerste ooit kritische ziekte epidemie gevonden in tilapia en de hele sector wordt bedreigd. Deze ziekte heeft ernstige sociaal-economische gevolgen en is een directe bedreiging voor de voedselzekerheid voor miljoenen mensen in Afrika7, Azië en Zuid-Amerika. Aan het begin van 2018, de Wereldorganisatie voor besmettelijke veeziekten (OIE) gemeld dat het etiologische agens van deze ziekte, TiLV, officieel ontdekt was op drie continenten die betrekking hebben op acht landen8 en aangezien deze informatiekaart pathogen bijgewerkte er zijn meer meldingen van TiLV in Tanzania, Oeganda9, Indonesië10, Taiwan11 en Peru12. TiLV is een nieuwe single-stranded RNA virus beschreven om een orthomyxo-achtig virus omdat het bevat een aantal kenmerken denken aan andere orthomyoxoviruses zoals Influenza of Infectious zalmanemie virus (ISAV)13. Het werd voor het eerst geïdentificeerd in de nasleep van massale verliezen van wilde en gekweekte tilapia in het meer van Galilea, Israël-14. Daarna, soortgelijke ziekte-uitbraken aangeduid als zomer sterfte en de sterfte syndroom dat gepaard gaat met TiLV infecties werden gemeld in de Nijl tilapia (Labeo niloticus) in Egypte15 en de Nijl en rode hybride tilapia maand (Labeo spp.) in Thailand16, respectievelijk. Detectie van aquatische dieren virussen is historisch uitgevoerd door groei en isolatie van virus in celkweek. Verschillende cellijnen zijn getest voor de vermeerdering en de isolatie van TiLV met inbegrip van, E-11 cellen afgeleid van snakehead vis (Ophiocephalus striatus)17,18, OmB en TmB afkomstig uit Labeo fimbriatus18, en OnlB en OnlL van oorsprong van de Nijl tilapia (O. niloticus)19. Terwijl virus cultuur het voordeel dat het levert materiaal voor verdere experimenten, heeft het het nadeel dat het vereist ten minste 4-7 dagen om te observeren van de vorming van cytopathogeen effect (CPE) en cruciaal, verschillende piscine virussen, die meer aanpassen aan repliceren kunnen worden gekweekt en produceren van soortgelijke CPE.
In de afgelopen decennia, is er een beweging weg van traditionele, vaak tijdrovend diagnostische methoden zoals celcultuur, serologie en opsporing van antigeen en vervanging door sneller en meer gevoelige nucleic zuur gebaseerde detectie tests20, 21. Dit is duidelijk door het feit dat vele qPCR tests zijn ontwikkeld als belangrijk diagnosemethoden voor een veelheid van virale ziekten bij waterdieren, zoals voor ISAV22,23, virale hemorragische septikemie virus (VHSV)24 ,25, betanodavirus26,27 zalmachtigen alphavirus28, vis iridovirus29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30en Lymphocystis disease virus (LCDV)31 . Robuuste methoden voor diagnose en ziekteverwekker toezicht zijn dringend vereist zijn ter vermindering van de verspreiding van TiLV. Dergelijke methoden laten voor de vroegtijdige opsporing van infectie voordat klinische symptomen ontwikkelen en opsporing van lage virus ladingen. Tot op heden verschillende PCR protocollen zoals RT-PCR14,32, zijn geneste RT-PCR18, semi-geneste RT-PCR33en RT-qPCR32,34 ontwikkeld voor het opsporen van TiLV in vis weefsels. Een vergelijking van de RT-qPCR en virus isolement in gevoelig cellijnen voor detectie van de TiLV bleek dat RT-qPCR 1000 maal gevoeliger dan de virus isolatie32was. Hoewel elk gepubliceerde PCR protocol is gerapporteerd door verschillende gevoeligheden voor de detectie van TiLV, zijn de meeste testen hooggevoelige met de detectiegrenzen van virale exemplaren op 7,5 kopieën33, 7 kopieën18 of 2 kopieën32 per reactie.
Het doel van dit artikel methoden is om uit te leggen, in detail, het uitvoeren van TiLV detectie testen, beginnend met tilapia weefsel collectie, totale extractie van RNA, cDNA synthese en vervolgens TiLV specifieke PCR gebaseerde testen. In het bijzonder zijn uitgebreide protocollen van zowel conventionele rechts-PCR, en ook SYBR groen gebaseerde RT-qPCR om een beroep op een breed scala aan wetenschappers die zijn gericht op het detecteren van TiLV beschreven. Eerstgenoemde is minder gevoelig maar is meestal een goedkopere optie voor detectie. De laatste uitgebreidere infrastructuur zoals een kwantitatieve PCR-machine en duurder reagentia vereist, maar het heeft de voordelen van het kwantitatieve, snel en uiterst gevoelige, wat betekent dat het kan worden gebruikt voor de detectie van TiLV in sub klinisch besmette vis. De RT-PCR en RT-qPCR protocollen werden uitgevoerd in twee verschillende laboratoria met verschillende geografische isolaten van TiLV en de opgenomen resultaten markeren de gevoeligheid en de reproduceerbaarheid van de hier beschreven tests.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>An alternative to clove oil.&#160; 
			Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilization solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160; AM7020</td>
			<td>For storing tissues if they cannot be processed immediately 
			Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIreagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENEzol</td>
			<td>Geneaid</td>
			<td>GZR100</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisure</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38032</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homemade solution</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 
			30.45 g/L&#160; (400 mM) ammonium thiocyanate 
			8.20 g/L&#160; (100 mM) sodium acetate 
			380 mL/L&#160; (38 % v/v) phenol 
			50 mL/L (5 % v/v) glycerol 
			1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 
			Store up to 2 years at 4oC 
			Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Green Beads</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358941001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL Tube</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116913050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>RCI Labscan</td>
			<td>AR1027E-G2.5L</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9673</td>
			<td>A less toxic alternative to chloroform 
			Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (GC) &#8805; 99.8 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59300</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.09634.2500</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)</td>
			<td>R0551</td>
			<td>Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (purity (GC) &#8805; 99.9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (EMD Millipore)</td>
			<td>1.00983</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck (EMSURE)</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion TURBO DNA-free kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Can be performed at the end of the RNA extraction protocol 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viva cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>cDSK01</td>
			<td>Step 4.1 &#38; 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>A1172K</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Kit</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600107</td>
			<td>An alternative option&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase systems:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>14001012a</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - GoTaq Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separate PCR mixture components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP Mix</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NP2409</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Taq Buffer with KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00348114</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PL1202</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AB1454</td>
			<td>One step RT-PCR exemplified in Figure 3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide solution (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Tris</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PR0612-1KG</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.00063.2500</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0729</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0701-100G</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladders and markers</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NL1405</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel loading dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUP SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>A25779</td>
			<td>Exemplified in Figures4-6B 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1725120</td>
			<td>Exemplified in the video and in Figures 4-6A 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358976001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G Homogenizer</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116005500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Protocol 2 
			Step&#160;2.4, 2.7 &#38; 2.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5418R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>AccuBlock Digital Dry Bath</td>
			<td>Protocol 2 
			Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Protocol 3 
			Step 3.1 - 3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>LSE 6766</td>
			<td>Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 &#38; 6 
			Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>LioFuge</td>
			<td>LM-60</td>
			<td>Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0</td>
			<td rowspan="2">Protocol 6 
			Step 6.6-6.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Pipette-Lite XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol-barrier pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z333328, Z333336, Z333344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr

Het doel van deze methode is om de snelle, gevoelige en specifieke detectie van Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia weefsels. Dit protocol kan worden gebruikt als onderdeel van toezicht-programma's, biosecurity maatregelen en in TiLV fundamenteel onderzoekslaboratoria. De gouden standaard van de diagnostiek van het virus betekent meestal dat de isolatie van het virus gevolgd door aanvullende technieken, zoals reverse-transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR) voor verdere verificatie. Dit kan worden omslachtig en tijdrovend en vereist normaliter weefselsteekproeven zwaar besmet met het virus. Het gebruik van RT-kwantitatieve (q) PCR in de opsporing van virussen is voordelig vanwege haar kwantitatieve aard, hoge gevoeligheid, specificiteit, schaalbaarheid en zijn snelle tijd resulteren. Hier, gebaseerde de gehele methode van PCR benaderingen voor TiLV detectie beschreven, van tilapia orgel vectorafbeeldingsbestanden, totaal RNA acid (RNA) extractie met behulp van een guanidium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroformoplossing, RNA kwantificering is, gevolgd door een tweestaps PCR Protocol inhoudt, complementaire deoxyribonucleic acid (cDNA) synthese en opsporing van TiLV door conventionele PCR of kwantitatieve identificatie via qPCR met behulp van SYBR groene kleurstof ik. Conventionele PCR post-PCR de stappen vereist en zal gewoon informeren over de aanwezigheid van het virus. De laatste benadering zal zorgen voor absolute kwantificering van TiLV tot zo weinig zoals 2 exemplaren en is dus buitengewoon nuttig voor TiLV diagnose in sub klinische gevallen. Een gedetailleerde beschrijving van de twee benaderingen van PCR, representatieve resultaten uit twee laboratoria en een diepgaande bespreking van de kritische parameters van beide zijn opgenomen om ervoor te zorgen dat onderzoekers en diagnosticians hun meest geschikte en toepassing vinden methode voor de detectie van de TiLV.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR at JoVE.com

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Detectie van Tilapia Lake Virus met behulp van conventionele rechts-PCR en SYBR groene RT-qPCR

Dit protocol diagnose Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia weefsels met behulp van de RT-PCR methodes. De hele methode is beschreven van weefsel dissectie totaal RNA extractie, gevolgd door de cDNA synthese en opsporing van TiLV door conventionele PCR of kwantitatieve PCR dsDNA bindend een bindende fluorescerende kleurstof gebruiken.

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Welkom iedereen. Mijn naam is Win Surachetpong. Ik ben universitair docent diergeneeskunde en immunologie faculteit diergeneeskunde aan de Kasetstart Universiteit, Thailand.Ik en mijn team zijn gespecialiseerd in opkomende virale ziekte in tilapia. We werken nu aan het tilapiameervirus dat een hoge sterfte in tilapia veroorzaakt. Aangezien tilapia de tweede belangrijkste vissoort is die wereldwijd cultuur is, biedt het eiwitbron voor een miljoen mensen en speelt het een belangrijke rol voor de voedselzekerheid.Dus de recente uitbraak van tilapia lake virus veroorzaken sociaal-economische impact die veel wetenschappers ertoe bracht om te proberen een oplossing te vinden voor dit probleem. Tot nu toe hebben we een zeer gevoelige, snelle en nauwkeurige methode nodig om het virus op te sporen. In deze video laten we u stap voor stap zien om het tilapiameervirus te detecteren in visweefsel vanaf monsterverzameling, monsterpopulatie en realtime PCR-analyse.Ten eerste, oplos de overdosis van doek olie in water om de vis te euthanaseren. Leg de dode vissen op een dienblad, steriliseer de apparatuur met behulp van 95%ethanol, dan verbrand met een alcoholbrander. Snijd de vis langzaam open uit de onderbuik naar boven, om de lever te verzamelen.Verzamel een deel van de lever in een 1,5 milliliter centrifuge buis. Het eerste deel van de RNA-extractie moet worden uitgevoerd in een Laminar Flow Hood en beschermende apparatuur dragen. Voeg een milliliter RNA extractie reagens in de buis.Verpulver de lever met behulp van een weefsel stamper in homogeen. Voeg 200 microliter chloroform in de buis. Meng vervolgens voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren.Zet apart voor drie minuten op kamertemperatuur. Centrifuge op vier graden Celsius op 12.000 RCF gedurende 15 minuten. Verzamel de buizen voorzichtig uit de centrifuge.Breng voorzichtig 500 microliter van de kleurloze bovenste waterige fase over in een nieuwe buis. Voeg een volume isopropanol in de buis. Verwarm bij min 20 graden celsius gedurende twee uur of tot 's nachts om het RNA neer te zetten.Na de incubatie, centrifugeren de oplossing op dezelfde centrifuge voorwaarde. Verzamel de buizen van de centrifuge en gooi de supernatant weg. De RNA pellet kan worden gezien als puntig door de pijl.Voeg een milliliter van 75% ethanol in de buis om de RNA pellet te wassen, en omkeren meerdere malen. Centrifuge op vier graden Celsius, op 10.000 RCF gedurende 15 minuten. Verzamel de buizen van de centrifuge en gooi de supernatant weg.Trek de overgebleven ethanol met behulp van de automatische pipet, en de lucht droog op kamertemperatuur gedurende vijf tot 10 minuten. Voeg 30 tot 60 microliters RNase vrij water, voor opgewarmd tot 55 tot 60 graden Celsius om de RNA pellet op te nemen. Gebruik een tot twee microliters RNA-oplossing om de concentratie te meten met behulp van een micro volume spectrofotometer.De resultaten worden weergegeven op het scherm. Verdun de concentratie tot 200 nanogram per microliter met RNase vrij water. Voer cDNA synthese uit met behulp van de chemische stoffen en voorwaarden die als volgt worden vermeld.Gebruik een thermocycler om RNA om te zetten in cDNA met voorgestelde voorwaarden. De volgende zijn de chemische stoffen en voorwaarden die worden gebruikt voor het bepalen van de TiLV belasting met behulp van real-time PCR. Doe zes milliliter van de qPCR master mix in elke flacon van witte qPCR strip buis.Vervolgens wordt vier milliliter cDNA-monster in de put geladen. In dit stadium moet in elke put een nieuwe pijppunt worden vervangen om besmetting van monster tot monster te voorkomen. Sluit de qPCR-strip goed af met een transparante qPCR-stripdop.Meng de oplossing voorzichtig door op een puntje van de strip te vegen. Draai dan naar beneden met behulp van microcentrifuge om alle vloeistof te verzamelen op de bodem van de vaten. Gebruik de twee stappen voorwaarde zoals weergegeven in de video, selecteer de put in 96 goed plaat die je gaat gebruiken.Selecteer cybergroen als de flora voor kleurstof. Selecteer onbekend als voorbeeldtype en voeg een naam in een voorbeeldnaamvak. Open het deksel van een real-time PCR-machine en plaats de qPCR-strip in de toegewezen put.Sluit dan het deksel. Voer de machine uit met de geselecteerde voorwaarde. De machine start en loopt nadat het deksel de gewenste temperatuur heeft bereikt.Na het einde van qPCR-omstandigheden wordt de versterkingscurve weergegeven. Hier wijst de koerspijl aan waar het drempelniveau wordt afsnijdt tussen de exponentiële fase en de lineaire fase, wat resulteert in ct-waarde. De CT-waarde wordt vervolgens geëxtrapoleerd in virus log kopie nummer om een aantal virus blijft met behulp van de standaard curve te berekenen.De smeltpiek wordt ook weergegeven om te bepalen of het virus gedetecteerd door qPCR is, inderdaad, TiLV waarin de smeltpieken over het algemeen variëren tussen 79,5 en 80,5 graden Celsius. Dus we hopen dat deze methode zal belangrijke instrumenten voor boeren en organisaties over de hele wereld, die kunnen vereisen implementeren van een controle en de verspreiding van TiLV-infectie te beperken.

Research

JoVE Journal

Environment

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout (Salvelinus namaycush) from Its Prey

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout Salvelinus namaycush from Its Prey

Laboratorium Schatting van de netto Trofische Transfer Rendementen van PCB Congeneren naar Lake Trout (<em&gt; Salvelinus namaycush</em&gt;) Uit Zijn Prooi

A technique for laboratory estimation of net trophic transfer efficiency (&#947;) of polychlorinated biphenyl (PCB) congeners to piscivorous fish from ...

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

-Laboratorium bepaald Fosfor Flux van het meer van sedimenten als een interne maatregel Fosfor Laden

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. I. Het verzamelen van Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Meten en in kaart brengen van patronen van bodemerosie en afzetting aan de bodem carbonaat concentraties onder beheer van de landbouw gerelateerde

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Collectie en extractie van beroepsmatige Air monsters voor analyse van schimmel DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-Site moleculaire detectie van bodem-gedragen planteziekteverwekkers met behulp van een draagbare Real-Time PCR-systeem

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Specifieke en nauwkeurige detectie van de Citrus vergroening Pathogen Candidatus liberibacter spp. gebruikend conventionele PCR op Citrus blad weefselsteekproeven

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...