Name: detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr
Uploaded: 2018-11-10T12:30:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR at JoVE.com

Nous sommes reconnaissants à l’Institut de bactériologie vétérinaire, la faculté Vetsuisse, l’Université de Berne pour leur soutien. Ce travail a été financé par le Comité pour la Promotion de début carrière des chercheurs universitaires et d’égalité des sexes à la faculté Vetsuisse, Université de Berne en finançant des modèle de 120 % attribué à PN. WS et PR sont pris en charge par le Centre for Advanced Studies pour l’Agriculture et alimentation, Institut des hautes études, l’Université Kasetsart, Bangkok, Thaïlande sous la Promotion de l’enseignement supérieur recherche et National recherche Université Project of Thailand, Bureau de la Thaïlande de Commission, ministère de l’éducation, l’enseignement supérieur. Nous tenons à remercier le Dr. Kwanrawee Sirikanchana pour son récit et Piyawatchara Sikarin pour le montage de la vidéo.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

TiLV a été pour la première fois en 2014 en Israël14 et depuis, il a été identifié dans plusieurs pays dont l’Egypte, la Colombie, Inde, Malaisie, Ouganda, Tanzanie et Thaïlande15,16,18, 35 , 48. prise de conscience mondiale, en particulier, chez le tilapia pays producteurs a placé plus d’attention sur le virus et les diverses restrictions et mesures de contrôle des autorités gouvernementales ont été appliquées pour tenter de prévenir la propagation de la TiLV. Ici, un protocole détaillé pour la détection de la TiLV dans les tissus de tilapia, portant sur le prélèvement d’échantillons, ARN, essais de synthèse, de PCR et de qPCR cDNA a été expliqué. Il y a différents aspects de ces méthodes qui justifient une discussion spécifique. TiLV a été identifié chez les poissons s’étendant sur une espèce de tilapia jusqu’ici, y compris le tilapia d’élevage hybrides (O. et diverses tailles9,12,14,15,49 niloticus x o. aureus)11,14, Nile tilapia (o. niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 et rouge de tilapia (Oreochromis SP.)16,33,48,51, ainsi que dans sauvages Nile tilapia9,12, noir tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, o. aureus et T. simonis intermedia14 et très récemment TiLV a été identifié chez la carpe sauvage (Barbonymus schwanenfeldii)52. Des échantillons de tissus des organes internes (gill, rate, foie, cœur, rein) ou mucus37 peuvent être prélevés de tilapia moribond mais aussi sain quel que soit l’âge, la taille ou les espèces et traitées pour l’ARN. Au protocole d’extraction RNA total décrit utilise ici une solution de monophasique du thiocyanate de phénol et de guanidinium, qui est un agent chaotropique de dénaturation. Les tissus sont homogénéisés directement dans cette solution puis par l’ajout de chloroforme et centrifugation pour atteindre la phase de séparation dans lequel un ARN clair contenant une phase aqueuse supérieure, une interphase et une phase organique inférieure est généré. L’ARN est isolé dans la phase aqueuse par précipitation de l’isopropanol, lavée de l’ARN récupéré pour se débarrasser des contaminants. Isolement de l’ARN par cette méthodologie a été lancé par Piotr Chomczynski et Nicoletta Sacchi et parlait de guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme extraction53,54. Ce type de réactif utilisé pour l’extraction de l’ARN peut être acheté dans le commerce ou fait dans le laboratoire (voir la Table des matières pour plus d’informations). Ce protocole prend légèrement plu de méthodes fondées sur la colonne, telles que la purification à base de silice, mais en général, il est plus rentable et les rendements plus RNA.
Dans ce protocole, quantification ARN utilisant A260 valeurs a été exposée par lequel les valeurs de spectrophotométrie peuvent indiquer la qualité RNA (A260/A280 = 1,9 à 2,1). Tandis que cette méthode donnera une bonne indication de la pureté de l’échantillon, il ne peut absolument informer quant à la qualité de l’ARN extrait. Pour déterminer correctement si l’ARN est intacte ou partiellement dégradés, les échantillons peuvent être séparation par électrophorèse sur gel d’agarose dans lequel bavures du bromure d’éthidium teinté de 18 ans et bandes ARNr 28 s indiquent la dégradation de l’ARN. Vérification de la qualité de RNA peut-être inclure à l’aide d’un instrument lab-on-a-chip. En outre, il est également important de digérer l’ARN purifié à la DNase pour éliminer la contamination héberger l’ADN génomique, qui, selon les applications en aval peut conduire à des résultats erronés. Si l’hôte ADNg est encore contaminant l’échantillon RNA dans une large mesure, un traitement supplémentaire de la DNase i peut également être effectué à la fin de la procédure d’extraction de RNA (voir Table des matières).
Synthèse de l’ADN complémentaire peut influer grandement sur les résultats globaux de qPCR et constitue un aspect de la méthode qui peut introduire des variations. Le protocole d’ADNc préconisé ici comprend une installation de composant unique à l’aide d’oligo (dT) et donc seulement transcrit mRNA contenant la queue polyA. Il permet le contrôle utilisateur d’exactement quels composants à utiliser dans la réaction de transcription inverse et ce mode de cDNA de synthèse s’est avérée fructueuse pour TiLV détection32. Une alternative à ce set-up est un acheté dans le commerce-mélange réactionnel contenant tous les composants requis pour la réaction de transcription inverse et est très rapide et simple sans le Protocole habituel de plusieurs étape, pipetage et multi-température. C’est avantageux car il réduit la manutention et favorise l’uniformité dans l’ensemble de tous les échantillons. Ces mélanges en maître incluent souvent les oligo (décollement) et amorces aléatoires rendant applicables aux différents modèles de RNA et de générer des copies de l’ADNc représentant des séquences de toute la longueur de l’ARN dans une population (viral et tilapia héberger ARNm) et en théorie, toutes espèces d’ARN désiré peuvent alors être mesurée par conventionnels PCR ou qPCR d’un tel échantillon. Cette polyvalence est le principal avantage d’une approche de RT-PCR 2 étapes ; Il offre une piscine à long terme qui peut être utilisée à de nombreuses expériences différentes. Dans les résultats, une approche de RT-PCR en une étape a été représentée dans laquelle servaient les amorces spécifiques de séquence (tableau 1) et la RT et PCR ont été effectuées dans un tube (voir la liste de matériel). En général, des amorces spécifiques de séquence permettent une plus grande efficacité de RT de l’ARN de cible spécifique que l’utilisation d’amorçage aléatoire, mais la cible RNA est le seul qui peut être quantifié dans un tel échantillon de cDNA qui peut être le seul but de certains laboratoires (voir Table des matières pour des suggestions de produit synthèse de cDNA).
Alors que la RT-PCR classique semble être communément utilisé jusqu’ici dans la TiLV diagnostic9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR s’est avéré être un outil plus puissant pour la détection et la quantification des rejets de petites quantités de TiLV dans les tissus de poissons ou de mucus32,37. En général, qPCR est largement utilisé dans les laboratoires de diagnostic de virologie clinique en raison de sa haute sensibilité, spécificité, bonne reproductibilité, une plage dynamique étendue et vitesse21. Si qPCR peut être initialement plus coûteux à mettre en oeuvre que la RT-PCR classique, il offre beaucoup d’avantages importants sur la PCR classique ; Il a un temps plus rapide retournement de l’échantillon de résultats et il ne nécessite aucune étape post-PCR. Ce dernier point signifie qu’il y a un risque minime de contamination de laboratoire et il peut s’adapter plus facilement à des situations de haut-débit comme en cas d’épidémies. En outre, il est intrinsèquement plus sensible que conventionnelle RT-PCR, ce qui est d’une importance vitale pour détecter une charge virale faible dans les infections subcliniques21. Cela nécessiterait une approche PCR imbriquée nécessitant une transcription inverse, deux davantage les réactions de PCR, analyse de gel d’agarose puis électrophorèse sur gel. Ces nombreuses étapes prennent beaucoup de temps et augmentent les chances d’erreurs ou de contamination. Néanmoins, grâce à sa haute sensibilité, RT-qPCR exige une conception expérimentale rigoureuse et une connaissance approfondie des techniques de quantification pour générer des résultats précis56,,57.
Le fluorophore de liaison ADN, SYBR Green I a été démontrée dans le présent protocole. C’est un colorant non spécifique des liaison ADN dsDNA et donc la spécificité du test se trouve entièrement dans le jeu d’amorces, ce qui peut générer des faux positifs,58. Par conséquent, alors que l’ADN double brin fonte analyse de la courbe réalisée à la fin de chaque PCR est un élément particulièrement important de la réaction PCR parce qu’elle confirme ce qu’un amplicon PCR du bon Tm est produit (Ceci devrait aussi être réalisé en gel électrophorèse lors de nouveaux tests sont en cours d’exécution). Le Tm d’un fragment d’ADN dépend d’une variété de caractéristiques telles que sa longueur, séquence, composition de GC, complémentarité des brins, la concentration ainsi que sur la mémoire tampon composants et exhausteurs de PCR. Les analyses de courbe fusion dans les résultats représentatifs, illustrés de deux laboratoires n’ont pas révélé la présence d’amorce-dimères ou autres produits PCR non désirés, mais si c’est observé avec d’autres échantillons et/ou des montages expérimentaux, puis l’essai doit être ré-optimisé. Des technologies plus avancées de qPCR ne nécessitent pas une telle mesure de courbe de fusion et en effet, depuis ce document a été rédigé, des méthodes une TaqMan basé TiLV RT-qPCR développée utilisant deux amorces et une sonde rendant hautement spécifiques TiLV34.
Sans aucun doute, les amorces conçues pour des dosages de RT-qPCR sont fondamentales pour la réussite du test et les amorces ici ont été conçus d’après les données génomiques d’accessibles TiLV à la fois32. Toutefois, les virus à ARN sont bien connus de présentent des taux de mutation élevé et souches possibles seront échapperont les tests diagnostiques actuels, comme a été observée pour l’AIS59. Il sera toujours difficile pour ces types de virus générer un universel pan-TiLV RT-qPCR analyse et ces tests seront seulement continuellement améliorées si plus TiLV données génomiques des lieux et des périodes de temps deviennent disponibles.
Enfin, il est essentiel pour courir en double ou triple si possible, les réactions dans les deux intra et inter qPCR dosages. Si les valeurs det C sont très élevés, alors que l’utilisation des répliques est particulièrement importante de s’assurer que la réaction de PCR est fiable et reproductible. En général, si répliquent des données provenant de réactions varie de plus de 0,5 cycles, les réactions doivent être répétés et si les valeurs det C varient constamment cycles > 0,5 en réplique, le dosage doit être ré-optimisé. L’utilisation d’un robot de pipetage intégrée qPCR aide énormément à cette question, mais c’est un outil de luxe. Comme pour toute expérience, les contrôles adéquats et appropriés d’inclusion sont de plus grande importance au développement de dosages moléculaires robustes, en particulier dans les laboratoires de diagnostic où ces tests doivent être accrédités. Contrôles devraient inclure positif (échantillon positif de TiLV, plasmide TiLV standard) et des échantillons témoins négatifs (NTC et -RT) ainsi que la détection des gènes domestiques tilapia endogène. Ces contrôles ne peuvent pas être sous-estimée et devraient être inclus dans chaque série de tests afin de bien comprendre la qualité de chaque étape du test et d’interpréter correctement les résultats.

L’approvisionnement en poissons habitant global a atteint un nouveau record de 20 kg en 2014 et cela était dû à une croissance vigoureuse en aquaculture. L’aquaculture reste l’une des croissances secteurs produisant les aliments pour animaux dans le monde entier et est le secteur uniquement animaux destinés à l’alimentation qui croît plus rapidement que la population humaine1. Tilapiinés cichilds constituent les deuxième plus importants poissons d’eau douce d’élevage dans le monde entier avec une production mondiale totale de 6,4 millions de tonnes (MT) et une valeur estimative de 9,8 milliards de dollars en 2015,2. Les producteurs de top dix de tilapia sont la Chine (1,78 MT), Indonésie (1,12 MT) et l’Égypte (0,88 MT), suivie du Bangladesh, Vietnam, Philippines, Brésil, Thaïlande, Colombie et en Ouganda2. Il est prévu que la production de tilapia global sera environ 7,3 MT d’ici 2030,3. Tilapia sont devenus telle une source alimentaire importante non seulement parce qu’elles représentent une source bon marchée de protéines4 mais aussi parce qu’ils sont faciles à reproduire dans un large éventail de l’eau et le climat conditions5,6au titre. Il y a quelques décennies, on a cru qu’il y avait quelques maladies commercialement significatifs du tilapia en danger mais ce n’est plus vrai. Une maladie virale émergente appelée virose tilapia lac (TiLVD) est la première épidémie de maladie critique jamais trouvé chez le tilapia et l’industrie tout entière est menacée. Cette maladie a des conséquences socio-économiques graves et est une menace directe sur la sécurité alimentaire de millions de personnes en Afrique7, Asie et Amérique du Sud. Au début de 2018, l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE) a signalé que l’agent étiologique de cette maladie, la TiLV, avait été officiellement détecté sur trois continents, qui couvre huit pays8 et étant donné que cette carte d’information agent pathogène a été mis à jour il y a signalé plus de TiLV en Tanzanie, Ouganda9, Indonésie10, Taiwan11 et Pérou12. TiLV est un virus à ARN simple brin roman décrit est un virus analogue à orthomyxo car il contient une variété de caractéristiques qui rappelle d’autres orthomyoxoviruses comme la grippe ou infectieuse anémie du saumon (AIS) de virus13. Il a été identifié à la suite de pertes massives du tilapia d’élevage et sauvage dans le lac de Galilée, Israël14. Par la suite, les éclosions de maladies semblables dénommé mortalités d’été et le délai d’un mois du syndrome de mortalité associé à une infection TiLV ont été signalés dans le tilapia du Nil (Oreochromis niloticus) en Egypte15 et du Nil et le tilapia rouge hybride (Oreochromis spp.) en Thaïlande16, respectivement. Détection de virus animaux aquatiques est historiquement réalisée par la croissance et l’isolement du virus en culture cellulaire. Diverses lignées cellulaires ont été testées pour la propagation et l’isolement des TiLV, y compris, les cellules de E-11 dérivés du poisson-serpent poisson (Ophiocephalus striatus)17,18, OmB et TmB provenant Oreochromis mossambicus18et OnlB et OnlL originaires du Nile tilapia (o. niloticus)19. Alors que la culture de virus a l’avantage qu’il fournit du matériel pour d’autres expériences, il a l’inconvénient qu’il faut au moins 4-7 jours pour observer la formation de l’effet cytopathique (ECP) et c’est essentiel, différents virus piscine, qui sont plus aptes à REPLICATE peut être multiplié et produire CPE similaire.
Dans les dernières décennies, il y a eu abandon des méthodes de diagnostic traditionnels, souvent fastidieuses telles que culture cellulaire, sérologie et détection de l’antigène et remplacement avec acide nucléique plus rapide et plus sensible basé détection essais20, 21. Cela est évident par le fait que de nombreux essais de qPCR ont été élaborés comme des méthodes de diagnostic importants pour une multitude de maladies virales chez les animaux aquatiques, comme pour AIS22,23, virus de la septicémie hémorragique virale (SHV)24 ,25, bétanodavirus26,27 alphavirus salmonidés28, poisson iridovirus29, anguillidés herpèsvirus de type 1 (AngHV1)30et Lymphocystis maladie virus (LCDV)31 . Méthodes robustes pour la surveillance de diagnostic et les agents pathogènes sont urgemment requis pour réduire la propagation de la TiLV. Ces méthodes devraient permettre la détection précoce de l’infection avant les signes cliniques se développent et de détection de virus faibles charges. À ce jour, différents protocoles PCR dont RT-PCR14,32, imbriqués de RT-PCR18, semi imbriquées RT-PCR33et RT-qPCR32,,34 ont été développés pour la détection des TiLV dans les tissus des poissons. Une comparaison d’isolement RT-qPCR et virus dans des lignées de cellules sensibles pour la détection de la TiLV a révélé que la RT-qPCR était 1 000 fois plus sensible que l' isolement de virus32. Bien que chaque protocole PCR publiée a rapporté des sensibilités différentes pour la détection des TiLV, la plupart des tests sont très sensibles avec les limites de détection de copies virales à 7,5 copies33, 7 exemplaires18 ou 2 copies32 par réaction.
Le but de cet article des méthodes est d’expliquer, en détail, comment réaliser des tests de détection TiLV, commençant par prélèvement tissulaire de tilapia, à extraction totale de l’ARN, synthèse de cDNA et puis TiLV PCR spécifique basé dosages. Plus précisément, les protocoles complets de RT-PCR classique et également axée sur le vert SYBR RT-qPCR ont été décrits faire appel à un large éventail de scientifiques visant à détecter la TiLV. Le premier est moins sensible mais est généralement une option moins onéreuse de détection. Cette dernière nécessite des infrastructures plus élaborées comme une machine PCR quantitative et réactifs plus chers, mais il a l’avantage d’être quantitative, rapide et très sensible, ce qui signifie qu’il peut être utilisé pour la détection des TiLV dans infraclinique poissons infectés. La RT-PCR et la RT-qPCR protocoles ont été réalisées dans deux laboratoires différents avec des isolats géographiques distincts de TiLV et l’inclus résultats mettent en évidence la sensibilité et la reproductibilité des essais décrits ici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>An alternative to clove oil.&#160; 
			Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilization solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160; AM7020</td>
			<td>For storing tissues if they cannot be processed immediately 
			Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIreagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENEzol</td>
			<td>Geneaid</td>
			<td>GZR100</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisure</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38032</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homemade solution</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 
			30.45 g/L&#160; (400 mM) ammonium thiocyanate 
			8.20 g/L&#160; (100 mM) sodium acetate 
			380 mL/L&#160; (38 % v/v) phenol 
			50 mL/L (5 % v/v) glycerol 
			1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 
			Store up to 2 years at 4oC 
			Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Green Beads</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358941001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL Tube</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116913050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>RCI Labscan</td>
			<td>AR1027E-G2.5L</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9673</td>
			<td>A less toxic alternative to chloroform 
			Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (GC) &#8805; 99.8 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59300</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.09634.2500</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)</td>
			<td>R0551</td>
			<td>Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (purity (GC) &#8805; 99.9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (EMD Millipore)</td>
			<td>1.00983</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck (EMSURE)</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion TURBO DNA-free kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Can be performed at the end of the RNA extraction protocol 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viva cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>cDSK01</td>
			<td>Step 4.1 &#38; 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>A1172K</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Kit</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600107</td>
			<td>An alternative option&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase systems:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>14001012a</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - GoTaq Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separate PCR mixture components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP Mix</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NP2409</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Taq Buffer with KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00348114</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PL1202</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AB1454</td>
			<td>One step RT-PCR exemplified in Figure 3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide solution (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Tris</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PR0612-1KG</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.00063.2500</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0729</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0701-100G</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladders and markers</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NL1405</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel loading dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUP SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>A25779</td>
			<td>Exemplified in Figures4-6B 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1725120</td>
			<td>Exemplified in the video and in Figures 4-6A 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358976001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G Homogenizer</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116005500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Protocol 2 
			Step&#160;2.4, 2.7 &#38; 2.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5418R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>AccuBlock Digital Dry Bath</td>
			<td>Protocol 2 
			Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Protocol 3 
			Step 3.1 - 3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>LSE 6766</td>
			<td>Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 &#38; 6 
			Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>LioFuge</td>
			<td>LM-60</td>
			<td>Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0</td>
			<td rowspan="2">Protocol 6 
			Step 6.6-6.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Pipette-Lite XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol-barrier pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z333328, Z333336, Z333344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr

Cette méthode vise à faciliter la détection rapide, sensible et spécifique du Virus de lac de Tilapia (TiLV) dans les tissus de tilapia. Ce protocole peut être utilisé dans le cadre de programmes de surveillance, les mesures de biosécurité dans les laboratoires de recherche fondamentale TiLV. L’étalon-or des diagnostics de virus implique généralement l’isolement du virus suivie des techniques complémentaires telles que de la réaction en chaîne polymérase de transcription inverse (RT-PCR) pour vérification supplémentaire. Cela peut être fastidieux, chronophage et nécessite généralement des échantillons de tissus fortement infectés par le virus. L’utilisation de RT-quantitative (q) PCR dans la détection des virus est avantageuse en raison de sa nature quantitative, haute sensibilité, spécificité, évolutivité et son temps rapide causera. Ici, l’ensemble de la méthode de PCR basée approches pour TiLV détection est décrite, de tilapia orgue sectionnement, total acide ribonucléique (ARN) extraction à l’aide d’une solution de thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidium, quantification de RNA, suivie d’une PCR en deux étapes entraînant le protocole, la synthèse de l’acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) et la détection de TiLV par PCR classique ou identification quantitative via qPCR SYBR green à l’aide de je le teindre. PCR classique exige des étapes post-PCR et informera simplement la présence du virus. Cette dernière approche permettra de quantification absolue de la TiLV vers le bas pour aussi peu que 2 exemplaires et est donc particulièrement utile pour le diagnostic de la TiLV en cas subcliniques. Une description détaillée des deux approches de la PCR, des résultats représentatifs de deux laboratoires et une étude approfondie des paramètres critiques de tous les deux ont été incluses pour garantir que les chercheurs et les diagnostiqueurs trouvent leur plus convenables et il y a lieu méthode de détection TiLV.

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Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Détection de Tilapia lac Virus à l’aide de RT-PCR classique et SYBR Green RT-qPCR

Ce protocole diagnostique Tilapia lac Virus (TiLV) dans les tissus de tilapia à l’aide de méthodes de RT-PCR. L’ensemble de la méthode est décrite de la dissection des tissus à l’extraction d’ARN totale, suivie de la synthèse de cDNA et détection de TiLV par PCR classique ou PCR quantitative à l’aide d’ADN double brin contraignant un colorant fluorescent obligatoire.

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Bienvenue à tous. Je m’appelle Win Surachetpong. Je suis professeur adjoint à la Faculté de microbiologie vétérinaire et d’immunologie de médecine vétérinaire de l’Université Kasetstart, en Thaïlande.Mon équipe et moi nous spécialisons dans les maladies virales émergentes dans le tilapia. Nous travaillons maintenant sur le virus du lac tilapia qui cause une mortalité élevée dans le tilapia. Étant donné que le tilapia est la deuxième espèce de poisson la plus importante qui est la culture dans le monde, il fournit une source de protéines pour un million de personnes et joue un rôle important pour la sécurité alimentaire.Ainsi, la récente éclosion du virus du lac tilapia a eu un impact socioéconomique qui a amené de nombreux scientifiques à essayer de trouver une solution à ce problème. Jusqu’à présent, nous avons besoin d’une méthode très sensible, rapide et précise pour détecter le virus. Dans cette vidéo, nous vous montrerons étape par étape pour détecter le virus du lac tilapia dans les tissus des poissons à partir de la collecte d’échantillons, de la population d’échantillons et de l’analyse pcr en temps réel.Tout d’abord, solubiliser le surdosage d’huile de tissu dans l’eau pour euthanasier le poisson. Placez le poisson mort sur un plateau, stérilisez l’équipement à l’aide de 95 % d’éthanol, puis brûlez avec un brûleur d’alcool. Coupez lentement le poisson du bas-ventre vers le haut, pour recueillir le foie.Recueillir une partie du foie dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. La première partie de l’extraction de l’ARN doit être effectuée dans un capot d’écoulement Laminar, et porter de l’équipement de protection. Ajouter un millilitre de réadage d’extraction d’ARN dans le tube.Pulvériser le foie à l’aide d’un pilon tissulaire en homogène. Ajouter 200 microlitres de chloroforme dans le tube. Ensuite, mélanger délicatement en inversant le tube plusieurs fois.Réserver pendant trois minutes à température ambiante. Centrifugeuse à 4 degrés Celsius à 12 000 RCF pendant 15 minutes. Recueillir soigneusement les tubes de la centrifugeuse.Transférer délicatement 500 microlitres de la phase incolore supérieure aqueuse dans un nouveau tube. Ajouter un volume d’isopropanol dans le tube. Chauffer à moins 20 degrés Celsius pendant deux heures ou jusqu’à la nuit pour précipiter l’ARN.Après l’incubation, centrifuger la solution à la même condition de centrifugeuse. Recueillir les tubes de la centrifugeuse, puis jeter le supernatant. La pastille d’ARN peut être considérée comme pointée par la flèche.Ajouter un millilitre de 75 % d’éthanol dans le tube pour laver la pastille d’ARN et inverser plusieurs fois. Centrifugeuse à 4 degrés Celsius, à 10 000 RCF pendant 15 minutes. Recueillir les tubes de la centrifugeuse, puis jeter le supernatant.Sortir les restes d’éthanol à l’aide du tuyau automatique et sécher à l’air sec à température ambiante pendant cinq à dix minutes. Ajouter 30 à 60 microlitres d’eau libre RNase, préchauffé à 55 à 60 degrés Celsius pour solubiliser la pastille d’ARN. Utilisez un à deux microlitres de solution ARN pour mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre à micro volume.Les résultats s’afficheront à l’écran. Diluer la concentration à 200 nanogrammes par microlitre à l’aide d’eau libre RNase. Effectuez la synthèse de l’ADN à l’aide des produits chimiques et des conditions énumérés comme suit.Utilisez un thermocycleur pour convertir l’ARN en ADND avec des conditions suggérées. Ce qui suit sont les produits chimiques et les conditions utilisées pour déterminer la charge TiLV en utilisant pcr en temps réel. Distribuez six millilitres du mélange principal qPCR dans chaque flacon de tube blanc de bande qPCR.Par la suite, quatre millilitres d’échantillon d’ADNC sont chargés dans le puits. À ce stade, une nouvelle pointe de tuyau doit être changée dans chaque puits, afin d’éviter la contamination d’un échantillon à l’autre. Scellez hermétiquement la bande qPCR avec un bouchon de bande qPCR transparent.Mélanger délicatement la solution en feuilletant à une pointe de la bande. Puis tourner vers le bas à l’aide de micro centrifugeuse pour recueillir tout le liquide au fond des navires. Utilisez l’état en deux étapes comme indiqué dans la vidéo, sélectionnez le puits dans 96 plaque de puits que vous allez utiliser.Sélectionnez cyber vert comme la flore pour teindre. Sélectionnez inconnu comme type d’échantillon, et insérez un nom dans une boîte de nom d’échantillon. Ouvrez le couvercle d’une machine PCR en temps réel et placez la bande qPCR dans le puits assigné.Ensuite, fermez le couvercle. Exécutez la machine avec la condition sélectionnée. La machine démarre et fonctionne après que le couvercle ait atteint la température désirée.Après la fin des conditions qPCR, la courbe d’amplification est affichée. Ici, la flèche de taux indique où le seuil se coupe entre la phase exponentielle et la phase linéaire qui se traduit par une valeur CT. La valeur CT est ensuite extrapolée dans le numéro de copie de journal de virus pour calculer un certain nombre de restes de virus en utilisant la courbe standard.Le pic de fonte est également affiché pour identifier si le virus détecté par qPCR est, en effet, TiLV dans lequel les pics de fonte varient généralement entre 79,5 et 80,5 degrés Celsius. Nous espérons donc que cette méthode sera un outil important pour les agriculteurs et l’organisation du monde entier, qui peuvent avoir besoin de mettre en œuvre un contrôle et de limiter la propagation de l’infection tilv.

Research

JoVE Journal

Environment

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout (Salvelinus namaycush) from Its Prey

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout Salvelinus namaycush from Its Prey

Laboratoire Estimation des gains en efficience de transfert net trophiques des congénères de PCB dans le lac Trout (<em&gt; Salvelinus namaycush</em&gt;) De sa proie

A technique for laboratory estimation of net trophic transfer efficiency (&#947;) of polychlorinated biphenyl (PCB) congeners to piscivorous fish from ...

Recherche

Environnement

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

Déterminé en laboratoire Phosphore Flux de sédiments lacustres en tant que mesure de phosphore interne Chargement en cours

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

Méthode EPA 1615. Mesure de entérovirus et Norovirus présence dans l&#39;eau par Culture et RT-qPCR. I. Prélèvement des échantillons de virus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus Présence dans l&#39;eau par la culture et de RT-qPCR. II. Total des cultivable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

Méthode EPA 1615. Mesure des entérovirus et Norovirus présence dans l&#39;eau par la culture et RT-qPCR. Partie III. Détection de virus par RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Mesure et cartographie des schémas d’érosion et de dépôt liées aux Concentrations de Carbonate du sol sous gestion agricole

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

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On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

Sur le site Molecular Detection of phytopathogènes transmises par le sol à l’aide d’un système PCR en temps réel Portable

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Spécifique et une détection précise de Using PCR classique sur des échantillons de tissus foliaires agrumes Citrus Greening pathogène Candidatus liberibacter spp.

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

Détection des virus de bioaérosols à l’aide de résine échangeuse d’anions

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...