Name: detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr
Uploaded: 2018-11-10T12:30:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR at JoVE.com

Wir sind dankbar, das Institut für Veterinär Bakteriologie, Vetsuisse-Fakultät, Universität Bern für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Komitee für akademische Förderung des wissenschaftlichen Nachwuchses und der Gleichstellung der Geschlechter an der Vetsuisse-Fakultät, Universität Bern von 120 % Finanzierung Modell finanziert an PN vergeben. WS und PR werden vom Center for Advanced Studies unterstützt für Landwirtschaft und Nahrungsmittel, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand unter der Hochschulbildung Forschungsförderung und nationale Forschung Universität Projekt von Thailand, Büro der Hochschulbildung Kommission, Bildungsministerium, Thailand. Wir möchten danken Dr. Kwanrawee Sirikanchana für ihre Erzählung und Piyawatchara Sikarin für die Videobearbeitung.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

TiLV wurde erstmals im Jahr 2014 in Israel14 gemeldet und seitdem wurde es in mehreren Ländern, darunter Ägypten, Kolumbien, Indien, Malaysia, Uganda, Tansania und Thailand15,16,18, identifiziert 35 , 48. globales Bewusstsein, insbesondere in Tilapia produzierenden Ländern mehr Aufmerksamkeit auf das Virus und verschiedene Einschränkungen und Kontrollmaßnahmen von Regierungsbehörden haben versucht, die Ausbreitung von TiLV umgesetzt worden. Hier wurde ein detailliertes Protokoll zur TiLV Erkennung im Tilapia Gewebe, für Musterkollektion, RNA-Isolierung, cDNA Synthese, PCR und qPCR Assays erläutert. Es gibt verschiedene Aspekte dieser Methoden, die eine spezifische Diskussion zu rechtfertigen. TiLV wurde in Fisch überspannt eine Vielzahl Größen9,12,14,15,49 und Arten von Tilapia bisher einschließlich gezüchteten Hybriden Tilapia (O. identifiziert Niloticus x O. Aureus)11,14, Nil Tilapia (O. Niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 und roter Tilapia (Oreochromis SP.()16,33,48,51, wie auch in wilden Nile Tilapia9,12, schwarz Tilapia51, T. Zilli14,15, S. Galilaeus, O. Aureus und T. Simonis Intermedia14 und vor kurzem TiLV wurde in Wildkarpfen (Barbonymus identifiziert Schwanenfeldii)52. Gewebeproben von inneren Organen (Kieme, Milz, Leber, Herz, Kopf Niere) oder Schleim37 können von gesunden sowie sterbenden Tilapia unabhängig von Alter, Größe oder Art gesammelt und zur RNA-Isolierung verarbeitet werden. Das Gesamt RNA Extraktion Protokoll beschriebenen verwendet hier eine monophasische Lösung von Phenol und Guanidinium-Thiocyanat, die ein chaotropen denaturierenden Agent ist. Die Gewebe werden direkt in dieser Lösung gefolgt von dem Zusatz von Chloroform und Zentrifugation Phasentrennung zu erreichen, wobei eine klare RNA mit oberen wässrigen Phase, eine Interphase und eine geringere organische Phase erzeugt wird, homogenisiert. Die RNA ist isoliert von der wässrigen Phase durch Isopropanol-Fällung, gefolgt von der wiederhergestellten RNA get rid of Verschmutzungen waschen. Isolierung der RNA durch diese Methodik wurde Pionierarbeit von Piotr Chomczynski und Nicoletta Sacchi und wurde als Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform Extraktion53,54bezeichnet. Diese Art von Reagenz für die RNA-Extraktion verwendet im Handel gekauft werden oder im Labor gemacht (siehe die Tabelle der Materialien für weitere Informationen). Dieses Protokoll dauert etwas länger als das Spalte-basierte Methoden wie die Silica-basierten Reinigung, aber im Allgemeinen es ist kostengünstiger und ergibt mehr RNA.
In diesem Protokoll Quantifizierung der RNA mit A260 Werten wurde skizziert, wobei Spektralphotometrie Werte RNS-Qualität zeigen können (A260/A280 = 1,9-2,1). Während diese Methode einen guten Indikator für Probe Reinheit geben wird, kann nicht es absolut über die Qualität der extrahierten RNA informieren. Um richtig festzustellen, ob die RNA intakt oder teilweise abgebaut ist, können Proben Trennung durch Agarose-Gelelektrophorese wobei Verschmieren der die EtBr 18 gebeizt und 28 s rRNA zeigen RNA-Abbau. Weitere Überprüfung der RNS-Qualität zählen mit einem Lab-on-a-Chip-Instrument. Darüber hinaus ist es auch wichtig, die gereinigte RNA mit DNase verdauen ich verunreinigen entfernen host genomischen DNA, die abhängig von den nachgelagerten Anwendungen zu falschen Ergebnissen führen kann. Wenn Host gDNA RNS-Probe zu einem großen Teil noch verunreinigt ist, kann auch eine zusätzliche Behandlung der DNaseI am Ende des Verfahrens RNA-Extraktion durchgeführt werden (siehe Tabelle der Materialien).
Komplementären DNA-Synthese kann großen Einfluss auf das Gesamtergebnis qPCR und ist ein Aspekt der Methode, die Variation einführen kann. Die cDNA-Protokoll befürwortet hier besteht aus einer einzelnen Komponente-Aufstellung mit Oligo (dT) und somit nur transkribiert mRNAs mit PolyA Schwänzen. Es ermöglicht die Benutzer die Kontrolle der genau welche, die Komponenten zur Verwendung in der reversen Transkription Reaktion und diese Art der cDNA Synthese für TiLV Erkennung32bewährt hat. Eine Alternative zu diesem Set-up ist ein kommerziell gekauften Master-Mix enthält alle Komponenten für die reverse Transkription Reaktion und ist sehr schnell und einfach ohne die üblichen mehrstufigen, pipettieren und Multi-Temperatur-Protokoll. Dies ist vorteilhaft, weil es minimiert die Handhabung und fördert die Einheitlichkeit in allen Proben. Solche Meister-Mischungen enthalten häufig oligo(dT) und zufällige Primer, so dass es für verschiedene RNA-Vorlagen und repräsentative cDNA Kopien der Sequenzen aus der gesamten Länge des RNAs in einer Population zu generieren (virale und Tilapia mRNA hosten) und in der Theorie, jede gewünschte RNA-Spezies kann dann durch konventionelle PCR oder qPCR von solch einer Probe gemessen werden. Diese Vielseitigkeit ist der Hauptvorteil eines 2-Stufen-RT-PCR-Ansatzes; Freuen Sie sich auf einen langfristigen Pool, der für viele verschiedene Experimente verwendet werden kann. In den Ergebnissen ist ein One-Step RT-PCR-Ansatz vertreten wobei Sequenz spezifische Primer (Tabelle 1) dienten und die RT und PCR wurden in eine Röhre durchgeführt (siehe Materialliste). In der Regel spezifische Primer Sequenz ermöglichen eine höhere Effizienz der RT der zielgruppenspezifischen RNA als zufällige Grundierung zu verwenden, aber das bestimmte Ziel-RNA ist die einzige, die in solch einer cDNA-Probe quantifiziert werden kann, die das einzige Ziel von bestimmten Laboratorien sein können (siehe Tabelle der Materialien für Produktvorschläge cDNA Synthese).
Während konventionelle RT-PCR erscheint häufig verwendet werden bisher in der TiLV Diagnose9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR hat gezeigt, dass ein leistungsfähigeres Tool für die Erkennung und Quantifizierung von geringen Mengen an TiLV in Fisch Geweben oder Schleim32,37sein. Im Allgemeinen ist qPCR in klinische Virologie Diagnostiklabors aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, Spezifität, gute Reproduzierbarkeit, Dynamikbereich und Geschwindigkeit21verbreitet. Während qPCR zunächst teurer als bei herkömmlichen RT-PCR kann, bietet es viele wichtige Vorteile gegenüber konventionellen PCR; Es hat eine schnellere Turnaround-Zeit von Probe zu Ergebnissen und Post-PCR-Schritte ist nicht erforderlich. Dieser letzte Punkt bedeutet, dass es minimales Risiko für Labor-Kontamination gibt und es sich leichter anpassen Hochdurchsatz-Situationen wie z. B. bei Ausbrüchen lässt. Darüber hinaus ist es von Natur aus empfindlicher als herkömmliche RT-PCR, die von entscheidender Bedeutung für niedrige Viruslast in subklinische Infektionen21zu erkennen ist. Dies würde einen verschachtelten PCR-Ansatz erfordert reverse Transkription, zwei weitere PCR-Reaktionen und Analyse von Agarose-gel-Elektrophorese. Diese viele Schritte nehmen viel Zeit und erhöhen die Chancen auf Fehler oder Kontamination. Dennoch aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit verlangt RT-qPCR sorgfältige experimentelles Design und ein gründliches Verständnis der Quantifizierung Techniken zur Erzeugung von präzise Ergebnisse56,57.
Die DNA-Bindung Fluorophor, SYBR Green nachgewiesen in diesem Protokoll. Es ist ein DsDNA unspezifischen DNA bindenden Farbstoff und die Spezifität des Assays liegt somit vollständig in das Set der Zündkapseln, die Fehlalarme58erzeugen kann. Daher, während die DsDNA schmelzen Kurvenanalyse am Ende von jedem PCR durchgeführt ein besonders wichtiger Bestandteil der PCR-Reaktion ist, denn es, dass nur eine PCR Amplifikate der richtige T bestätigtm entsteht (sollte auch dies durch Gel Elektrophorese, wenn neue Assays umgesetzt werden). Tm eines DNA-Fragments ist abhängig von einer Vielzahl von Funktionen wie Länge, GC Zusammensetzung, Sequenz, Strang Komplementarität, Konzentration sowie auf Puffer-Komponenten und PCR-Enhancer. Die schmelzenden Kurve Analysen in die repräsentativen Ergebnisse von zwei Labors ergab das Vorhandensein von Primer-Dimere oder andere unerwünschte PCR-Produkte, aber wenn dies mit anderen Proben und/oder Versuchsanordnungen beobachtet wird, dann sollte der Test sein neu optimiert. Erweiterte qPCR Technologien erfordern keine solchen schmelzenden Kurve Schritt und in der Tat, da diese Methoden, wie Papier geschrieben wurde, eine TaqMan basierend TiLV RT-qPCR entwickelt wurde unter Verwendung zwei Zündkapseln und einer Sonde, so dass es sehr spezifische TiLV34.
Zweifellos die Primer entwickelt für RT-qPCR-Assays sind grundlegend für den Erfolg des Tests und die Primer hier wurden entwickelt, basiert auf öffentlich zugänglichen TiLV genomischen Daten zur Zeit32. Allerdings RNA-Viren sind bekannt für hohe Mutationsraten aufweisen und mögliche Belastungen werden die aktuellen diagnostischen Tests zu entkommen, da für ISAV59beobachtet wurde. Werden immer schwierig für solche Virustypen generieren eine universelle Pfanne-TiLV RT-qPCR-Assay und solche Tests nur kontinuierlich verbessert werden wenn mehr TiLV Genomdaten von weitreichenden Orte und Zeiträume zur Verfügung stehen.
Schließlich ist es wichtig, doppelte laufen oder wenn möglich, dreifacher Reaktionen in beide Intra und inter qPCR-Assays. Wenn die C-t -Werte sehr hoch sind, ist die Verwendung von Wiederholungen besonders wichtig festzustellen, dass die PCR-Reaktion zuverlässig und reproduzierbar ist. Im Allgemeinen wenn Daten replizieren Reaktionen variiert mehr als 0,5 Zyklen, die Reaktionen sollte wiederholt werden und wenn die C-t -Werte konsequent > 0,5 Zyklen variieren repliziert, die Probe erneut optimiert werden sollte. Die Verwendung einer integrierten qPCR Pipettierroboter hilft ungemein mit diesem Thema, aber es ist ein Luxus-Werkzeug. Wie bei jedem Experiment sind die Aufnahme geeignete und angemessene Kontrollen von größter Bedeutung für die Entwicklung von robusten molekularer Assays, vor allem in diagnostischen Labors, wo solche Tests müssen akkreditiert sein. Kontrollen sollten positiv (positive TiLV Probe, TiLV Plasmid standard) und Negativkontrollen (NTC und -RT) Proben sowie die Erkennung von endogenen Tilapia-Housekeeping-Gene enthalten. Solche Kontrollen darf nicht unterschätzt werden und sollte in jeder Probe, die Qualität der einzelnen Schritte des Tests richtig zu verstehen und richtig interpretieren die Ergebnisse aufgenommen werden.

Die global-Kopf-Versorgung mit Fisch erreicht einen neuen Rekordwert von 20 kg im Jahr 2014 und das war aufgrund des kräftigen Wachstums in der Aquakultur. Aquakultur bleibt eine der am schnellsten wachsenden tierische Lebensmittel produzierenden Sektoren weltweit und ist der nur tierische Lebensmittel produzierenden Sektor, der schneller als die menschliche Bevölkerung1 wächst. Tilapiine Cichilds umfassen die zweitwichtigste Süßwasserfische weltweit mit einer weltweiten Gesamtproduktion von 6,4 Millionen Tonnen (MT) und einen geschätzten Wert von 9,8 Milliarden US-Dollar im Jahr 20152bewirtschaftet. Die Top-Ten-Produzenten von Tilapia sind China (1,78 MT), Indonesien (1.12 MT) und Ägypten (0,88 MT), gefolgt von Bangladesch, Vietnam, den Philippinen, Brasilien, Thailand, Kolumbien und Uganda2. Es wird erwartet, dass globale Tilapia Produktion rund 7,3 MT 20303. Tilapia sind solche eine wichtige globale Nahrungsquelle geworden, nicht nur weil sie eine preiswerte Quelle für Protein4 sondern auch weil sie leicht zu züchten in Kapazität unter einer Vielzahl von Wasser und Klima Bedingungen5,6. Vor ein paar Jahrzehnten glaubte man, dass gab es einige kommerziell bedeutenden Krankheiten bedrohen Tilapia Landwirtschaft aber das ist nicht mehr wahr. Eine aufstrebende Viruserkrankung namens Tilapia See Viruskrankheit (TiLVD) ist die erste jemals kritische Krankheit-Epidemie in Tilapia gefunden und die gesamte Branche ist gefährdet. Diese Krankheit hat gravierende sozio-ökonomischen Folgen und ist eine direkte Bedrohung auf die Ernährungssicherheit für Millionen von Menschen in Afrika7, Asien und Südamerika. Zum Jahresbeginn 2018 berichtet der Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE), dass die ätiologische Agenten dieser Krankheit, TiLV, offiziell entdeckt worden waren, auf drei Kontinenten über acht Länder8 und da war dieser Erreger-Informationskarte Es aktualisiert wurden weitere Berichte des TiLV in Tansania, Uganda9, Indonesien10, Taiwan11 und Peru12. TiLV ist eine neuartige einsträngige RNA-Virus beschrieben, um eine Orthomyxo-ähnliche Viren sein, denn es eine Vielzahl von Eigenschaften erinnert an andere Orthomyoxoviruses wie Grippe oder infektiösen Lachsanämie Virus (ISAV)13 enthält. Es wurde zuerst in der Nachmahd von massiven Verlusten von wilden und gezüchteten Tilapia in den See von Galiläa, Israel14gekennzeichnet. Danach genannten ähnliche Ausbrüche von Krankheiten als Sommer-Sterblichkeit und die einmonatige Sterblichkeit-Syndrom mit TiLV Infektion assoziiert wurden im Nil Tilapia (Oreochromis Niloticus) in Ägypten15 und Nil und roten Hybrid Tilapia gemeldet (Oreochromis spp.) in Thailand16beziehungsweise. Erkennung von aquatischen tierischen Viren erfolgt historisch durch Wachstum und Isolierung von Viren in Zellkultur. Verschiedene Zelllinien wurden für die Ausbreitung und die Isolierung von TiLV einschließlich e-11 Zellen aus Snakehead Fisch (Ophiocephalus Striatus)17,18, OmB und TmB aus Oreochromis getestet Mossambicus18, und OnlB und OnlL aus Nil Tilapia (O. Niloticus)19. Während Virus Kultur den Vorteil hat, dass es Material für weitere Experimente bietet, hat es den Nachteil, dass es mindestens 4 bis 7 Tage erfordert, die Bildung von zytopathischen Effekte (CPE) zu beobachten und natürlich verschiedene piscine Viren, fitter sind replizieren kann weitergegeben werden und produzieren ähnliche CPE.
In den letzten Jahrzehnten gab es eine Abkehr von der traditionellen, oft zeitaufwändige diagnostische Methoden wie Zellkultur, Serologie und Antigennachweis und Ersatz mit schneller und empfindlicher Nukleinsäure-basierte Erkennung Tests20, 21. Dies wird deutlich durch die Tatsache, die viele qPCR-Assays für ISAV22,23, virale hämorrhagische Blutvergiftung Virus (VHSV)24 als wichtige diagnostische Methoden für eine Vielzahl von Viruserkrankungen in Wassertiere, wie z. B. entwickelt wurden ,25, Betanodavirus26,27 Lachsfische Alphavirus28, Fisch Iridovirus29, Anguillid Herpesvirus 1 (AngHV1)30und Lymphocystis Krankheit-Virus (LCDV)31 . Robuste Methoden für Diagnose und Erreger Überwachung sind dringend erforderlich, um die Verbreitung der TiLV zu verringern. Solche Methoden sollen frühzeitige Erkennung der Infektion, bevor klinische Symptome entwickeln und Erkennung von niedrigen Virus Lasten. Heute, verschiedene PCR-Protokolle einschließlich der RT-PCR14,32, nested RT-PCR18, halb-verschachtelte RT-PCR33und RT-qPCR32,34 für den Nachweis von TiLV entstanden im Gewebe der Fische. Ein Vergleich der RT-qPCR und Virus Isolation in anfälligen Zelllinien für die Erkennung der TiLV ergab, dass RT-qPCR 1.000 Mal empfindlicher als die Virus-Isolation-32. Obwohl jedes veröffentlichte PCR-Protokoll unterschiedliche Empfindlichkeit für den Nachweis von TiLV gemeldet hat, sind die meisten Tests sehr empfindlich mit der Nachweisgrenzen der viralen Kopien auf 7,5 Kopien33, 7 Kopien18 oder 2 Kopien32 pro Reaktion.
Diese Methoden Artikel soll erklären, im Detail, wie TiLV-Erkennung-Assays, beginnend mit Tilapia Gewebe Sammlung, total RNA-Extraktion, cDNA Synthese durchführen und dann TiLV spezifische PCR Assays basiert. Insbesondere wurden umfassende Protokolle von konventionellen RT-PCR und SYBR Green-basierte RT-qPCR Appell an eine Vielzahl von Wissenschaftlern mit dem Ziel, TiLV zu erkennen beschrieben. Erstere ist weniger empfindlich, aber ist in der Regel eine billigere Option Erkennung. Letzteres erfordert komplexere Infrastruktur wie eine quantitative PCR-Maschine und teurer Reagenzien, aber es hat die Vorteile der quantitativen, schnell und sehr empfindlich, was bedeutet, dass es für den Nachweis von TiLV im Sub klinisch verwendet werden kann infizierte Fische. Die RT-PCR und RT-qPCR Protokolle wurden in zwei verschiedenen Labors mit unterschiedlichen geographischen Isolaten von TiLV und die enthaltenen Ergebnisse Highlight die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der hier beschriebenen Tests durchgeführt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>An alternative to clove oil.&#160; 
			Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilization solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160; AM7020</td>
			<td>For storing tissues if they cannot be processed immediately 
			Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIreagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENEzol</td>
			<td>Geneaid</td>
			<td>GZR100</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisure</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38032</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homemade solution</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 
			30.45 g/L&#160; (400 mM) ammonium thiocyanate 
			8.20 g/L&#160; (100 mM) sodium acetate 
			380 mL/L&#160; (38 % v/v) phenol 
			50 mL/L (5 % v/v) glycerol 
			1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 
			Store up to 2 years at 4oC 
			Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Green Beads</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358941001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL Tube</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116913050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>RCI Labscan</td>
			<td>AR1027E-G2.5L</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9673</td>
			<td>A less toxic alternative to chloroform 
			Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (GC) &#8805; 99.8 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59300</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.09634.2500</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)</td>
			<td>R0551</td>
			<td>Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (purity (GC) &#8805; 99.9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (EMD Millipore)</td>
			<td>1.00983</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck (EMSURE)</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion TURBO DNA-free kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Can be performed at the end of the RNA extraction protocol 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viva cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>cDSK01</td>
			<td>Step 4.1 &#38; 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>A1172K</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Kit</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600107</td>
			<td>An alternative option&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase systems:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>14001012a</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - GoTaq Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separate PCR mixture components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP Mix</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NP2409</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Taq Buffer with KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00348114</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PL1202</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AB1454</td>
			<td>One step RT-PCR exemplified in Figure 3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide solution (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Tris</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PR0612-1KG</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.00063.2500</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0729</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0701-100G</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladders and markers</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NL1405</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel loading dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUP SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>A25779</td>
			<td>Exemplified in Figures4-6B 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1725120</td>
			<td>Exemplified in the video and in Figures 4-6A 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358976001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G Homogenizer</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116005500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Protocol 2 
			Step&#160;2.4, 2.7 &#38; 2.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5418R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>AccuBlock Digital Dry Bath</td>
			<td>Protocol 2 
			Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Protocol 3 
			Step 3.1 - 3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>LSE 6766</td>
			<td>Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 &#38; 6 
			Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>LioFuge</td>
			<td>LM-60</td>
			<td>Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0</td>
			<td rowspan="2">Protocol 6 
			Step 6.6-6.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Pipette-Lite XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol-barrier pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z333328, Z333336, Z333344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr

Das Ziel dieser Methode ist es, den schnellen, empfindlichen und spezifischen Nachweis von Tilapia See Virus (TiLV) in Tilapia Gewebe zu erleichtern. Dieses Protokoll kann im Rahmen der Überwachungsprogramme, Biosicherheitsmaßnahmen und in TiLV Grundlagenforschung Labors verwendet werden. Der Goldstandard der Virus-Diagnostik umfasst in der Regel gefolgt von ergänzenden Techniken wie Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur weiteren Überprüfung die Virusisolierung. Dies kann umständlich, zeitaufwendig und erfordert in der Regel Gewebeproben, die stark mit Virus infiziert. Die Verwendung von RT-quantitative (Q) PCR bei der Erkennung von Viren ist vorteilhaft wegen seiner quantitativen Natur, hohe Sensitivität, Spezifität, Skalierbarkeit und seiner schnellen Zeit zu führen. Hier basiert die gesamte Methode der PCR Ansätze für TiLV Erkennung beschrieben, von Tilapia Orgel strukturierendes, total Ribonukleinsäure (RNA) Extraktion mit einem Guanidium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Lösung, RNA-Quantifizierung, gefolgt von einer zweistufigen PCR wird Protokoll mit, ergänzende Desoxyribonukleinsäure (DNA) Synthese und Erkennung von TiLV durch konventionelle PCR oder quantitative Identifikation über qPCR mit SYBR grün färben ich. Konventionelle PCR Post-PCR-Schritten und wird einfach über das Vorhandensein des Virus zu informieren. Der zweite Ansatz für absolute Quantifizierung von TiLV bis auf weniger als 2 Kopien ermöglicht und somit eignet sich besonders für TiLV Diagnose in Sub-klinische Fälle. Eine detaillierte Beschreibung der beiden PCR-Ansätze, repräsentative Ergebnisse aus zwei Labors und eine gründliche Diskussion der kritischen Parameter beider wurden aufgenommen, um sicherzustellen, dass Forscher und Diagnostikern ihre geeignet und anwendbar finden Methode der TiLV-Erkennung.

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Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Erkennung von Tilapia See Virus mit konventionellen RT-PCR und SYBR Green RT-qPCR

Dieses Protokoll Diagnosen Tilapia See Virus (TiLV) in Tilapia Gewebe mit RT-PCR-Methoden. Die gesamte Methode ist von Gewebe Dissektion nach insgesamt RNA-Extraktion, gefolgt von cDNA Synthese und Erkennung von TiLV durch konventionelle PCR oder quantitative PCR mit DsDNA verbindlich einen Farbstoff Fluoreszenz Bindung beschrieben.

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Willkommen alle. Mein Name ist Win Surachetpong. Ich bin Assistenzprofessor für Veterinärmikrobiologie und Immunologie Fakultät für Veterinärmedizin an der Kasetstart University, Thailand.Ich und mein Team sind spezialisiert auf neu auftretende Viruserkrankung in Tilapia. Wir arbeiten jetzt an dem Tilapia-Seevirus, das eine hohe Sterblichkeit in Tilapia verursacht. Da Tilapia die zweitwichtigste Fischart ist, die Kultur weltweit ist, stellt sie Proteinquelle für eine Million Menschen und spielt eine wichtige Rolle für die Ernährungssicherheit.Der jüngste Ausbruch des Tilapia-Seevirus hat sozioökonomische Auswirkungen, die viele Wissenschaftler dazu veranlassten, eine Lösung für dieses Problem zu finden. Bisher brauchen wir eine sehr hochsensible, schnelle und genaue Methode, um das Virus zu erkennen. In diesem Video zeigen wir Ihnen Schritt für Schritt, um Tilapia-Seevirus im Fischgewebe zu erkennen, beginnend mit der Probenentnahme, der Probenpopulation und der Echtzeit-PCR-Analyse.Erstens, löslichdie Überdosierung von Stofföl in Wasser, um die Fische einzuschläfern. Legen Sie den toten Fisch auf ein Tablett, sterilisieren Sie das Gerät mit 95% Ethanol und verbrennen Sie dann mit einem Alkoholbrenner. Langsam den Fisch aus dem Unterbauch nach oben schneiden, um die Leber zu sammeln.Sammeln Sie einen Teil der Leber in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr. Der erste Teil der RNA-Extraktion sollte in einer Laminar Flow Hood durchgeführt werden und Schutzausrüstung tragen. Fügen Sie einen Milliliter RNA-Extraktionsreagenz in die Röhre.Pulverisieren Sie die Leber mit einem Gewebestöße in homogen. 200 Mikroliter Chloroform in die Röhre geben. Dann vorsichtig mischen, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren.Drei Minuten bei Raumtemperatur beiseite stellen. Zentrifuge bei vier Grad Celsius bei 12 000 RCF für 15 Minuten. Sammeln Sie die Rohre vorsichtig aus der Zentrifuge.500 Mikroliter der farblosen oberen wässrigen Phase vorsichtig in ein neues Rohr übertragen. Fügen Sie ein Volumen Isopropanol in die Röhre. Erhitzen Sie bei minus 20 Grad Celsius für zwei Stunden oder bis über Nacht, um die RNA auszufällen.Zentrifugieren Sie die Lösung nach der Inkubation bei gleichem Zentrifugenzustand. Sammeln Sie die Rohre aus der Zentrifuge, dann entsorgen Sie den Überstand. Das RNA-Pellet kann durch den Pfeil als spitz gesehen werden.Fügen Sie einen Milliliter 75% Ethanol in die Röhre, um das RNA-Pellet zu waschen, und mehrmals invertieren. Zentrifuge bei vier Grad Celsius, bei 10 000 RCF für 15 Minuten. Sammeln Sie die Rohre aus der Zentrifuge, dann entsorgen Sie den Überstand.Ziehen Sie das übrig gebliebene Ethanol mit der Autopipette heraus und trocknen Sie bei Raumtemperatur fünf bis zehn Minuten. Fügen Sie 30 bis 60 Mikroliter RNase freies Wasser hinzu, das auf 55 bis 60 Grad Celsius vorgewärmt wird, um das RNA-Pellet zu sonlubilisieren. Verwenden Sie ein bis zwei Mikroliter RNA-Lösung, um die Konzentration mit einem Mikrovolumenspektrophotometer zu messen.Die Ergebnisse werden auf dem Bildschirm angezeigt. Verdünnen Sie die Konzentration auf 200 Nanogramm pro Mikroliter mit RNase-freiem Wasser. Führen Sie die cDNA-Synthese unter Verwendung der chemikalien- und wie folgt aufgeführten Chemikalien und Bedingungen durch.Verwenden Sie einen Thermocycler, um RNA in cDNA mit vorgeschlagenen Bedingungen umzuwandeln. Im Folgenden sind die Chemikalien und Bedingungen zur Bestimmung der TiLV-Last mit Echtzeit-PCR verwendet. Geben Sie sechs Milliliter des qPCR-Master-Mix in jede Durchstechflasche mit weißem qPCR-Streifenrohr.Anschließend werden vier Milliliter cDNA-Probe in den Brunnen geladen. In diesem Stadium muss in jedem einzelnen Brunnen eine neue Rohrspitze ausgetauscht werden, um eine Kontamination von Probe zu Probe zu vermeiden. Versiegeln Sie den qPCR-Streifen fest mit einer transparenten qPCR-Streifenkappe.Mischen Sie die Lösung vorsichtig, indem Sie an einer Spitze des Streifens flicken. Dann drehen Sie sich mit Mikrozentrifuge, um die gesamte Flüssigkeit am Boden der Gefäße zu sammeln. Verwenden Sie die zweistufige Bedingung, wie im Video gezeigt, wählen Sie den Brunnen in 96 Well-Platte, die Sie verwenden werden.Wählen Sie Cyber-Grün als Flora für Farbstoff. Wählen Sie unbekannt als Beispieltyp aus, und fügen Sie einen Namen in ein Beispielnamensfeld ein. Öffnen Sie den Deckel einer Echtzeit-PCR-Maschine und legen Sie den qPCR-Streifen in den zugewiesenen Brunnen.Schließen Sie dann den Deckel. Führen Sie das Gerät mit der ausgewählten Bedingung aus. Die Maschine startet und läuft, nachdem der Deckel die gewünschte Temperatur erreicht hat.Nach dem Ende der qPCR-Bedingungen wird die Verstärkungskurve angezeigt. Hier zeigt der Kurspfeil, wo der Schwellenwert zwischen der Exponentialphase und der linearen Phase abschneidet, was zu einem CT-Wert führt. Der CT-Wert wird dann in die Kopiernummer des Virusprotokolls extrapoliert, um eine Anzahl von Virusresten mithilfe der Standardkurve zu berechnen.Der Schmelzgipfel wird auch angezeigt, um festzustellen, ob das von qPCR entdeckte Virus tatsächlich TiLV ist, in dem die Schmelzspitzen im Allgemeinen zwischen 79,5 und 80,5 Grad Celsius liegen. Wir hoffen daher, dass diese Methode wichtige Instrumente für Landwirte und Organisationen auf der ganzen Welt sein wird, die möglicherweise eine Kontrolle durchführen und die Ausbreitung der TiLV-Infektion begrenzen müssen.

Research

JoVE Journal

Environment

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout (Salvelinus namaycush) from Its Prey

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout Salvelinus namaycush from Its Prey

Labor Schätzung der Netto Trophic Transfereffizienz von PCB auf Seeforelle (<em&gt; Salvelinus namaycush</em&gt;) Von seiner Beute

A technique for laboratory estimation of net trophic transfer efficiency (&#947;) of polychlorinated biphenyl (PCB) congeners to piscivorous fish from ...

Forschung

Umwelt

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

Labor-Phosphor bestimmt Flux von Seesedimenten als Maß der internen Phosphorbelastung

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser von Kultur und RT-qPCR. I. Sammlung von Virenproben

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

EPA-Methode 1615 Messung von Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser durch Kultur und RT-qPCR. II. Insgesamt kultivierbaren Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Messung und Mapping-Muster von Erosion und Ablagerung im Zusammenhang mit Boden-Karbonat-Konzentrationen unter Landbewirtschaftung

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Erfassung und Gewinnung von betrieblichen Luftproben für Analyse der Pilz DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

Vor-Ort-molekulare Erkennung von bodenbürtige Phytopathogene mit einem tragbaren Echtzeit-PCR-System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Spezifische und präzise Erkennung von Citrus Greening Erreger Verbindung Liberibacter spp mit konventionellen PCR auf Citrus Blatt Gewebeproben

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

Erkennung von Viren von Bioaerosolen Anion Austausch Harz

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...