Name: detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr
Uploaded: 2018-11-10T12:30:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR at JoVE.com

אנחנו אסירי תודה מכון של בקטריולוגיה וטרינרית, Vetsuisse הפקולטה, אוניברסיטת ברן לתמיכה שלהם עבודה זו מומן על ידי הוועדה לשוויון קידום אקדמי של חוקרים את הקריירה מוקדם ומגדר בפקולטה Vetsuisse, אוניברסיטת ברן באמצעות מימון דגם 120% מוענק PN. WS ויחסי ציבור נתמכים על ידי המרכז ללימודים מתקדמים לחקלאות, מזון, המכון ללימודים מתקדמים, אוניברסיטת Kasetsart, בנגקוק, תאילנד תחת להשכלה גבוהה קידום המחקר הלאומי מחקר באוניברסיטה פרויקט תאילנד, Office של תאילנד עמלה, משרד החינוך, ההשכלה הגבוהה. ברצוננו להודות ד ר Kwanrawee Sirikanchana שלה הקריינות Piyawatchara Sikarin עבור עריכת הוידאו.

המחברים אין לחשוף.

TiLV דווחה לראשונה בשנת 2014 ישראל14 , מאז, היא זוהתה במדינות רבות כולל מצרים, קולומביה, הודו, מלזיה, אוגנדה, טנזניה, תאילנד15,16,18, 35 , 48. מודעות עולמית, במיוחד, באמנונים בהפקת מדינות יש להציב יותר תשומת לב על הוירוס ולא הגבלות שונות, אמצעי בקרה מרשויות הממשלה יושמו בניסיון למנוע את התפשטות TiLV. כאן, פרוטוקול מפורט לגילוי TiLV ברקמות אמנון, כיסוי איסוף הדגימה, בידוד RNA, מבחני cDNA סינתזה, PCR, qPCR יש כבר הסביר. ישנם היבטים שונים לשיטות אלו המחייב דיון ספציפי. TiLV זוהתה ב דגים המתפרסות על-פני מגוון גדלים9,12,14,15,49 עם מינים של אמנון עד כה, כולל אמנון היברידית מעובדים (O. niloticus x aureus O.)11,14, הנילוס אמנון (O. niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , אמנון 50 ו אדום (Oreochromis sp.)16,33,48,51, כמו גם בר הנילוס אמנון9,12, שחור אמנון51, zilli ט14,15, ס galilaeus, O. aureus ו ט סימוניס הדממה:14 ו לאחרונה TiLV זוהה פראי קרפיון (Barbonymus schwanenfeldii)52. דגימות רקמות איברים פנימיים (גיל, טחול, כבד, לב, כליות ראש) או ריר37 ניתן שנאסף אמנון בריא, כמו גם אדעך ללא הבדלי גיל, גודל או מינים ולעבד לבידוד RNA. פרוטוקול הכולל של מיצוי RNA המתוארים כאן משתמש פתרון monophasic של פנול, guanidinium thiocyanate, אשר הוא סוכן denaturing chaotropic. הרקמות הן ישירות הומוגני בפתרון זה ואחריו התוספת של כלורופורם וב צנטריפוגה כדי להשיג הפרדה השלב שבו נוצרת של RNA ברור המכיל העליון פאזה מימית, לאטמוספרה וגם שלב אורגני התחתון. ה-RNA היא מבודדת מהשלב מימית על ידי משקעים אלכוהול איזופרופיל, ולאחריה שטיפה של RNA התאושש להיפטר של מזהמים. בידוד של RNA על ידי מתודולוגיה זו היה חלוץ ידי פיוטר Chomczynski ו- Nicoletta סאקי, היה המכונה guanidinium-thiocyanate-פנול-כלורופורם החילוץ-53,-54. יכול להיות שנרכשו או שנעשו במעבדה מסחרית סוג זה של ריאגנט המשמש עבור החילוץ-RNA (ראה את הטבלה של חומרים למידע נוסף). פרוטוקול זה לוקח מעט יותר מאשר מבוססי עמודה שיטות כגון הטיהור מבוססות-סיליקה, אבל באופן כללי, היא עלות יותר אפקטיבי, התשואות RNA יותר.
ב פרוטוקול זה, לכימות RNA באמצעות ערכים A260 היה המתוארים לפיה ספקטרופוטומטר ערכים יכולה להצביע על איכות ה-RNA (A260/A280 = 1.9-2.1). ואילו בשיטה זו ייתן סימן טוב טוהר לדוגמה, לא יכול בהחלט להודיע על איכות RNA שחולצו. כדי לקבוע כראוי אם הרנ א הוא שלם או חלקי מפורק, דגימות יכול להיות הפרדה על ידי agarose בג'ל שבו מריחת של EtBr צבעונית 18S, 28S rRNA להקות לציין RNA השפלה. אימות נוסף של איכות RNA עשוי לכלול שימוש בכלי מעבדה-על-שבב. יתר על כן, זה גם חשוב לעכל את הרנ א מטוהרים עם DNase אני כדי להסיר מזהמות מארח הדנ א, אשר בהתאם היישומים במורד הזרם עלול להוביל תוצאות שגויות. אם המחשב המארח gDNA עדיין מזהם את הדגימה RNA במידה רבה, טיפול DNaseI נוספים ניתן גם לבצע בסופו של ההליך החילוץ RNA (ראה טבלה של חומרים).
סינתזת דנ א משלים ולהשפיע רבות על תוצאות qPCR הכוללת, היא היבט של השיטה שבה באפשרותך להציג את הווריאציה. פרוטוקול ה-cDNA דגלו כאן כוללת של הגדרת רכיב יחיד באמצעות oligo (dT), ובכך רק transcribes mRNAs המכיל תיקים עשויים זנבות. זה מאפשר בקרת משתמש בדיוק אילו רכיבים להשתמש התגובה שעתוק במהופך, במצב זה של cDNA סינתזה הוכיח מוצלח עבור זיהוי TiLV32. חלופה זו הגדרת הוא מאסטר-מיקס מסחרית קנה המכיל כל הרכיבים הדרושים עבור התגובה שעתוק במהופך, והוא מאוד מהירה ופשוטה ללא פרוטוקול רב שלבי, pipetting, טמפרטורה רב מהרגיל. זה יתרון כי זה ממזער טיפול ומקדם אחידות בכל הדוגמאות. מאסטר-תערובות כזו לעיתים קרובות כוללים הן oligo(dT) והן תחל אקראי הפיכתה תבניות RNA החלים שונות, הפקת cDNA נציג עותקים של רצפי מ לכל אורך RNAs באוכלוסיה (ויראלי, אמנון לארח mRNA), באופן תיאורטי, כל מין RNA הרצוי ואז נמדד על ידי קונבנציונאלי PCR או qPCR מתוך כזה מדגם. רבגוניות זו הוא היתרון העיקרי של גישה RT-PCR 2-צעד; הוא מספק בריכה לטווח ארוך יכול לשמש עבור ניסויים שונים רבים. בתוצאות, מיוצגת גישה RT-PCR חד-שלבית שבה תחל רצף ספציפי (טבלה 1) שימשו ו RT ו- PCR בוצעו בשפופרת אחת (ראה רשימת חומרים). באופן כללי, רצף ספציפי תחל לאפשר יעילות גבוהה יותר RT של יעד ספציפי RNA מאשר שימוש אקראי לקרקע, אבל המטרה ספציפי RNA היא היחידה שלא ניתן לכמת במדגם כזה cDNA אשר עשוי להיות המטרה היחידה של מעבדות מסוימים (ראה טבלה של חומרים עבור הצעות למוצרים סינתזה cDNA).
בעוד קונבנציונאלי RT-PCR מופיעה כדי להיות נפוץ עד כה ב TiLV אבחון9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR הוכח להיות כלי יותר חזק זיהוי, כימות של כמויות קטנות של TiLV רקמות דגים או32,ריר37. באופן כללי, qPCR נעשה שימוש נרחב במעבדות לאבחון קליני וירולוגיה בשל רגישות גבוהה שלה, ירידה לפרטים, טוב הפארמצבטית, טווח דינמי רחב מהירות21. בעוד qPCR עשוי להיות בתחילה יקר יותר ליישום מאשר קונבנציונאלי RT-PCR, זה מציע מספר יתרונות חשובים על-קונבנציונאלי PCR; יש זמן יותר מהיר סיבוב מהדגימה לתוצאות, זה לא דורש שום צעדים פוסט-PCR. בנקודה האחרונה כלומר הסיכון הוא מינימלי עבור המעבדה זיהום זה ניתן להתאים בקלות רבה יותר תפוקה גבוהה במצבים כמו למשל במקרה של התפרצויות. יתר על כן, זה מטבעו רגיש יותר קונבנציונאלי RT PCR, שהינו בעל חשיבות לזהות נמוך המון נגיפי דלקות תת קליניים21. זה ידרוש גישה PCR מקוננים הדורשים שעתוק במהופך, שתי תגובות PCR נוסף ולאחר מכן ניתוח לפי agarose ג'ל אלקטרופורזה. השלבים רבים לקחת הרבה זמן ולהגדיל את הסיכויים של שגיאות או זיהום. בכל זאת, עקב רגישות גבוהה שלה, RT-qPCR דורשת הבנה מעמיקה של כימות טכניקות ליצירת תוצאות מדויקות56,57ועיצוב מוקפד ניסיוני.
Fluorophore מחייב ה-DNA, SYBR Green הוכח ב פרוטוקול זה. צבע הכריכה dsDNA DNA לא ספציפי, ובכך ייחודה של וזמינותו טמון לחלוטין את קבוצת צבעי בסיס, אשר עשויה ליצור תוצאות חיוביות שגויות58. לכן, בזמן dsDNA נמס ניתוח עקומת שבוצעה בסופו של כל ה-PCR היא חלק חשוב במיוחד התגובה PCR כי היא מאשרת את אמפליקון PCR אחד בלבד של ה-T הנכוןמ' מופק (זה צריך גם להיות מושגת על ידי ג'ל אלקטרופורזה כאשר מבחני חדש במקדמי). Tm של קטע DNA היא תלויה מגוון רחב של תכונות כגון שלה אורך, קומפוזיציה GC, רצף, משלימים את החסר סטרנד, ריכוז גם על מאגר הרכיבים של משפרי PCR. הניתוחים עקומת ההיתוך בתוצאות נציג המוצגות בין 2 מעבדות שתק ולא גילה את קיומו של פריימר-הדימרים או מוצרים אחרים-PCR לא רצויים, אבל אם זה נצפית עם דגימות אחרות ו/או set-ups ניסיוני, אז הבדיקה צריך להיות אופטימיזציה מחדש. טכנולוגיות מתקדמות יותר qPCR אינם דורשים ההיתוך עקומת צעד כזה, ואכן, מאז זה שיטות העיתון נכתב, TaqMan המבוסס על TiLV RT-qPCR פותחה תחל שני וחומר מכשיר בדיקה מקשה מאוד ספציפי TiLV34.
אין ספק, תחל תוכנן עבור מבחני RT-qPCR היסוד להצלחת assay, תחל כאן עוצבו על פי בציבור TiLV גנומית הנתונים הזמן32. עם זאת, וירוסי RNA ידועים להפגין מוטציה גבוהה המחירים, זנים אפשריים ימלט הבדיקות האבחוניות הנוכחי, כפי נצפתה עבור ISAV59. זה תמיד יהיה קשה עבור סוגים כאלה וירוס להפיק הפשר פן אוניברסלי-TiLV-qPCR assay, כגון מבחני בלבד ללא הרף ישתפר אם TiLV גנומית נתונים נוספים מיקומים מרחיקות לכת ותקופות זמן הופכים לזמינים.
בסופו של דבר, זה חיוני כדי להפעיל כפולים או במידת האפשר, triplicate תגובות ב- "אינטרה" שני, אינטר qPCR מבחני. אם ערכיt C הן גבוהות מאוד, ולאחר מכן שימוש ושכפול זה חשוב במיוחד כדי לוודא כי התגובה PCR הוא אמין לשחזור. באופן כללי, אם לשחזר נתונים מ תגובות משתנה מחזורים יותר מ 0.5, התגובות לחזור אם הערכיםt C משתנים באופן עקבי > 0.5 מחזורים ב ושכפול של, צריך להיות מותאם מחדש וזמינותו. השימוש של רובוט pipetting qPCR משולב עוזר מאוד בעניין זה, אך זהו כלי יוקרה. כמו עם כל הניסוי, הפקדים הכללה ועובדיהם הם בעל חשיבות עליונה להתפתחות של מבחני מולקולריים חזקים, בעיקר במעבדות לאבחון שבו מבחני כזה צריך להיות מוכר. פקדים צריך לכלול חיובי (מדגם TiLV חיובית, פלסמיד TiLV רגיל), פקדים שלילי (NTC ו- RT) דוגמאות, כמו גם זיהוי גנים משק בית אמנון אנדוגני. פקדים אלה אי אפשר לזלזל, צריכים להיכלל בכל assay להבין כראוי את האיכות של כל שלב של וזמינותו, לפרש כראוי את התוצאות.

אספקת דגים לנפש העולמי הגיע שיא חדש של 20 ק"ג בשנת 2014, זה היה עקב צמיחה נמרצת של עופות ומידגה. עופות ומידגה נותר אחד של הצמיחה המהירה מזון מן החי לעשיית המגזרים ברחבי העולם, ענף המזון רק בבעלי חיים בייצור כי הוא גדל מהר יותר האוכלוסייה האנושית1. Tilapiine cichilds מהווים את הדגים מים מתוקים השני הכי חשוב מגודלים ברחבי העולם עם הפקה גלובלי הכולל של 6.4 מיליון טון (MT), ערך מוערך 9.8 מיליארד דולר בשנת 20152. המפיקים בעשיריה הפותחת של אמנון הם סין (1.78 MT), אינדונזיה (1.12 MT) למצרים (0.88 MT), ואחריו בנגלדש, וייטנאם, הפיליפינים, ברזיל, תאילנד, קולומביה ו אוגנדה2. הוא צפוי כי אמנון העולמי הייצור יהיה בסביבות 7.3 MT ב- 20303. אמנון הפכו כזה מקור המזון העולמי חשוב לא רק כי הם מקור זול של חלבון4 אלא גם כי הם קלים להתרבות בתפקיד תחת מגוון רחב של המים והאקלים תנאים5,6. רק לפני כמה עשרות שנים, האמינו כי היו כמה מחלות מסחרית משמעותית מאיים אמנון חקלאות אבל זה כבר לא נכון. מחלה נגיפית המתעוררים המכונה אמנון אגם וירוס מחלת (TiLVD) היא המגיפה מחלה קריטית פעם הראשונה נמצאו אמנון כל התעשייה נמצא בסיכון. מחלה זו מהווה איום ישיר על מזון אבטחה עבור מיליוני אנשים ב אפריקה7, אסיה, דרום אמריקה, ויש השלכות סוציו-אקונומי. בתחילת שנת 2018, הארגון העולמי לבריאות בעלי חיים (OIE) דיווחו כי הסוכן etiological של המחלה, TiLV, באופן רשמי זוהו על שלוש יבשות כיסוי מדינות שמונה8 , מאז היה כרטיס מידע זה פתוגן עדכון שם כבר יותר דיווחים על TiLV טנזניה, אוגנדה9, אינדונזיה10, טייוואן11 ופרו12. TiLV הוא נגיף RNA חד גדילי הרומן שמתואר להיות וירוס כמו orthomyxo מכיוון שהוא מכיל מגוון רחב של מאפיינים של אחרים orthomyoxoviruses כגון שפעת או זיהומיות באנמיה סלמון וירוס (ISAV)13. זה זוהה לראשונה בעקבות הפסדים מסיבי של אמנון מעובדים הפראית ב אגם הגליל, ישראל14. לאחר מכן, התפרצות מחלות דומות התייחס בהירושימה הקיץ וגם את חודש דווח על תסמונת התמותה המשויך TiLV זיהום הנילוס אמנון (Oreochromis niloticus) מצרים15 ו הנילוס, היברידית אדום אמנון (Oreochromis spp.) תאילנד16, בהתאמה. זיהוי של וירוסים בעלי חיים ימיים היסטורית מתבצעת על ידי צמיחה ובידוד של וירוסים תרבית תאים. שורות תאים שונים נבדקו עבור הפצת ובידוד של TiLV כולל, E-11 תאים שמקורם ראש-נחש דגים (Ophiocephalus striatus)17,18, לכם, שוייץ שמקורן Oreochromis mossambicus18, ואת OnlB OnlL שמקורם הנילוס אמנון (O. niloticus)19. בעוד וירוס תרבות יש את היתרון שהיא מספקת חומרים לניסויים נוספים, יש לו החיסרון כי זה דורש לפחות 4-7 ימים כדי לבחון את היווצרות של תופעות cytopathic (CPE), ויותר חשוב, וירוסים בית שונים, שהם יותר להשתלב שכפול עשוי להיות מופצות ומפיקים CPE דומה.
במשך העשורים האחרונים, היה מהלך ספורים המסורתית, לעיתים זמן רב שיטות אבחון כמו תרבית תאים, סרולוגיה, זיהוי אנטיגן והחלפת עם חומצת גרעין מהר יותר, רגיש יותר המבוסס על זיהוי בדיקות20, 21. זו ניכרת על ידי העובדה כי מבחני qPCR רבים פותחו כמו שיטות אבחון חשוב עבור מספר רב של מחלות נגיפיות, בעלי חיים ימיים, כגון עבור22,ISAV23, וירוס ויראלי טראומה אלח דם (VHSV)24 ,25, אילנה אסטרייך salmonid27 26,betanodavirus28, דגים iridovirus29, Anguillid ההרפס 1 (AngHV1)30ו- Lymphocystis מחלת וירוס (LCDV)31 . שיטות יציבות למעקב ואבחון הפתוגן דרושים בדחיפות כדי לצמצם את התפשטות TiLV. שיטות כאלה צריך לאפשר גילוי מוקדם של זיהום לפני סימנים קליניים לפתח וזיהוי וירוסים נמוך נטען. עד כה, בפרוטוקולי PCR שונים לרבות RT-PCR14,32, RT-PCR מקוננים18, RT-PCR למחצה מקוננים33ו- RT-qPCR32,34 פותחו עבור זיהוי TiLV ברקמות דגים. השוואה של בידוד RT-qPCR ווירוסים בשורות תאים רגישים לזיהוי TiLV גילה כי RT-qPCR היה רגיש פי אלף יותר מאשר הבידוד של וירוס32. למרות כל שפורסמו PCR פרוטוקול דיווח על רגישויות שונות לאיתור TiLV, רוב מבחני רגישים מאוד עם הגבולות לזיהוי עותקים ויראלי-עותקים 7.533, 7 עותקים18 או עותקים 232 לכל התגובה.
מטרת מאמר זה שיטות היא להסביר בפירוט כיצד לבצע מבחני איתור TiLV, החל מאיסוף רקמות אמנון, כדי החילוץ RNA הכולל, סינתזה cDNA וביססנו PCR ספציפי TiLV מבחני. באופן ספציפי, פרוטוקולים מקיפה הן קונבנציונאלי RT-PCR, והן גם SYBR מבוסס-ירוק RT-qPCR תוארו לערעור בפני מגוון רחב של מדענים במטרה לאתר את TiLV. לשעבר הוא פחות רגיש, אבל הוא בדרך כלל אפשרות זיהוי זולה יותר. האחרון דורש תשתית מורכבים יותר כגון מכונת ה-PCR כמותי, ריאגנטים יקר יותר, אך יש לו את היתרונות של להיות כמותיים, מהיר, רגישה מאוד, כלומר, כי זה יכול לשמש עבור הגילוי של TiLV ב תת קלינית דגים נגועים. RT-PCR ופרוטוקולים RT-qPCR בוצעו במעבדות שונות שני עם מבודד גיאוגרפיים ברורים של TiLV והאר תוצאות כלול הרגישות ואת הפארמצבטית של מבחני המתוארים כאן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>An alternative to clove oil.&#160; 
			Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilization solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160; AM7020</td>
			<td>For storing tissues if they cannot be processed immediately 
			Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIreagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENEzol</td>
			<td>Geneaid</td>
			<td>GZR100</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisure</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38032</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homemade solution</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 
			30.45 g/L&#160; (400 mM) ammonium thiocyanate 
			8.20 g/L&#160; (100 mM) sodium acetate 
			380 mL/L&#160; (38 % v/v) phenol 
			50 mL/L (5 % v/v) glycerol 
			1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 
			Store up to 2 years at 4oC 
			Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Green Beads</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358941001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL Tube</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116913050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>RCI Labscan</td>
			<td>AR1027E-G2.5L</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9673</td>
			<td>A less toxic alternative to chloroform 
			Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (GC) &#8805; 99.8 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59300</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.09634.2500</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)</td>
			<td>R0551</td>
			<td>Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (purity (GC) &#8805; 99.9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (EMD Millipore)</td>
			<td>1.00983</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck (EMSURE)</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion TURBO DNA-free kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Can be performed at the end of the RNA extraction protocol 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viva cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>cDSK01</td>
			<td>Step 4.1 &#38; 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>A1172K</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Kit</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600107</td>
			<td>An alternative option&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase systems:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>14001012a</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - GoTaq Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separate PCR mixture components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP Mix</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NP2409</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Taq Buffer with KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00348114</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PL1202</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AB1454</td>
			<td>One step RT-PCR exemplified in Figure 3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide solution (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Tris</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PR0612-1KG</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.00063.2500</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0729</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0701-100G</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladders and markers</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NL1405</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel loading dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUP SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>A25779</td>
			<td>Exemplified in Figures4-6B 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1725120</td>
			<td>Exemplified in the video and in Figures 4-6A 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358976001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G Homogenizer</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116005500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Protocol 2 
			Step&#160;2.4, 2.7 &#38; 2.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5418R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>AccuBlock Digital Dry Bath</td>
			<td>Protocol 2 
			Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Protocol 3 
			Step 3.1 - 3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>LSE 6766</td>
			<td>Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 &#38; 6 
			Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>LioFuge</td>
			<td>LM-60</td>
			<td>Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0</td>
			<td rowspan="2">Protocol 6 
			Step 6.6-6.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Pipette-Lite XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol-barrier pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z333328, Z333336, Z333344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr

המטרה של שיטה זו היא כדי להקל על זיהוי מהיר, רגיש וספציפי של אמנון אגם וירוס (TiLV) ברקמות אמנון. פרוטוקול זה יכול לשמש כחלק מהתוכניות מעקב, אמצעים biosecurity ובמעבדות המחקר הבסיסי TiLV. תקן הזהב של וירוס אבחון כוללת בדרך כלל וירוס בידוד ואחריו טכניקות משלימים כגון הפוכה-תמלול תגובת שרשרת פולימראזית (RT-PCR) לצורך אימות נוסף. זה יכול להיות מסורבל, זמן רב, בדרך כלל דורש דגימות רקמה בכבדות נגוע בווירוס. השימוש RT-כמותיים (q) PCR זיהוי וירוסים הוא יתרון בשל טבעה כמותית, רגישות גבוהה, ירידה לפרטים, מדרגיות, הגיע הזמן מהיר כתוצאה מכך. כאן, השיטה כולה של PCR גישות מבוססות על TiLV זיהוי מתואר, בין אמנון איברים אופטים, הכולל חומצה ריבונוקלאית (RNA) החילוץ באמצעות a guanidium thiocyanate-פנול-כלורופורם פתרון, כימות RNA, ואחריו ה-PCR שני שלבים פרוטוקול פרוגרמה, סינתזה חומצה deoxyribonucleic משלימים (cDNA), זיהוי של TiLV באמצעות PCR קונבנציונאלי או זיהוי כמותית באמצעות qPCR באמצעות SYBR ירוק אני צובע. PCR קונבנציונלית דורש צעדים פוסט-PCR, פשוט יודיע על הנוכחות של הנגיף. הגישה השנייה תאפשר על כימות מוחלטת של TiLV עד כמה שני עותקים, ולכן הוא שימושי במיוחד עבור TiLV האבחנה במקרים תת קליניים. תיאור מפורט של שתי גישות PCR, נציג תוצאות ממעבדות שני, דיון יסודי פרמטרים קריטיים של שניהם נכללו כדי להבטיח כי חוקרים, מאבחנים למצוא מתאימים שלהם וישימים שיטת זיהוי TiLV.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR at JoVE.com

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

זיהוי של אמנון אגם וירוס באמצעות קונבנציונאלי RT-PCR ו SYBR ירוק RT-qPCR

פרוטוקול זה מאבחן אמנון אגם וירוס (TiLV) ברקמות אמנון באמצעות מתודולוגיות RT-PCR. השיטה כולה מתוארת מן דיסקציה רקמות כדי הכולל החילוץ RNA, ואחריו cDNA סינתזה וזיהוי של TiLV באמצעות PCR קונבנציונאלי או PCR כמותי באמצעות dsDNA מחייב צבע הכריכה פלורסנט.

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

ברוכים הבאים כולם. שמי הוא ווינ סוראצ'טפונג. אני פרופסור למיקרוביולוגיה וטרינרית ופקולטה לאימונולוגיה לרפואה וטרינרית באוניברסיטת קסטסטארט, תאילנד.אני והצוות שלי מתמחים במחלה נגיפית מתפתחת באנאפיה. עכשיו אנחנו עובדים על וירוס אגם אמנון אשר גורמים לתמותה גבוהה אמנון. מאז אמנון הוא מין הדגים השני החשוב ביותר כי הוא תרבות ברחבי העולם, הוא מספק מקור חלבון עבור מיליון אנשים לשחק תפקיד חשוב לביטחון המזון.אז ההתפרצות האחרונה של נגיף אגם אמנון גורמת להשפעה חברתית-כלכלית שהובילה מדענים רבים לנסות למצוא פתרון לבעיה זו. עד כה אנו זקוקים לשיטה רגישה, מהירה ומדויקת מאוד כדי לזהות את הנגיף. בסרטון זה, אנו נראה לך צעד אחר צעד כדי לזהות וירוס אגם אמנון ברקמת דגים החל איסוף מדגם, אוכלוסיית מדגם, וניתוח PCR בזמן אמת.ראשית, לבודד את מנת יתר של שמן בד במים כדי להנחית את הדגים. מניחים את הדגים המתים על מגש, מעקרים את הציוד באמצעות 95% אתנול, ואז נשרפים עם מבער אלכוהול. לאט לחתוך לפתוח את הדגים מהבטן התחתונה כלפי מעלה, כדי לאסוף את הכבד.לאסוף חלק מהכבד לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. החלק הראשון של מיצוי RNA צריך להתבצע ברדס זרימה למינאר, וללבוש ציוד מגן. הוסף מיליליטר אחד של רה"מ מיצוי RNA לתוך הצינור.לרסק את הכבד באמצעות עלה רקמה לתוך הומוגני. הוסף 200 מיקרוליטרים של כלורופורם לצינור. לאחר מכן, מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.מניחים בצד לשלוש דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ב 12, 000 RCF במשך 15 דקות. בזהירות לאסוף את הצינורות מן הצנטריפוגה.מעבירים בעדינות 500 מיקרוליטרים של השלב הממימי העליון חסר הצבע לצינור חדש. הוסף נפח אחד של isopropanol לתוך הצינור. מחממים במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך שעתיים או עד לילה כדי לזרז את ה-RNA.לאחר הדגירה, צנטריפוגה הפתרון באותו מצב צנטריפוגה. לאסוף את הצינורות מן הצנטריפוגה, ולאחר מכן להשליך את supernatant. גלולת RNA ניתן לראות מחודד על ידי החץ.מוסיפים מיליליטר אחד של 75%אתנול לתוך הצינור כדי לשטוף את גלולת RNA, ולהפוך מספר פעמים. צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס, ב 10, 000 RCF במשך 15 דקות. לאסוף את הצינורות מן הצנטריפוגה, ולאחר מכן להשליך את supernatant.משוך את שאריות האתנול באמצעות צינור אוטומטי, ואוויר יבש בטמפרטורת החדר במשך חמש עד 10 דקות. הוסף 30 עד 60 microliters RNase מים חינם, מחומם מראש ל 55 עד 60 מעלות צלזיוס כדי לבודד את גלולת RNA. השתמש 1-2 microliters של פתרון RNA כדי למדוד את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו נפח.התוצאות יופיעו על המסך. מדללים את הריכוז ל-200 ננוגרם למיקרוליטר באמצעות מים חופשיים של RNase. בצע סינתזת cDNA באמצעות הכימיקלים והתנאים המפורטים כדלקמן.השתמש בתרמוציקלר כדי להמיר RNA ל- cDNA עם תנאים מוצעים. להלן הכימיקלים והתנאים המשמשים לקביעת עומס TiLV באמצעות PCR בזמן אמת. לוותר על שישה מיליליטר של תערובת מאסטר qPCR לתוך כל בקבוקון של צינור רצועת qPCR לבן.לאחר מכן, ארבעה מיליליטר של מדגם cDNA נטען לתוך באר. בשלב זה יש לשנות קצה צינור חדש בכל באר, כדי למנוע זיהום מדגימה לדגימה. לאטום את רצועת qPCR בחוזקה עם כובע רצועת qPCR שקוף.מערבבים בעדינות את הפתרון על ידי החלקה בקצה הרצועה. ואז להסתובב למטה באמצעות מיקרו צנטריפוגה כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית כלי הדם. השתמש בתנאי שני השלבים כפי שמוצג בסרטון, בחר את הבאר ב- 96 לוחית היטב בה תשתמש.בחר ירוק סייבר כצמחייה לצבע. בחר לא ידוע כסוג לדוגמה והוסף שם לתיבה שם לדוגמה. פתח את המכסה של מכונת PCR בזמן אמת והצב את רצועת qPCR לתוך באר שהוקצתה.אז תסגור את המכסה. הפעל את המחשב עם התנאי שנבחר. המכונה תתחיל ותפעל לאחר שהמכסה הגיע לטמפרטורה הרצויה.לאחר סיום תנאי qPCR, מוצגת עקומת הגברה. כאן, חץ הקצב מציין היכן רמת הסף חותכת בין השלב המעריכי לשלב ליניארי שתביאו לערך CT. לאחר מכן, ערך ה- CT מנופח למספר עותק של יומן וירוסים כדי לחשב מספר שרידי וירוסים באמצעות העקומה הסטנדרטית.שיא ההמסה מוצג גם כדי לזהות אם הנגיף שזוהה על ידי qPCR הוא, אכן, TiLV שבו פסגות ההמסה נעות בדרך כלל בין 79.5 ל -80.5 מעלות צלזיוס. לכן אנו מקווים כי שיטה זו תהיה כלים חשובים עבור חקלאים וארגון ברחבי העולם, אשר עשויים לדרוש ליישם שליטה ולהגביל את התפשטות זיהום TiLV.

Research

JoVE Journal

Environment

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout (Salvelinus namaycush) from Its Prey

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout Salvelinus namaycush from Its Prey

הערכת מעבדה של יעילות העברה הנקי התזונתית של קרוב בPCB לאגם פורל (<em&gt; Salvelinus namaycush</em&gt;) מטרפו

A technique for laboratory estimation of net trophic transfer efficiency (&#947;) of polychlorinated biphenyl (PCB) congeners to piscivorous fish from ...

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

נקבע מעבדה זרחן שטף מאגם המשקעים כמדד לטעינה הפנימית זרחן

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה&quot;כ

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. חלק שלישי. איתור וירוסים על ידי RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

מדידה ומיפוי דפוסים של סחף אדמה ומשקעים הקשורים אדמה ריכוזים קרבונט תחת ניהול חקלאיים

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

אוסף והפקת האוויר תעסוקתית דוגמאות לניתוח של DNA פטרייתי

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

זיהוי מולקולרי באתר של קרקע בתפו Phytopathogens באמצעות מערכת ה-PCR נייד בזמן אמת

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

ספציפית, איתור מדויק של spp. הפתוגן ירוק הדרים Candidatus liberibacter באמצעות PCR המקובלת על דגימות רקמה עלה הדרים

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...