Name: detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr
Uploaded: 2018-11-10T12:30:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR at JoVE.com

Siamo grati per l'Istituto di batteriologia veterinaria, lezioni facoltà, Università di Berna per il loro sostegno. Questo lavoro è stato finanziato dal comitato accademico promozione di ricercatori all'inizio della carriera e della parità presso la facoltà di lezioni, Università di Berna dal 120% modello finanziamento assegnato a PN. WS e PR sono supportati da centro per gli studi avanzati per l'agricoltura e cibo, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailandia sotto la promozione di ricerca di istruzione superiore e ricerca nazionale Università progetto di Thailandia, ufficio della Thailandia Commissione, Ministero dell'istruzione, dell'istruzione superiore. Vorremmo ringraziare il Dr. Kwanrawee Sirikanchana per la sua narrazione e Piyawatchara Sikarin per il video editing.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

TiLV in primo luogo è stato segnalato nel 2014 in Israele14 e da allora, è stato identificato in diversi paesi tra i quali Malesia, Colombia, Egitto, Tanzania, Uganda, India e Thailandia15,16,18, 35 , 48. consapevolezza globale, in particolare, nei paesi produttori di tilapia ha posto maggiore attenzione su virus e varie restrizioni e sono state attuate misure di controllo da parte delle autorità di governo tentando di impedire la diffusione di TiLV. Qui, un protocollo dettagliato per il rilevamento di TiLV in tessuto di tilapia, che copre la raccolta del campione, isolamento del RNA, saggi di sintesi, PCR e qPCR di cDNA è stato spiegato. Ci sono vari aspetti di questi metodi che giustificano la discussione specifica. TiLV è stato identificato nei pesci che coprono una varietà di formati9,12,14,15,49 e specie di tilapia finora, tra cui allevamento ibrido tilapia (O. niloticus x o. aureus)11,14, Nile tilapia (o. niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 e red tilapia (Oreochromis SP.)16,33,48,51, come bene come in wild Nile tilapia9,12, nero Tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, aureus o. e T. simonis intermedia14 e molto recentemente TiLV è stata identificata in carpa selvatica (Barbonymus schwanenfeldii)52. Campioni di tessuto da organi interni (gill, milza, fegato, cuore, rene testa) o muco37 possono essere raccolti da sano così come moribonda tilapia indipendentemente dall'età, taglia o specie ed elaborati per l'isolamento di RNA. Il protocollo di estrazione di RNA totale delineato qui usa una soluzione monofasica di fenolo e guanidinio tiocianato, che è un agente denaturante caotropici. I tessuti sono omogeneizzati direttamente in questa soluzione, seguita dall'aggiunta di cloroformio e centrifugazione per realizzare la separazione di fase in cui viene generato un RNA chiaro contenente la fase acquosa superiore, un'interfase e una fase organica inferiore. il RNA è isolato dalla fase acquosa dalla precipitazione di isopropanolo, seguita da lavaggio del RNA recuperato per sbarazzarsi di contaminanti. Isolamento di RNA di questa metodologia è stata introdotta da Piotr Chomczynski e Nicoletta Sacchi ed è riferito a come guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio estrazione53,54. Questo tipo di reagente usato per l'estrazione di RNA possa essere acquistato o fatti in laboratorio in commercio (Vedi la Tabella materiali per maggiori informazioni). Questo protocollo richiede un po' più di metodi basati su colonna come la purificazione a base di silice, ma in generale, si è molto più conveniente e produce più RNA.
In questo protocollo, quantificazione di RNA usando valori di A260 è stato delineato per cui spettrofotometria valori possono indicare qualità di RNA (A260/A280 = 1,9-2,1). Mentre questo metodo vi darà una buona indicazione della purezza del campione, esso non può assolutamente informa circa la qualità del RNA estratto. Per determinare correttamente se il RNA è intatto o parzialmente degradato, i campioni possono essere separazione mediante elettroforesi su gel di agarosio in cui sbavature dell'EtBr macchiato 18S e 28S rRNA bande indicano degradazione del RNA. Ulteriore verifica della qualità di RNA può includere utilizzando uno strumento di lab-on-a-chip. Inoltre, è anche importante per digerire il RNA purificato con dnasi per rimuovere contaminanti ospito DNA genomico, che, a seconda delle applicazioni a valle, può portare a risultati falsi. Se host gDNA è ancora contaminare il campione di RNA in larga misura, un ulteriore trattamento di DNaseI può essere eseguito anche alla fine della procedura di estrazione RNA (Vedi Tabella materiali).
Sintesi del DNA complementari possono influenzare notevolmente i risultati complessivi di qPCR e costituisce un aspetto del metodo che possa introdurre variazione. Il protocollo di cDNA sostenuto qui è composto da un set-up singolo componente utilizzando oligo (dT) e così solo trascrive mRNA contenenti code di polyA. Permette il controllo di utente di esattamente i componenti da utilizzare in questa modalità di cDNA e la reazione di retrotrascrizione sintesi si sono rivelata vincente per TiLV rilevamento32. Un'alternativa a questo set-up è un commercialmente comprato master-mix contenente tutti i componenti necessari per la reazione di trascrizione inversa ed è molto veloce e semplice senza il consueto protocollo multi-step, pipettaggio e multitemperatura. Questo è vantaggioso perché riduce al minimo la manipolazione e promuove l'uniformità in tutti i campioni. Tali master-mescola spesso include sia oligo e casuale primer rendendolo applicabile a diversi modelli di RNA e generazione di copie di cDNA rappresentativo delle sequenze da tutta la lunghezza del RNAs in una popolazione (virale e tilapia ospitare mRNA) e in teoria, ogni specie di RNA desiderata quindi può essere misurata con PCR convenzionale o qPCR da tali un campione. Questa versatilità è il principale vantaggio di un approccio di 2-step RT-PCR; offre una piscina a lungo termine che può essere utilizzata per molti esperimenti diversi. Nei risultati, un approccio di One-step RT-PCR è stato rappresentato in cui sono stati utilizzati primers specifici di sequenza (tabella 1) e la RT e la PCR sono stati effettuati in un tubo (Vedi lista dei materiali). In generale, specifici primers sequenza consentono una maggiore efficienza di RT del RNA dell'obiettivo specifico rispetto all'utilizzo di adescamento casuale, ma l'obiettivo specifico del RNA è l'unico che può essere quantificata in un campione di cDNA che può essere l'unico scopo di alcuni laboratori (Vedi Tabella materiali per suggerimenti di prodotto di sintesi del cDNA).
Mentre la RT-PCR convenzionale sembra essere comunemente utilizzati finora a TiLV diagnosi9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR ha dimostrato di essere uno strumento più potente per la rilevazione e la quantificazione delle piccole quantità di TiLV nei tessuti del pesce o muco32,37. In generale, qPCR è ampiamente usato nei laboratori diagnostici di virologia clinica grazie alla sua alta sensibilità, specificità, buona riproducibilità, ampia gamma dinamica e velocità21. Mentre qPCR può essere inizialmente più costoso da implementare di RT-PCR convenzionale, offrono molti vantaggi importanti sopra PCR convenzionale; ha un tempo più veloce svolta dall'esempio di risultati e non richiede alcuna procedura di post-PCR. Quest'ultimo punto significa che c'è il minimo rischio di contaminazione del laboratorio e può essere più facilmente adattato a situazioni di alto-rendimento come nel caso di epidemie. Inoltre, è intrinsecamente più sensibile di RT-PCR convenzionale, che è di vitale importanza per rilevare bassi carichi virali infezioni subcliniche21. Ciò richiederebbe un approccio PCR annidato che richiedono la trascrizione inversa, due ulteriori reazioni di PCR e quindi l'analisi di agarosio gel elettroforesi. Questi passaggi molti prendono un sacco di tempo e aumentano le possibilità di errori o di contaminazione. Tuttavia, dovuto la relativa alta sensibilità, RT-qPCR richiede meticolosa progettazione sperimentale e una conoscenza approfondita delle tecniche di quantificazione per generare risultati precisi56,57.
Il DNA associazione fluoroforo, SYBR Green attesta in questo protocollo. Si tratta di un colorante di associazione dsDNA DNA aspecifiche e così la specificità del test si trova interamente nel set di primers, che può generare falsi positivi58. Pertanto, mentre il dsDNA eseguita alla fine di ogni PCR analisi della curva di fusione è una parte particolarmente importante della reazione PCR perché conferma che solo un amplicone PCR del corretto Tm è prodotto (questo dovrebbe anche essere raggiunto da gel elettroforesi quando nuovi saggi sono in corso di attuazione). I Tm di un frammento di DNA è dipendente da una varietà di caratteristiche come la sua lunghezza, composizione GC, sequenza, strand complementarità, concentrazione nonché sulle buffer componenti ed esaltatori di PCR. Le analisi di curva fusione nei risultati rappresentativi mostrati da due laboratori non hanno rivelato la presenza di dimeri dell'iniettore o altri prodotti PCR non desiderati, ma se questo è osservato con altri campioni e/o set-up sperimentale, allora il dosaggio dovrebbe essere ri-ottimizzato. Tecnologie più avanzate di qPCR non richiedono tale fusione passo curva e infatti, poiché questo metodi paper è stato scritto, un TaqMan basato TiLV RT-qPCR è stato sviluppato utilizzando due primers ed una sonda che lo rende altamente specifico TiLV34.
Senza dubbio, il primer disegnati per le analisi di RT-qPCR sono fondamentali per il successo del test e i primer di qui sono stati progettati in base ai dati genomici TiLV pubblicamente disponibili presso il tempo32. Tuttavia, virus del RNA è ben noto a mostrare tassi di mutazione elevati e possibili ceppi sfuggiranno i test diagnostici, come è stato osservato per ISAV59. Sarà sempre difficile per tali tipi di virus generare una padella universale-TiLV RT-qPCR dosaggio e tali dosaggi saranno solo continuamente migliorate se resi disponibili più dati genomici TiLV da posizioni ampie e periodi di tempo.
Infine, è essenziale per eseguire duplicati o se possibile, in triplice copia reazioni in sia intra e inter saggi qPCR. Se i valori dit C sono molto alti, quindi l'uso delle ripetizioni è particolarmente importante per accertare che la reazione di PCR è affidabile e riproducibile. In generale, se i dati da replicano reazioni varia più di 0,5 cicli, le reazioni deve essere ripetuto e se i valori dit C variano costantemente cicli > 0,5 in replica, il dosaggio dovrebbe essere ri-ottimizzato. L'uso di un robot di pipettaggio qPCR integrato aiuta immensamente con questo problema, ma è uno strumento di lusso. Come con qualsiasi esperimento, i controlli di adeguata e appropriata di inclusione sono della massima importanza per lo sviluppo di saggi molecolari robusti, soprattutto nei laboratori diagnostici dove tali dosaggi devono essere accreditati. Controlli devono includere positivi (positivi TiLV campione, plasmide TiLV standard) ed esempi di controlli negativi (NTC e -RT), nonché l'individuazione di geni housekeeping tilapia endogeno. Tali controlli non possono essere sottovalutati e dovrebbero essere incluso in ogni analisi per comprendere correttamente la qualità di ogni passo del test e a interpretare correttamente i risultati.

La fornitura di pesce pro capite globale ha raggiunto un nuovo record di 20 kg nel 2014 e questo era a causa della crescita vigorosa in acquacoltura. L'acquacoltura rimane uno dei settori di produzione mangime più rapida crescita in tutto il mondo ed è il settore di produzione alimentare solo animale che sta crescendo più velocemente della popolazione umana1. Tilapiine cichilds costituiscono i secondo più importanti pesci d'acqua dolce coltivati in tutto il mondo con una produzione globale totale di 6,4 milioni di tonnellate (MT) e un valore stimato di 9,8 miliardi di dollari nel 20152. I dieci produttori principali di tilapia sono Cina (1,78 MT), Indonesia (1.12 MT) ed Egitto (0,88 MT), seguita dal Bangladesh, Vietnam, Filippine, Brasile, Thailandia, Colombia e Uganda2. Si prevede che la produzione globale di tilapia sarà circa 7,3 MT da 20303. Tilapia sono diventati tali una fonte di cibo globale importante non solo perché sono una fonte economica di proteina4 ma anche perché sono facili da allevare in capacità sotto una vasta gamma di acqua e clima condizioni5,6. A pochi decenni fa, si credeva che c'erano poche malattie commercialmente significativi minacciando agricoltura tilapia, ma questo non è più vero. Una malattia virale emergente chiamata malattia di tilapia Lago virus (TiLVD) è la prima epidemia di malattia critica mai trovati a tilapia e l'intero settore è a rischio. Questa malattia ha gravi conseguenze socio-economiche ed è una minaccia diretta sulla sicurezza alimentare per milioni di persone in Africa7, Asia e Sud America. All'inizio del 2018, l'organizzazione mondiale per la salute animale (OIE) ha riferito che l'agente eziologico di questa malattia, TiLV, era stato rilevato ufficialmente in tre continenti che copre otto paesi8 , poiché questa scheda di informazioni di agente patogeno era Aggiornato ci sono state altre segnalazioni di TiLV in Tanzania, Uganda9, Indonesia10, Taiwan11 e Perù12. TiLV è un romanzo single-stranded RNA virus descritto per essere un orthomyxo-come il virus perché contiene una varietà di caratteristiche che ricorda altri orthomyoxoviruses come l'Influenza o infettiva salmon anemia virus (ISAV)13. In primo luogo è stato identificato nel guaime delle massicce perdite di tilapia selvatico e di allevamento nel lago di Galilea, Israele14. Da allora in poi, simili epidemie definito come mortalità di estate e il mese di una sindrome di mortalità associata con l'infezione di TiLV sono stati segnalati in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) in Egitto15 e Nilo e tilapia ibrido rosso (Oreochromis spp.) in Thailandia16, rispettivamente. Rilevamento di virus animali acquatiche avviene storicamente di crescita e l'isolamento del virus in coltura cellulare. Varie linee cellulari sono stati testati per la propagazione e l'isolamento di TiLV compreso, le cellule E-11 derivate da snakehead pesce (striatus Ophiocephalus)17,18, OmB e TmB provenienti da Oreochromis mossambicus18e OnlB e uniche provenienti da Nile tilapia (o. niloticus)19. Mentre la cultura del virus ha il vantaggio che fornisce materiale per ulteriori esperimenti, ha lo svantaggio che richiede almeno 4-7 giorni per osservare la formazione degli effetti citopatici (CPE) e fondamentalmente, diversi virus piscine, che sono più in forma di replicare possono essere propagate e produrre simili CPE.
Negli ultimi decenni, c'è stato un allontanamento di metodi diagnostici tradizionali, spesso richiede tempo come coltura cellulare, sierologia e rilevazione dell'antigene e sostituzione con più veloce e più sensibile dell'acido nucleico basato rilevamento test20, 21. Questo è evidente dal fatto che molti saggi qPCR sono stati sviluppati come metodi diagnostici importanti per una moltitudine di malattie virali degli animali acquatici, come ad esempio per ISAV22,23, virus emorragico virale di setticemia (VHSV)24 ,25, betanodavirus26,27 salmonidi alphavirus28, pesce iridovirus29, popolazione herpesvirus 1 (AngHV1)30e Lymphocystis malattia virus (LCDV)31 . Metodi avanzati per la diagnosi e patogeno sorveglianza sono urgenti per ridurre la diffusione di TiLV. Tali metodi dovrebbero consentire diagnosi precoce dell'infezione prima di sviluppano segni clinici e rilevamento dei virus bassi carichi. Ad oggi, compresi RT-PCR14,32, diversi protocolli di PCR nested RT-PCR18, semi-nested RT-PCR33e RT-qPCR32,34 sono stati sviluppati per la rilevazione di TiLV nei tessuti del pesce. Un confronto dell'isolamento RT-qPCR e virus in linee cellulari sensibili per la rilevazione di TiLV ha rivelato che RT-qPCR era 1.000 volte più sensibile di isolamento del virus32. Anche se ogni protocollo PCR pubblicato ha segnalato diverse sensibilità per il rilevamento di TiLV, la maggior parte delle analisi sono altamente sensibile con i limiti di rilevazione di copie virali 7,5 copie33, 7 copie18 o 2 copie32 a reazione.
Lo scopo di questo articolo di metodi è quello di spiegare, in dettaglio, come eseguire le analisi di rilevamento TiLV, partendo da collezione di tessuto di tilapia, all'estrazione di RNA totale, sintesi del cDNA e quindi TiLV specifico PCR basata saggi. In particolare, sono stati descritti protocolli completi di RT-PCR convenzionale sia SYBR green-basato RT-qPCR fare appello a una vasta gamma di scienziati, con l'obiettivo di rilevare TiLV. Il primo è meno sensibile ma è in genere una soluzione meno costosa di rilevamento. Quest'ultimo richiede infrastrutture più elaborate come una macchina PCR quantitativa e reagenti più costosi, ma ha i vantaggi di essere quantitativa, veloce e altamente sensibile, che significa che può essere utilizzato per il rilevamento di TiLV in Sub-clinicamente pesci infetti. La RT-PCR e RT-qPCR protocolli sono stati effettuati in due diversi laboratori di distinte geografiche isolate di TiLV ed i risultati inclusi evidenzia la sensibilità e riproducibilità dei saggi qui descritto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>An alternative to clove oil.&#160; 
			Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilization solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160; AM7020</td>
			<td>For storing tissues if they cannot be processed immediately 
			Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIreagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENEzol</td>
			<td>Geneaid</td>
			<td>GZR100</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisure</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38032</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homemade solution</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 
			30.45 g/L&#160; (400 mM) ammonium thiocyanate 
			8.20 g/L&#160; (100 mM) sodium acetate 
			380 mL/L&#160; (38 % v/v) phenol 
			50 mL/L (5 % v/v) glycerol 
			1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 
			Store up to 2 years at 4oC 
			Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Green Beads</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358941001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL Tube</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116913050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>RCI Labscan</td>
			<td>AR1027E-G2.5L</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9673</td>
			<td>A less toxic alternative to chloroform 
			Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (GC) &#8805; 99.8 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59300</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.09634.2500</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)</td>
			<td>R0551</td>
			<td>Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (purity (GC) &#8805; 99.9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (EMD Millipore)</td>
			<td>1.00983</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck (EMSURE)</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion TURBO DNA-free kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Can be performed at the end of the RNA extraction protocol 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viva cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>cDSK01</td>
			<td>Step 4.1 &#38; 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>A1172K</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Kit</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600107</td>
			<td>An alternative option&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase systems:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>14001012a</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - GoTaq Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separate PCR mixture components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP Mix</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NP2409</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Taq Buffer with KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00348114</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PL1202</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AB1454</td>
			<td>One step RT-PCR exemplified in Figure 3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide solution (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Tris</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PR0612-1KG</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.00063.2500</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0729</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0701-100G</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladders and markers</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NL1405</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel loading dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUP SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>A25779</td>
			<td>Exemplified in Figures4-6B 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1725120</td>
			<td>Exemplified in the video and in Figures 4-6A 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358976001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G Homogenizer</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116005500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Protocol 2 
			Step&#160;2.4, 2.7 &#38; 2.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5418R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>AccuBlock Digital Dry Bath</td>
			<td>Protocol 2 
			Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Protocol 3 
			Step 3.1 - 3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>LSE 6766</td>
			<td>Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 &#38; 6 
			Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>LioFuge</td>
			<td>LM-60</td>
			<td>Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0</td>
			<td rowspan="2">Protocol 6 
			Step 6.6-6.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Pipette-Lite XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol-barrier pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z333328, Z333336, Z333344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr

Lo scopo di questo metodo è quello di facilitare l'individuazione veloce, sensibile e specifico di Tilapia Lago Virus (TiLV) nei tessuti di tilapia. Questo protocollo può essere usato come parte di programmi di sorveglianza, le misure di biosicurezza e nei laboratori di ricerca di base TiLV. Il gold standard di sistema diagnostico del virus in genere comporta l'isolamento del virus seguita da tecniche complementari quali la reazione a catena della polimerasi d'inversione-trascrizione (RT-PCR) per le necessarie verifiche. Questo può essere ingombrante, che richiede tempo e in genere richiede campioni di tessuto pesantemente infettati da virus. L'uso di RT-PCR (q) nella rilevazione di virus quantitativa è vantaggioso a causa della sua natura quantitativa, alta sensibilità, specificità, scalabilità e il suo rapido tempo di risultato. Qui, l'intero metodo di PCR approcci basati per TiLV rilevamento è descritto, da tilapia organo sezionamento, totale dell'acido ribonucleico (RNA) estrazione utilizzando una soluzione di tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidium, la quantificazione di RNA, seguita da una PCR in due fasi protocollo che comportano, sintesi di acido desossiribonucleico complementare (cDNA) e rilevamento di TiLV da PCR convenzionale o identificazione quantitativa via qPCR mediante SYBR green tingere. PCR convenzionale richiede passaggi post-PCR e semplicemente vi informerà circa la presenza del virus. Quest'ultimo approccio permetterà per quantificazione assoluta di TiLV giù a appena 2 copie ed è quindi eccezionalmente utile per la diagnosi di TiLV nei casi sub-clinici. Una descrizione dettagliata dei due approcci PCR, risultati rappresentativi da due laboratori e una discussione approfondita dei parametri critici di entrambi sono stati inclusi per garantire che i ricercatori e diagnosti trovano la loro più adatto e applicabile Metodo di rilevamento TiLV.

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Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Rilevamento di Tilapia Lago Virus mediante RT-PCR convenzionale e SYBR Green RT-qPCR

Questo protocollo diagnosi Tilapia Lago Virus (TiLV) nei tessuti di tilapia utilizzando metodologie di RT-PCR. L'intero metodo è descritto da dissezione del tessuto per estrazione di RNA totale, seguita dalla sintesi del cDNA e rilevamento di TiLV da PCR convenzionale o PCR quantitativa utilizzando dsDNA vincolante una tintura fluorescente legante.

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Benvenuti a tutti. Mi chiamo Win Surachetpong. Sono professore assistente presso la facoltà di microbiologia veterinaria e immunologia di medicina veterinaria presso l'Università kasetstart, thailandia.Io e il mio team siamo specializzati in malattie virali emergenti in tilapia. Ora stiamo lavorando al virus del lago tilapia che causa un'elevata mortalità nella tilapia. Poiché la tilapia è la seconda specie ittico più importante che è la cultura in tutto il mondo, fornisce una fonte proteica per un milione di persone e svolge un ruolo importante per la sicurezza alimentare.Quindi il recente focolaio del virus del lago tilapia causa un impatto socioeconomico che ha portato molti scienziati a cercare di trovare una soluzione a questo problema. Finora abbiamo bisogno di un metodo molto sensibile, rapido e accurato per rilevare il virus. In questo video, ti mostreremo passo dopo passo per rilevare il virus del lago tilapia nel tessuto ittico a partire dalla raccolta dei campioni, dalla popolazione campione e dall'analisi PCR in tempo reale.In primo luogo, solubilizzare il sovradosaggio di olio di stoffa in acqua per eutanasiare il pesce. Mettere il pesce morto su un vassoio, sterilizzare l'apparecchiatura utilizzando il 95% di etanolo, quindi bruciare con un bruciatore di alcol. Tagliare lentamente il pesce dall'addome inferiore verso l'alto, per raccogliere il fegato.Raccogliere parte del fegato in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. La prima parte dell'estrazione dell'RNA deve essere eseguita in una cappa di flusso Laminare e indossare dispositivi di protezione. Aggiungere un millilitro di reagente di estrazione dell'RNA nel tubo.Polverizzare il fegato usando un pestello tissutale in omogeneo. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio nel tubo. Quindi, mescolare delicatamente invertendo il tubo più volte.Mettere da parte per tre minuti a temperatura ambiente. Centrifuga a quattro gradi celsius a 12.000 RCF per 15 minuti. Raccogliere con cura i tubi dalla centrifuga.Trasferire delicatamente 500 microlitri della fase acquosa superiore incolore in un nuovo tubo. Aggiungere un volume di isopropanolo nel tubo. Riscaldare a meno 20 gradi celsius per due ore o fino a durante la notte per far precipitare l'RNA.Dopo l'incubazione, centrifugare la soluzione nella stessa condizione di centrifuga. Raccogliere i tubi dalla centrifuga, quindi scartare il supernatante. Il pellet di RNA può essere visto come puntato dalla freccia.Aggiungere un millilitro di 75% di etanolo nel tubo per lavare il pellet di RNA e invertire più volte. Centrifuga a quattro gradi celsius, a 10.000 RCF per 15 minuti. Raccogliere i tubi dalla centrifuga, quindi scartare il supernatante.Estraggono l'etanolo rimasto usando la pipetta automatica e asciugare all'aria a temperatura ambiente per cinque-10 minuti. Aggiungere da 30 a 60 microlitri RNasi acqua libera, preri warmed a 55-60 gradi celsius per solubilizzare il pellet di RNA. Utilizzare da uno a due microlitri di soluzione di RNA per misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro a micro volume.I risultati verranno visualizzate sullo schermo. Diluire la concentrazione a 200 nanogrammi per microlitro utilizzando acqua libera da RNasi. Eseguire la sintesi cDNA utilizzando le sostanze chimiche e le condizioni elencate come segue.Utilizzare un termociclo per convertire l'RNA in cDNA con le condizioni suggerite. Di seguito sono riportata le sostanze chimiche e le condizioni utilizzate per determinare il carico TiLV utilizzando PCR in tempo reale. Erogare sei millilitri del mix master qPCR in ogni flaconcino di tubo a nastro qPCR bianco.Successivamente, quattro millilitri di campione di cDNA vengono caricati nel pozzo. In questa fase una nuova punta del tubo deve essere cambiata in ogni singolo pozzo, per evitare la contaminazione da campione a campione. Sigillare saldamente la striscia qPCR con un cappuccio trasparente per strisce qPCR.Mescolare delicatamente la soluzione svolazzando su una punta della striscia. Quindi spin down usando la micro centrifuga per raccogliere tutto il liquido sul fondo dei vasi. Usa la condizione dei due gradini come mostrato nel video, seleziona il pozzo in 96 piastre di pozzo che utilizzerai.Seleziona il cyber green come flora per la tintura. Selezionare sconosciuto come tipo di esempio e inserire un nome in una casella del nome di esempio. Aprire il coperchio di una macchina PCR in tempo reale e posizionare la striscia qPCR nel pozzo assegnato.Quindi chiudi il coperchio. Eseguire la macchina con la condizione selezionata. La macchina inizierà e funzionerà dopo che il coperchio aveva raggiunto la temperatura desiderata.Dopo la fine delle condizioni qPCR, viene visualizzata la curva di amplificazione. Qui, la freccia di velocità indica dove il livello di soglia si interrompe tra la fase esponenziale e la fase lineare che si traduce in valore CT. Il valore CT viene quindi estrapolato nel numero di copia del registro dei virus per calcolare un certo numero di virus che rimangono utilizzando la curva standard.Il picco di fusione viene anche visualizzato per identificare se il virus rilevato da qPCR è, in effetti, TiLV in cui i picchi di fusione variano generalmente tra 79,5 e 80,5 gradi celsius. Quindi speriamo che questo metodo sia strumenti importanti per gli agricoltori e le organizzazioni di tutto il mondo, che potrebbero richiedere l'implementazione di un controllo e limitare la diffusione dell'infezione da TiLV.

Research

JoVE Journal

Environment

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Ricerca

Ambiente

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EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di cultura e RT-qPCR. II. Totale coltivabili Virus Assay

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EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR

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