Name: detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr
Uploaded: 2018-11-10T12:30:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR at JoVE.com

獣医細菌学研究所、Vetsuisse 部、ベルン大学を彼らのサポートに感謝しております。この作品は、PN に与えられる Vetsuisse 部、ベルン大学 120% モデルの資金によって初期のキャリアの研究者の学術振興とジェンダー平等のための委員会によって賄われていた。WS と PR のでサポートされるセンター総合研究所総合研究、カセサート大学、バンコク、タイ [高等教育研究の推進と国家研究プロジェクトのタイ大学、オフィス、食品農業高等教育委員会、文部科学省のタイ。彼女のナレーションの博士 Kwanrawee の Sirikanchana と Piyawatchara シカリン ビデオを編集するために感謝したいと思います。

著者が明らかに何もありません。

TiLV はイスラエル共和国の14の 2014 年に最初に報告された、その後、エジプト、コロンビア、インド、マレーシア、ウガンダ、タンザニア、タイ15,16,18,を含む複数の国で認定されています35,48。 グローバルな意識、特に、ティラピア生産国ではもっと注意に配置ウイルスおよび様々 な制限と対策政府当局からは、TiLV の拡散を防止しようとして実装されています。ここでは、サンプルのコレクション、RNA の隔離、cDNA 合成、PCR と qPCR アッセイを覆うティラピア組織における TiLV 検出のための詳しいプロトコルを説明されています。特定のディスカッションを保証するこれらのメソッドのさまざまな側面があります。TiLV が様々 なサイズ9,12,14,15,49とティラピア養殖ハイブリッド (o. を含むこれまでのところ、ティラピアの種にまたがる魚に発見されましたO. 球菌 x niloticus)11,14, ナイル川テラピア (O. niloticus)9,10,14,15,16,33,35,36,49,50と赤テラピア (外部sp.)16,33,48,51, ティラピア ナイル野生9,12と同様ブラックとティラピア51 t. ジリ14,15 s. galilaeus、 O. 球菌とt. シモニス intermedia14非常に最近 TiLV 野生鯉 (Barbonymus で識別されました。schwanenfeldii)52。内臓 (ギル、脾臓、肝臓、心臓、頭腎) または粘液37から組織サンプルは、年齢、サイズや魚種に関係なく瀕死の状態と同様、健全なティラピアを採集し、RNA の隔離のため処理できます。概説総 RNA の抽出のプロトコルはここカオトロ ピック変性剤であるフェノールとためのチオシアンの単相性のソリューションを使用します。組織が直接クロロホルムおよび上層の水相、中間期およびより低い有機相を含む明確な RNA の生成前記相分離を達成するために遠心分離の添加に続いてこのソリューションで均質化されました。RNA はイソプロパノールの沈殿物、汚染物質を取り除くために回収された RNA の洗浄の順で水相から隔離されます。この方法で RNA の隔離 Piotr Chomczynski、ニコレッタ サッキによって開拓された、ためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出53,54と呼ばれました。RNA の抽出に使用される試薬のこのタイプが市販購入または実験室で行われた (詳細については、材料の表を参照してください)。このプロトコルはシリカ系浄化など列ベースの方法よりも少しかかりますが、一般に、それはより費用効果より多くの RNA が得られます。
このプロトコルでは吸光光度法の値は、RNA の品質を示すことができますという説明した A260 値を使用して RNA の定量化 (A260/A280 = 1.9 2.1)。一方、このメソッドは、サンプル純度の良い指標を与えるが、それは絶対に抽出した RNA の品質について通知できません。RNA はそのまままたは部分的に劣化したかどうかを適切に決定、サンプルは 18 歳が前記ステンド EtBr のスミア アガロース電気泳動による分離をすることができ、28 s rRNA バンドを示す RNA の劣化。RNA の品質のさらなる検証ラボ-オン-チップ計測器を使用してがあります。さらに、それはまた DNase で浄化された RNA を消化する重要な汚染を削除するホスト DNA を下位アプリケーションによって偽の結果につながる可能性があります。追加 DNaseI 治療にはホスト gDNA は大部分は RNA のサンプルを汚染まだ場合 RNA 抽出手順の最後で実行できます (材料の表を参照してください)。
相補的な DNA 合成は全体的な qPCR 結果に大きく影響することができます、変異を導入することが法の一側面です。ここで提唱した cDNA プロトコルを単一コンポーネント セットアップの構成オリゴ (dT) を使用し、したがってのみ polyA 尾を含む Mrna を転写。まさに逆転写反応と cDNA のこのモードで使用するコンポーネントの合成が TiLV 検出32成功ユーザー制御できます。このセットアップに代わる逆転写反応に必要なすべてのコンポーネントを含む市販買ったマスター ミックスは、非常に速く、通常のマルチ ステップ、ピペッティングおよび複数温度プロトコルを使用せずに単純です。それは処理を最小限に抑え、すべてのサンプルの均一性を促進するため、これは有利です。このようなマスター ミックスがありますがそれに別に適用される RNA テンプレートを作ると人口における rna 全体の長さから代表的な cDNA シーケンスのコピーを生成するランダムなプライマーとランダムプライマー (ウイルスおよびティラピア mRNA をホスト) と理論的には、すべての目的の RNA の種は、従来の PCR またはそのようなサンプルから qPCR で測定できます。この汎用性は 2 段 RT-PCR 方法の主な利点様々 な実験に使用することができます長期的なプールを提供しています。結果で、ワンステップ RT-PCR 法のアプローチを表現されています前記シーケンス特異的プライマー (表 1) が使用され、1 つの管で RT と PCR を行った (マテリアル リストを参照してください)。一般的に、ランダムなプライミングを使用するよりも特定のターゲット RNA の高い RT の効率を可能にするシーケンス特異的プライマーが、RNA の特定の対象は 1 つだけ (を参照してください特定の研究所の唯一の目的となるような cDNA のサンプルで定量化することができます。材料の表cDNA 合成製品に関するご提案)。
従来の RT-PCR は通常使用に見えますがところ TiLV 診断9,13,14,15,16,17,の18,33,35,48,55。 RT qPCR 検出及び魚肉の粘液32,37TiLV の少量の定量化のより強力なツールであることが示されています。一般に、qPCR 広く高い感度、特異性、良い再現性、広いダイナミック レンジとスピード21による臨床ウイルス診断ラボで使用します。QPCR は当初より高価な従来の RT-PCR より実装するかもしれませんが、それは従来 pcr 法に比べて多くの重要な利点を提供してください。結果をサンプルからより高速なターンアラウンド タイムがあり、任意のポスト PCR の手順は必要ありません。この後者の点では研究室の汚染のための最小限のリスクがある、それはより簡単にアウト ブレークが発生した場合など、高スループットの状況に適応することができます。さらに、サブ臨床感染症21の低ウイルス量を検出する重要性が従来 RT-PCR より本質的に敏感です。逆のトランスクリプションが必要な入れ子になった PCR アプローチが必要だろうこれ、2 つさらに PCR の反作用とアガロースゲルを用いたゲルの電気泳動。これらの多くの手順は多くの時間を取るし、エラーまたは汚染の可能性を高めます。それにもかかわらず、その高感度のため Rt-qpcr 要求綿密な実験的なデザインと正確な結果56,57を生成するための定量化方法を十分に理解します。
DNA の結合 fluorophore SYBR グリーン私はこのプロトコルで実証されています。DsDNA の非特異的 DNA 結合色素であり従ってアッセイの特異性は完全に偽陽性58を生成可能性がありますプライマー セットあります。したがって、正しい T の 1 つだけの PCR 増幅を確認するため、融解曲線解析各 PCR の側で実行される dsDNA は PCR の反作用の特に重要な部分は、mが生成されます (これも達成されるべきゲル電気泳動新しいアッセイが実装されている場合)。DNA のフラグメントの Tmは様々 なその長さ、GC の構成、シーケンス、鎖の相補性などの機能に依存して、同様に濃度バッファー コンポーネントと PCR エンハンサー。研究所には、プライマー二量体またはその他の不要な PCR の製品の存在は明らかにしていないが、これは他のサンプルや実験のセットアップと見られる場合、アッセイはする必要があります 2 つの代表の結果の融解曲線解析再最適化されています。QPCR のより高度な技術は、このような融解曲線のステップを必要としないし、確かに、以来ペーパーは、このメソッドに基づいて TaqMan TiLV RT qPCR 開発されています 2 つのプライマーとプローブの高 TiLV 特定34ことを利用しました。
確かに、RT qPCR の試金のために設計したプライマーはアッセイの成功に不可欠とプライマーをここでは公開時間32TiLV ゲノム データに基づいて設計されました。しかし、RNA ウイルスの高い突然変異率を展示するよく知られているが、ISAV59でみられたように可能な系統が現在の診断テストを脱出します。常に普遍的なパン TiLV RT を生成するには、このようなウイルス型困難になります-qPCR 法及びこのような試金のみ継続的に改善される広範囲の場所と時間帯からのより多くの TiLV ゲノム データが利用可能になる場合。
最後に、重複実行または可能であれば、両方の内で反応をトリプリケートし、qPCR アッセイを間に不可欠です。Ctの値が非常に高い場合複製の使用は PCR の反作用は信頼性が高く、再現性のあることを確認するために特に重要であります。一般からデータをレプリケートする場合反応変化以上 0.5 サイクル反応が繰り返されることし、Ct値は一貫して > 0.5 サイクルを異なる場合にレプリケート、アッセイを再最適化する必要があります。統合 qPCR ピペッティング ロボットの使用は、この問題に非常に役立ちますが、高級ツールです。任意の実験と同様に、含める適切かつ適切なコントロールは、堅牢な分子アッセイを特にこのような試金が認定されることが診断の研究所で開発に最も重要なは。コントロールには、ポジティブ (肯定的な TiLV サンプル、TiLV プラスミド標準) ネガティブ コントロール (NTC と-RT) サンプルと内因性ティラピア ハウスキーピング遺伝子の検出を含める必要があります。このようなコントロールは過小評価することはできません、各試金、試金の各ステップの品質を正しく理解し、正しく結果を解釈するために含まれるべき。

2014 年に 20 キロの新記録に達した世界の一人当たりの魚の供給、これは養殖漁業の活発な成長によるものです。養殖は最も成長が著しい動物食糧生産のセクターを世界の一つで、人口1よりも速く成長している唯一の動物食品製造部門。Tilapiine cichilds 640 万トン (MT) の総世界生産 2015年298 億米ドルの推定値と世界的養殖 2 番目の最も重要な淡水魚で構成されます。ティラピアのトップ 10 の生産者が中国 (1.78 MT)、インドネシア (1.12 MT)、エジプト (0.88 MT)、バングラデシュ、ベトナム、フィリピン、ブラジル、タイ、コロンビア、ウガンダ2の順。グローバル ティラピアの生産が約 7.3 になると予想は 20303MT。彼らは水と気候条件5,6の広い範囲の下で容量で繁殖しやすいのでも蛋白質4の安価なソースを彼らだけでなく、ティラピアのような重要な世界的な食糧源となっています。わずか数十年前に、ティラピア農業を脅すいくつかの商業的に重要な疾患があったが、これはもはや真実を信じられていた。最初の重大な病気の流行は、ティラピアと業界全体がリスクではティラピア湖ウイルス病 (TiLVD) と呼ばれる新興ウイルス性疾患です。この病気は深刻な社会経済的結果を持ち、アフリカ7アジア、南アメリカの人々 の何百万のための食料安全保障に関する直接の脅威です。2018 の開始、健康局 (Oie) 報告したこの病原体情報カードだったので、3 つの大陸をカバーする 8 つの国8 TiLV、この病気の病因が正式に検出されそこ更新と、ペルー12台湾11インドネシア10ウガンダ9タンザニアの TiLV のより多くの報告がされています。TiLV は小説の一本鎖 RNA ウイルスはインフルエンザや伝染性サケ貧血ウイルス (ISAV)13など他の orthomyoxoviruses を連想させる特徴の様々 なが含まれているために、orthomyxo のようなウイルスをあるために記述します。それは、ガリラヤ湖、イスラエル共和国の14の野生と養殖のティラピアの巨額の損失の余波で初めて確認されました。夏死亡とナイル川のテラピア (試行)15エジプトのナイル川と赤いハイブリッド ティラピア TiLV 感染症に関連付けられている死亡症候群症例数 1 ヶ月その後、似たような病気の発生が指す(外部属)タイ16、それぞれ。水生動物ウイルスの検出歴史的に成長と細胞培養におけるウイルスの分離によって実行されます。各種細胞株が伝播し、E-11 細胞に由来する蛇頭魚 (Ophiocephalus 柄)17,18, OmB と TmB外部から発信されたを含む TiLV の分離テストされています。mossambicus18, と OnlB と OnlL ナイル ティラピア (O. niloticus)19発します。ウイルス培養には、さらに実験のための材料を提供することの利点がありますが、それは不利な点、それは細胞変性効果 (CPE) の形成を観察する少なくとも 4-7 日を必要とし、重大に、ヒッパルコスの異なるウイルスにより適合していることレプリケートが伝播し、同様 CPE を生成します。
過去数十年では細胞培養、血清と抗原検出ベースより速くより敏感の核酸検出テスト20、交換など、時間のかかる伝統的な診断法から移動されています。 21。これは、多くの qPCR アッセイは、ISAV22,23, ウイルスの出血性敗血症のウイルス (VHSV)24 のように多数の水生動物のウイルスの病気の重要な診断法として開発されているという事実によって明らか ,25, ベータノダ ウイルス26,27サケ科アルファウイルス28, 魚イリド29、Anguillid ヘルペス ウイルス 1 (AngHV1)30、およびリンホシスチス病病ウイルス (LCDV)31.診断と病原体サーベイランスのための強力なメソッドは緊急 TiLV の広がりを減らす必要があります。このような方法はように臨床徴候を開発前に感染症の早期発見と低ウイルス負荷の検出です。TiLV の検出のためまで、RT-PCR14,32, を含む別の PCR のプロトコル開発されている、入れ子になった RT-PCR18、半入れ子になった RT-PCR33、および RT qPCR32,34魚の体内に。TiLV 検出の感受性細胞における RT qPCR およびウイルス分離の比較は、RT qPCR はウイルス分離32よりも 1,000 倍以上敏感ことをわかった。各パブリッシュされた PCR のプロトコルは、TiLV の検出のための異なった感受性を報告が、ほとんどの試金が 7.5 コピー33、7 のコピー18または 2 コピー32あたりでウイルスのコピーの検出限界と高感度反応。
この方法の記事の目的は、TiLV 検出アッセイ、ティラピアの組織コレクション、総 RNA の抽出に始まる cDNA 合成を実行する方法の詳細に説明して、TiLV 特定の PCR 基づいた試金。具体的には、従来の RT-PCR と SYBR グリーン ベース Rt-qpcr 両方の包括的なプロトコルは、TiLV の検出を目指している科学者の広い範囲にアピールする記載されています。前者は敏感が通常安価な検出オプションです。定量的 PCR 機械など高価な試薬より精巧なインフラストラクチャが必要です、後者ですが量的、高速、高感度、それがサブ臨床で TiLV を検出するため使用ことできますを意味あることの利点感染した魚。RT-PCR と Rt-qpcr プロトコルは、TiLV および含まれて結果の強調表示、感度の異なる地理的な分離およびここで説明アッセイの再現性を持つ 2 つの異なる研究室で行われました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>An alternative to clove oil.&#160; 
			Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilization solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160; AM7020</td>
			<td>For storing tissues if they cannot be processed immediately 
			Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIreagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENEzol</td>
			<td>Geneaid</td>
			<td>GZR100</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisure</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38032</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homemade solution</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 
			30.45 g/L&#160; (400 mM) ammonium thiocyanate 
			8.20 g/L&#160; (100 mM) sodium acetate 
			380 mL/L&#160; (38 % v/v) phenol 
			50 mL/L (5 % v/v) glycerol 
			1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 
			Store up to 2 years at 4oC 
			Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Green Beads</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358941001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL Tube</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116913050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>RCI Labscan</td>
			<td>AR1027E-G2.5L</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9673</td>
			<td>A less toxic alternative to chloroform 
			Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (GC) &#8805; 99.8 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59300</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.09634.2500</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)</td>
			<td>R0551</td>
			<td>Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (purity (GC) &#8805; 99.9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (EMD Millipore)</td>
			<td>1.00983</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck (EMSURE)</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion TURBO DNA-free kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Can be performed at the end of the RNA extraction protocol 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viva cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>cDSK01</td>
			<td>Step 4.1 &#38; 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>A1172K</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Kit</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600107</td>
			<td>An alternative option&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase systems:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>14001012a</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - GoTaq Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separate PCR mixture components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP Mix</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NP2409</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Taq Buffer with KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00348114</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PL1202</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AB1454</td>
			<td>One step RT-PCR exemplified in Figure 3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide solution (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Tris</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PR0612-1KG</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.00063.2500</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0729</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0701-100G</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladders and markers</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NL1405</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel loading dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUP SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>A25779</td>
			<td>Exemplified in Figures4-6B 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1725120</td>
			<td>Exemplified in the video and in Figures 4-6A 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358976001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G Homogenizer</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116005500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Protocol 2 
			Step&#160;2.4, 2.7 &#38; 2.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5418R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>AccuBlock Digital Dry Bath</td>
			<td>Protocol 2 
			Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Protocol 3 
			Step 3.1 - 3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>LSE 6766</td>
			<td>Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 &#38; 6 
			Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>LioFuge</td>
			<td>LM-60</td>
			<td>Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0</td>
			<td rowspan="2">Protocol 6 
			Step 6.6-6.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Pipette-Lite XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol-barrier pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z333328, Z333336, Z333344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr

このメソッドの目的は、ティラピア組織におけるティラピア湖ウイルス (TiLV) の高速、高感度および特定の検出を容易にすることです。このプロトコルは、TiLV 基礎研究所監視プログラム、バイオ セキュリティ対策の一部として使用することができます。ウイルス診断法のゴールド スタンダードは普通逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) さらに詳しく調べるなどの補完的な手法によって続いてウイルス分離を含みます。これは面倒で時間のかかることができます、通常大きくウイルス感染組織サンプルが必要です。RT 定量的 (q) ウイルスの検出に PCR の使用は、その計量的性質、高い感度、特異性、スケーラビリティおよびその急速な時間が発生するため便利です。ここでは、PCR 法の全体のアプローチ TiLV 検出が記載、guanidium チオシアン酸-フェノール-クロロホルム ソリューション、2 段階 PCR によって続いた RNA 定量を用いたティラピア オルガン断面、合計リボ核酸 (RNA) 抽出私はプロトコルを伴う、相補的デオキシリボ核酸 (cDNA) 合成と従来の PCR または量的識別を介してqPCR SYBR の緑を使用してのいずれかによって TiLV の検出を染めます。従来の PCR はポスト PCR のステップを必要とし、単にウイルスの存在を知らせます。後者のアプローチとして 2 枚まで TiLV の絶対定量が可能となる TiLV サブ臨床診断に非常に役立ちます.2 つの PCR 方法、2 つの研究室からの代表的な結果の詳細な説明と徹底した議論両方の重要なパラメーターの研究者とにとって、最も適していると適用を見つけることを確認する含まれていますTiLV 検出の方法です。

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR at JoVE.com

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

ティラピア湖ウイルスを使用して従来 RT-PCR および SYBR の検出グリーン Rt-qpcr

このプロトコルは、RT-PCR の方法論を利用したティラピア生体ティラピア湖ウイルス (TiLV) を診断します。全体の方法は、総 RNA の抽出、続いて cDNA を合成して、従来の PCR またはバインディングの蛍光色素を結合 dsDNA を使用して量的な PCR によって TiLV の検出に組織郭清から記載されます。

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

皆を歓迎します。私の名前はウィン・スラチェッポンです。タイのカセットスタート大学で獣医微生物学・免疫学部の助教授をしています。私と私のチームは、ティラピアの新興ウイルス性疾患に特化しています。私たちは現在、ティラピアで高い死亡率を引き起こすティラピア湖ウイルスに取り組んでいます。ティラピアは世界で2番目に重要な魚種であるため、100万人にタンパク質源を提供し、食料安全保障に重要な役割を果たしています。だから、ティラピア湖ウイルスの最近の流行は、多くの科学者がこの問題の解決策を見つけようとする社会経済的影響を引き起こします。これまでのところ、我々は非常に非常に敏感で、迅速かつ正確なウイルスを検出する方法が必要です。このビデオでは、サンプル採取、サンプル集団、リアルタイムPCR分析から始まる魚組織のティラピア湖ウイルスを検出するためのステップバイステップを紹介します。まず、水に布油の過剰摂取を可溶化し、魚を安楽死させる。トレイに死んだ魚を置き、95%エタノールを使用して機器を殺菌し、アルコールバーナーで焼きます。ゆっくりと下腹部から魚を切り開き、肝臓を採取する。肝臓の一部を1.5ミリリットルの遠心分離チューブに集める。RNA抽出の最初の部分は、ラミナーフローフードで行われ、保護具を着用する必要があります。チューブに1ミリリットルのRNA抽出試薬を加えます。均質に組織の害虫を使用して肝臓を粉砕.200マイクロリットルのクロロホルムをチューブに加えます。その後、チューブを数回反転して軽く混ぜます。室温で3分間脇に置きます。12,000 RCFで摂氏4度で15分間遠心分離します。慎重に遠心分離機からチューブを収集します。無色の上水相の500マイクロリットルを新しいチューブに静かに移します。チューブにイソプロパノールの1つのボリュームを追加します。RNAを沈殿させるためにマイナス20度で2時間または一晩まで加熱します。インキュベーション後、同じ遠心分離条件で溶液を遠心分離する。遠心分離機からチューブを収集し、上清を捨てます。RNAペレットは、矢印によって指すように見ることができます。75%エタノールを1ミリリットル加えて、RNAペレットを洗浄し、数回反転させます。摂氏4度の遠心分離機、10,000 RCFで15分間。遠心分離機からチューブを収集し、上清を捨てます。オートピペットを使用して残ったエタノールを引き出し、室温で5〜10分間空気乾燥します。30~60マイクロリットルのRNaseフリーウォーターを加え、55~60°Cにあらかじめ温め、RNAペレットを可溶化します。1~2マイクロリットルのRNA溶液を使用して、マイクロ体積分光光度計を用いて濃度を測定します。結果が画面に表示されます。RNaseフリーウォーターを使用して、1マイクロリットル当たり200ナノグラムに濃度を希釈します。以下に記載されている化学物質および条件を用いてcDNA合成を行う。サーモサイクラーを使用して、提案された条件でRNAをcDNAに変換します。以下は、リアルタイム PCR を使用して TiLV 負荷を決定するために使用される化学物質と条件です。qPCRマスターミックスの6ミリリットルを白いqPCRストリップチューブの各バイアルに分配します。その後、4ミリリットルのcDNAサンプルがウェルにロードされます。この段階では、サンプルからサンプルへの汚染を避けるために、新しいパイプ先端をすべてのウェルで交換する必要があります。透明なqPCRストリップキャップでqPCRストリップをしっかりと密封します。ストリップの先端でフリックして溶液を軽く混ぜます。その後、マイクロ遠心分離機を使用してスピンダウンし、容器の底にあるすべての液体を収集します。ビデオに示すように2つのステップ条件を使用して、あなたが使用しようとしている96ウェルプレートでウェルを選択します。色素の植物相としてサイバーグリーンを選択します。サンプルタイプとして「不明」を選択し、サンプル名ボックスに名前を挿入します。リアルタイム PCR マシンの蓋を開き、qPCR ストリップを割り当てられたウェルに配置します。その後、蓋を閉じます。選択した条件でマシンを実行します。蓋が希望の温度に達した後、機械は起動して実行されます。qPCR条件の終了後、増幅曲線が示される。ここで、レート矢印は、CT値をもたらす指数位相と線形位相の間でしきい値レベルが切り取られる場所を示しています。CT 値はウイルス ログ コピー番号に外挿され、標準曲線を使用して残るウイルスの数を計算します。融解ピークはまた、qPCRによって検出されたウイルスが、実際には、溶融ピークが一般的に摂氏79.5〜80.5度の範囲のTiLVであるかどうかを識別するために表示される。ですから、この方法が、制御を実施し、TiLV感染の拡散を制限する必要がある世界中の農家や組織にとって重要なツールになることを願っています。

Research

JoVE Journal

Environment

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout (Salvelinus namaycush) from Its Prey

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout Salvelinus namaycush from Its Prey

湖トラウトのPCB同族体の正味栄養の導入効率の実験室推定（<em&gt;イワナnamaycush</em&gt;）獲物から

A technique for laboratory estimation of net trophic transfer efficiency (&#947;) of polychlorinated biphenyl (PCB) congeners to piscivorous fish from ...

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

内部リン負荷の尺度として湖堆積物の研究室に決定されたリンフラックス

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

エンテロウイルスと文化とRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615計測。 II。総培養可能なウイルスアッセイ

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

測定と土壌侵食と堆積土炭酸濃度農業経営に関連のパターンのマッピング

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

コレクションと真菌 DNA の分析のための産業大気サンプルの抽出

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

ポータブル リアルタイム PCR を用いた土壌伝染性植物の敷地内の分子の検出

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

特定病原体緑化シトラスカンキツグリーニング病病原細菌属カンキツ葉組織サンプルで使用した従来の PCR の正確な検出

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...