Name: detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr
Uploaded: 2018-11-10T12:30:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR at JoVE.com

Estamos gratos ao Instituto de bacteriologia veterinária, faculdade Vetsuisse, Universidade de Berna, pelo seu apoio. Este trabalho foi financiado pela Comissão para a promoção da precoce carreira pesquisadores acadêmicos e gênero igualdade na faculdade Vetsuisse, Universidade de Berna, através do financiamento do modelo de 120% concedido a PN. WS e PR são suportados pelo centro de estudos avançados para agricultura e alimentação, Instituto para estudos avançados, Universidade Kasetsart, Banguecoque, Tailândia, no âmbito do ensino superior pesquisa promoção e nacional pesquisa Universidade projeto da Tailândia, escritório da Tailândia de Comissão, Ministério da educação, ensino superior. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Kwanrawee Sirikanchana para sua narração e Piyawatchara Sikarin para edição do vídeo.

O protocolo de uso de animais para este estudo foi aprovado pela Comissão de ética Kasetsart University Animal sob licença número Alves 59-VET-016.
Nota: Consulte a Tabela de materiais para estendido informações relativas aos reagentes e equipamento sugerido para este protocolo.
1. coleta de amostra de tecido
<ol><li>Eutanásia o peixe usando uma overdose de óleo de cravo (o volume depende do tamanho do peixe e concentração de produtos, geralmente mais de 3 mL/L). Imergir um quarto da tesoura pinça e mayo em etanol 95% (v/v), seguido pela queima o equipamento usando uma lamparina para esterilizar o equipamento. Nota: Tricaina Metanossulfonato (MS-222) pode ser usado em vez de óleo de cravo.</li>
	<li>Encontrar o fígado e cortou um pedaço pequeno (aproximadamente 20-100 mg) ou recolher 200 µ l de muco, usando a tampa de vidro ou lâmina cirúrgica para remover o muco do anterior posterior do peixe tilápia e colocar as amostras em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
	<li>Amostras do processos imediatamente, armazenam em um solução de estabilização de RNA ou movê-los a-80 ° C até utilização posterior. Nota: A maior tarefa no trabalho com RNA é preparar as moléculas de RNA intactas e mantê-los sem danos ao longo de qualquer manuseio subsequentes do. A espinha dorsal do RNA é intrinsecamente mais sensível aos danos do DNA. Extração e isolamento de RNA total de células do tecido necessita de técnica de laboratório cuidado; Tome todas as disposições para evitar a contaminação de RNase, usando luvas, usando água livre de RNase, reagentes, equipamentos, utensílios de plástico, vidro, espaço de trabalho e usando filtro dicas para pipetar.</li>
</ol>2. Guanidium tiocianato - fenol - clorofórmio extração de RNA
<ol><li>Adicione 1 mL de solução de monofásico contendo isotiocianato de fenol e guanidina num tubo contendo a amostra de tecido da seção 1. Atenção: Esta solução é muito tóxica e deve ser manuseada com cuidado em uma capa de fluxo laminar com equipamento protetor e usando as luvas óculos, roupas e segurança adequadas.</li>
	<li>Triture a amostra de tecido usando um homogeneizador de pilão até homogênea. Nota: As amostras podem também ser homogeneizadas usando um homogeneizador de poder combinado com grânulos cerâmicos. Certifique-se de que a amostra de tecido é completamente homogeneizada antes de prosseguir para o próximo passo ou parar o protocolo aqui e armazenar as amostras totalmente homogeneizadas a-80 ° C até utilização posterior.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de clorofórmio para separação de fases. Cuidado clorofórmio é um potencial narcótico e é extremamente perigoso. Isso deve ser manuseado com cuidado em uma capa de fluxo laminar com equipamentos de proteção, bem como, vestindo as luvas óculos, roupas e segurança adequadas. Como um menos tóxico alternativo, 1-Bromo-3-cloropropano também pode ser usado. Nota: Escala os volumes cima ou para baixo, se for caso disso. Por exemplo, se apenas 500 µ l de solução monofásica contendo isotiocianato de fenol e guanidina foi usado, então só Adicione 100 µ l de clorofórmio nesta etapa.<ol>
<li>Misturar as amostras bem pela inversão por 15 s.</li>
		<li>Incube as amostras por 3 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar por 15 min em 12.000 × g e 4 ° C. Nota: Deve haver uma separação clara em uma fase orgânica inferior, uma interfase branca e uma fase aquosa superior contendo RNA. Esta fase superior é normalmente incolor, mas dependendo do tipo e quantidade de tecido homogeneizado, pode ter uma aparência rosa luz.</li>
	<li>Transferi a fase aquosa superior (aproximadamente 500 µ l) para um tubo de microcentrifugadora fresco sem perturbar a interfase. Nota: não tente transferir toda a fase aquosa, deixar uma pequena quantidade para evitar qualquer contaminação potencial do RNA que contém a fase aquosa com o orgânico ou interfase.</li>
	<li>Adicione 1 volume de isopropanol 100% para precipitar o RNA.<ol>
<li>Opcionalmente, se quantidades muito pequenas de tecido foram usadas, em seguida, adicione 1 µ l (5-10 µ g) de glicogênio RNase-livre para cada amostra a promover eficiente precipitação do RNA. Isso ajuda a identificação da pelota do RNA na etapa 2.8. Nota: O glicogênio funciona como um portador do RNA e impedirá que pequenas quantidades de RNA de degola para o lado do tubo.</li>
		<li>Mix tubos bem por inversão várias vezes.</li>
		<li>Armazenar as amostras durante 2 h durante a noite a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amostras de centrifugar por 15 min a 12.000 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante, tomando cuidado para não deslocar o pellet de RNA na parte inferior do tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Adicione 1 mL de etanol a 75% (v/v) e misturar amostras do RNA o tubo várias vezes por inversão.</li>
	<li>Centrifugar por 15 min em 10.000 x g e 4 ° C. Nota: O protocolo pode ser parado aqui e as amostras compreendendo a pelota do RNA em 75% de etanol podem ser armazenadas a-20 º C até utilização posterior.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante, estar atentos para não deslocar o pellet de RNA na parte inferior do tubo de microcentrifugadora.<ol>
<li>Opcionalmente, repita os passos 2.9-2.11 usando etanol a 70% (v/v). Completamente a pelota do RNA de lavagem minimizará qualquer sal ou reporte de contaminantes que possam interferir será sensíveis aplicações a jusante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tirar o etanol restante com uma pipeta e em seguida, secar ao ar livre a pelota do RNA em temperatura ambiente por mais tempo do que 5 a 10 min. Nota: demasiado secas pelotas será difícil para re-suspender.</li>
	<li>Adicione 30-60 µ l de água livre de RNase, pre-aquecida a 55-60 ° C para solubilizar a pelota do RNA.</li>
	<li>Coloque o RNA no gelo para uso imediato ou loja a-80 ° C para uso posterior.</li>
</ol>3. quantificar a concentração de RNA usando um Espectrofotômetro de Micro-Volume
<ol><li>Mude as configurações do espectrofotómetro para RNA.</li>
	<li>Use 1-2 µ l de água livre de RNase como um espaço em branco.</li>
	<li>Use 1-2 µ l de cada amostra de RNA para avaliar a quantidade de RNA.</li>
	<li>Gravar as leituras em 230 nm, 260 nm e 280 nm para cada amostra.</li>
	<li>Diluir o RNA a 200 ng / µ l, usando a água livre de RNase.</li>
</ol>4. síntese de DNA complementar (cDNA) usando o RNA total
<ol><li>Misture 1 µ g de RNA total do protocolo 2, 2 µM oligo (dT), mistura de dNTPs de 0.5 mM e trazer o volume final de 10 µ l com água livre de nuclease. Por isso, prepare um RT-mestre-mix de acordo com o número de amostras e controles a serem testados. Nota: Os controles são uma amostra da transcriptase reversa-sinal de menos (-RT) no qual a enzima RT é substituída com água livre de nuclease (ver passo 4.3) e um sem controle do modelo (NTC) em que água livre de nuclease é adicionada à mistura de mestre ao invés de molde de ARN.<ol>
<li>Misture as amostras bem pipetando seguido de uma breve centrifugação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube as amostras a 65 ° C por 5 min, seguido de uma incubação de 2 min no gelo.<ol>
<li>Brevemente Centrifugar as amostras para coletar todo o líquido na parte inferior dos tubos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Juntar 1 x tampão de transcriptase reversa, 100 U reverse transcriptase e trazer o volume final de cada amostra a 20 µ l usando água livre de nuclease.<ol>
<li>Misture as amostras bem pipetando seguido de uma breve centrifugação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube as amostras a 42 ° C por 60 min, seguido de 85 ° C por 5 min.</li>
	<li>Diluir o cDNA sintetizado para uma concentração desejada adicionando um volume adequado de água livre de nuclease e colocar o cDNA no gelo para uso imediato ou armazená-lo a-20 ° C para uso posterior.</li>
</ol>5. a TiLV PCR convencional
<ol><li>Use o cDNA, amostras e controles, gerados no protocolo seção 4 como modelos para uma reação de PCR usando qualquer um dos pares de cartilha estabelecida detalhadas na tabela 1, juntamente com uma DNA polimerase de escolha. Nota: Um controle não-modelo adicional (NTC) deve ser incluído aqui substituindo o cDNA para água nuclease livre na reação de PCR. Um controle positivo, se disponível, também deve ser incluído compreendendo previamente verificadas amostras positivas de TiLV ou o apropriado TiLV fragmento de cDNA clonado em para um plasmídeo.</li>
	<li>Prepare uma mistura de mestre do PCR de acordo com as diretrizes do sistema DNA-polimerase em uso e o número de amostras e controles a serem testados. Esta mistura deve incluir o primer para a frente, reverso da primeira demão, dNTPs, MgCl2 e a DNA polimerase selecionado, juntamente com sua reserva.</li>
	<li>De acordo com as diretrizes do polymerase de ADN selecionado, combine o volume designado de mestre-mistura com a quantidade sugerida de amostras de cDNA e amostras de controle. Nota: Preparar um 0.5 x excesso de reação é frequentemente benéfico desde que alguns do mestre-mix é perdido durante a pipetagem.</li>
	<li>Realize PCR ciclismo condições de acordo com as diretrizes do sistema utilizado DNA polimerase e usando uma adequada temperatura do recozimento para os primers em uso (tabela 1). Geralmente, esse programa irá envolver uma desnaturação inicial a 95 ° C por 2-5 min, seguido por 30-40 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 30 s, recozimento a temperatura recomendada para 30 s e alongamento a 72 ° C por 30 s, seguido de um alongamento final a 72 ° C, durante 5-10 min.</li>
	<li>Carga de 5 a 15 µ l de cada reação de PCR e uma escada de DNA apropriada em poços de um gel de agarose 1-2%, dependendo o tamanho esperado do produto do PCR. Separar o DNA amplificado por electroforese em gel e manchar o gel por brometo de etídio (EthBr) para facilitar a visualização das bandas de DNA do tamanho esperado (tabela 1) em uma máquina de documentação de gel usando luz UV. Cuidado: EtBr é tóxico; deve ser manuseado com cuidado, vestindo a roupa de proteção apropriada e luvas de segurança.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Segmento-alvo TiLV genoma</td>
			<td colspan="3">Cartilha para a frente 5' - 3'</td>
			<td colspan="3">Primeira demão reversa 5' - 3'</td>
			<td>Tamanho do produto do PCR (bp)</td>
			<td>Tm ° C</td>
			<td>Referência original</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">CCAAACGTTATCTCTTAATTACGCAC</td>
			<td colspan="3">GCAAATATTTCTCTCATTCGCCT</td>
			<td>1641</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong et al, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">CCTCATTCCTCGTTGTGTAAGT</td>
			<td colspan="3">AGGAGTTGCTGTTGGGTTATAG</td>
			<td>1000</td>
			<td>62</td>
			<td>Eduardo et al., 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">ACTCTCTATTACCAAATACATTTACT</td>
			<td colspan="3">TTACCATATATATAGTGAAGGC</td>
			<td>1445</td>
			<td>45</td>
			<td>Surachetpong et al, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">GTCCAGGGCGGTATGTATTG</td>
			<td colspan="3">CTTACGGCTGACAAGTCTCTAAG</td>
			<td>834</td>
			<td>62</td>
			<td>Eduardo et al., 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">GTTGGGCACAAGGCATCCTA</td>
			<td colspan="3">TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT</td>
			<td>250</td>
			<td>56</td>
			<td>Eyngor et al, 2014</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">TATGCAGTACTTTCCCTGCC</td>
			<td colspan="3">TTGCTCTGAGCAAGAGTACC</td>
			<td>491</td>
			<td>57</td>
			<td>Eyngor et al, 2014</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">ACCCCTTAATCCTTAATAGACCGTTA</td>
			<td colspan="3">CCCATAATCCTCTATTAGAACGTCGT</td>
			<td>1352</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong et al, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">GTCGAGGCATTCCAGAAGTAAG</td>
			<td colspan="3">GAGCTAAGGGAACGGCTATTG</td>
			<td>834</td>
			<td>62</td>
			<td>Eduardo et al., 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">AGCAGCAGCAGGAGAAAGAG</td>
			<td colspan="3">ACCGTCCTGTTTCTGAATGG</td>
			<td>358</td>
			<td>60</td>
			<td>Nicholson et al, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">CCAAAGTTTACTCCTATTACCCAGA</td>
			<td colspan="3">GCAAATCTTTCTCCAATTACCGTCT</td>
			<td>1250</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong et al, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">GCCCAATGGTTCCCATATCT</td>
			<td colspan="3">GCCCAATGGTTCCCATATCT</td>
			<td>524</td>
			<td>62</td>
			<td>Eduardo et al., 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">CCAAATGTTTCTCTTATCTCAGACTC</td>
			<td colspan="3">CTTTTTCTCAGTTTACCACTTTATG</td>
			<td>1087</td>
			<td>57</td>
			<td>Surachetpong et al, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">CAACTCTTAGCCTCCGGAATAC</td>
			<td colspan="3">CGTTCTGCACTGGGTTACA</td>
			<td>696</td>
			<td>62</td>
			<td>Eduardo et al., 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="3">CCAAATTTTACCTCTCGCAT</td>
			<td colspan="3">TCAAGCACTTAAAACTGTACC</td>
			<td>1027</td>
			<td>45</td>
			<td>Surachetpong et al, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="3">CCCACACGACAGGACATATAG</td>
			<td colspan="3">GAGTTGGCTTAGGGTGATAAGA</td>
			<td>948</td>
			<td>62</td>
			<td>Eduardo et al., 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="3">CTCTCTTTGCATTGCATACCGT</td>
			<td colspan="3">GACCAATTATCCCTGCTTTCA</td>
			<td>704</td>
			<td>57</td>
			<td>Surachetpong et al, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="3">TCCTTTAGGGATTGGCACTAAC</td>
			<td colspan="3">TTCCATCGACTGCTCCTAGA</td>
			<td>486</td>
			<td>62</td>
			<td>Eduardo et al., 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="3">ACCTCATCTACACTAACATTTCCA</td>
			<td colspan="3">TCATCATTACACAAATGGAGTAGCT</td>
			<td>637</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong et al, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="3">CTTAAGGGCCATCCTGTCATC</td>
			<td colspan="3">TGGCTCAAATCCCAACACTAA</td>
			<td>476</td>
			<td>62</td>
			<td>Eduardo et al., 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="3">TTGGTGATGTCACGATGGATA</td>
			<td colspan="3">AGTTCTATCGCCAGCCATGT</td>
			<td>351</td>
			<td>60</td>
			<td>Nicholson et al, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="3">ACAAGTCCGATTACTTTTTCCGC</td>
			<td colspan="3">TCTTTCTCACGTCCTTAAAGTCA</td>
			<td>530</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong et al, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="3">GATATCCTCCACATGACCCTTC</td>
			<td colspan="3">GTACGTCACTTTGTGCCATTAC</td>
			<td>261</td>
			<td>62</td>
			<td>Eduardo et al., 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td colspan="3">AACCCTACTAACACCAAATATAGCT</td>
			<td colspan="3">CTTTCCCTCTGACACCCTGT</td>
			<td>450</td>
			<td>50</td>
			<td>Surachetpong et al, 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td colspan="3">TCCTCTCTGTCCCTTCTGTT</td>
			<td colspan="3">CAGGATGAGTGTGGCAGATTAT</td>
			<td>276</td>
			<td>62</td>
			<td>Eduardo et al., 2018</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Cartilha publicada pares para a amplificação do cDNA de TiLV usando o ponto de extremidade do PCR. O primer conjunto mostrado em negrito foram usados para gerar os resultados representativos, mostrados na Figura 3A e 3B.
6. TiLV quantitativos Polymerase Chain Reaction (qPCR)
<ol><li>Usando um plasmídeo contendo o TiLV apropriado segmento genômico 3 cDNA como um padrão, tais como pTiLV32, preparar uma série de 10 vezes de diluição serial duplicado ou triplicou.</li>
	<li>Preparar uma mestre-mistura de qPCR para todas as amostras, padrões e controles, tendo em conta as reações devem ser executada em duplicar ou triplicata utilizando 0,4 µ l de água livre de nuclease, 0,3 µ l de primer para a frente, 0,3 µ l de primer reverso e 5 µ l de 2 x SYBR Green Mestre-mistura de polymerase do DNA por reação.<ol>
<li>Use as primeiras demão em uma concentração de 10 µM e as informações da primeira demão e o pTiLV padrão, como segue: Encaminhar a cartilha: TiLV-112F (5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3') Reverter a primeira demão: TiLV-112R (5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3') Padrão pTiLV:10 pg / µ l Nota: Se o número total de amostras e controles é 10 e será executado em triplica, isso equivale a um mestre de qPCR-mix composto por 12 de água livre de nuclease µ l, 9 da primeira demão µ l para a frente, primeira demão reversa de 9 µ l e 150 µ l de SYBR Green DNA polimerase mestre-mix. Adquiridos comercialmente 2 x universal SYBR Green DNA polimerase mestre-misturas contêm todos os componentes necessários para a reação de qPCR, ou seja, o SYBR Green tingir, começo quente Taq DNA polimerase, dNTPs, MgCl2 e corantes de referência passiva. Proteja o mix de SYBR Green mestre da luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dispense a 6 µ l de mistura de mestre qPCR em qPCR tira tubos ou um prato bem 96 compatível com a máquina de qPCR em uso.</li>
	<li>Adicione 4 µ l de modelo de cDNA, controles ou padrões de TiLV serialmente diluídas em tubos ou poços da placa de 96 bem.</li>
	<li>Fechar os tubos de qPCR ou selar a 96 placa bem com uma tampa da placa compatível para a máquina de qPCR em uso<ol>
<li>Agite suavemente os tubos de qPCR para misturar a solução e spin-down os qPCR tubos ou 96 placa bem usando uma centrífuga para coletar todo o líquido no fundo dos vasos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloca os tubos ou placa do termociclador em tempo real.<ol>
<li>Programar o thermocycler qPCR para executar uma desnaturação inicial a 95 ° C por 3 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 10 s e 60 ° C por 30 s para recozimento da primeira demão e alongamento, terminando com um derretimento curva passo de 65 ° C a 95 ° C com um incremento de 0,5 ° C / 5 s.</li>
		<li>Selecione SYBR como um corante de fluoróforo, em seguida, selecione o desconhecido como um tipo de amostra e inserir um nome em uma caixa de nome de amostra.</li>
		<li>Abra a tampa da máquina RT-qPCR e coloque a fita de qPCR para os poços atribuídos e, em seguida, feche a tampa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize o ensaio de RT-qPCR com as condições selecionadas. A máquina começa a funcionar depois que a tampa tenha alcançado a temperatura desejada. Recolha a fluorescência de cada amostra após cada etapa da extensão para monitorar o progresso da reação. Nota: A máquina de qPCR e software relacionado irão automaticamente calcular todos os parâmetros do ensaio e exibir as curvas de amplificação em tempo real, enquanto a curva padrão e a curva de fusão serão gerados no final do ciclo de qPCR.</li>
	<li>Realizar análise de dados e aquisição, assegurando-se primeiro que o derretimento curvas para cada amostra e padrão tem um pico de uniforme a temperatura esperada para o amplicon.<ol>
<li>Avaliar as curvas de amplificação das amostras e padrões e definir o limiar de uma região foram que a taxa de amplificação dos cDNAs é o mesmo em todas as amostras. Isto normalmente é realizado automaticamente pelo software, mas deve ser cuidadosamente verificado.</li>
		<li>Calcule o número de cópias de TiLV usando a curva padrão.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

TiLV foi primeiramente relatada em 2014 em Israel14 e desde então, ele foi identificado em vários países, incluindo Egito, Colômbia, Índia, Malásia, Uganda, Tanzânia e Tailândia15,16,18, 35 , 48. conscientização global, particularmente, em países produtores de tilápia tem colocado mais atenção sobre o vírus e várias restrições e medidas de controlo das autoridades do governo têm sido implementadas a tentativa de evitar a propagação do TiLV. Aqui, um protocolo detalhado para a deteção de TiLV em tecido de tilápia, abrangendo a coleta de amostra, isolamento de RNA, síntese, PCR e qPCR ensaios de cDNA foi explicado. Há vários aspectos a estes métodos que garantem discussão específica. TiLV foi identificado em peixes, abrangendo uma variedade tamanhos9,12,14,15,49 e espécies de tilápia, até agora, incluindo a tilápia híbrida de criação (O. niloticus x o. aureus)11,14, Nile tilapia (o. niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 e vermelho de tilápia (Oreochromis SP.)16,33,,48,51, como bem como selvagens Nile tilapia9,12, preto tilápia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, o. aureus e T. simonis intermedia14 e muito recentemente TiLV foi identificado em carpa selvagem (Barbonymus schwanenfeldii)52. Amostras de tecido dos órgãos internos (gill, baço, fígado, coração, rim cabeça) ou muco37 podem ser coletadas de tilápia saudável, bem como moribunda, independentemente da idade, tamanho ou espécie e processadas para isolamento de RNA. O protocolo de extração de RNA total descrito aqui usa uma solução monofásica de fenol e guanidínio tiocianato, que é um agente de desnaturação caotrópicas. Os tecidos são homogeneizados diretamente nesta solução, seguido pela adição de clorofórmio e centrifugação para conseguir a separação de fases em que uma clara RNA que contém a fase aquosa superior, uma interfase e a fase orgânica inferior é gerado. O RNA é isolado da fase aquosa por precipitação do isopropanol, seguida de lavagem do RNA recuperado para se livrar de contaminantes. Isolamento do RNA por esta metodologia foi pioneira por Piotr Chomczynski e Nicoletta Sacchi e foi referido como guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio extração53,54. Este tipo de reagente utilizado para a extração de RNA pode ser comprado ou feito em laboratório comercialmente (consulte a Tabela de materiais , para mais informações). Este protocolo ligeiramente mais lento do que métodos baseados em colunas, como a purificação baseada em sílica, mas em geral, é mais custo-eficaz e produz mais de RNA.
Neste protocolo, quantificação de RNA usando valores A260 foi delineada pelo qual valores de espectrofotometria podem indicar a qualidade do RNA (A260/A280 = 1.9-2.1). Enquanto este método dará uma boa indicação de pureza da amostra, ele absolutamente não pode informar sobre a qualidade do RNA extraído. Para determinar corretamente se o RNA está intacto ou parcialmente degradadas, as amostras podem ser separação por eletroforese em gel de agarose em que manchas do EtBr manchado 18S e bandas de rRNA 28S indicam degradação de RNA. Mais verificação de qualidade de RNA pode incluir usando um instrumento de laboratório-em-um-microplaqueta. Além disso, é também importante para digerir o RNA purificado com DNase eu remover contaminantes hospedar o DNA genômico, que dependendo das aplicações a jusante pode levar a resultados falsos. Se o anfitrião gDNA ainda está a contaminar a amostra de RNA em grande medida, um tratamento adicional de DNaseI também pode ser realizado no final do processo de extração de RNA (ver Tabela de materiais).
Síntese de DNA complementar pode afetar muito os resultados globais da qPCR e é um aspecto do método que pode apresentar variação. O protocolo de cDNA defendido aqui é composto de uma configuração de componente único usando oligo (dT) e, portanto, apenas transcreve mRNAs contendo polyA caudas. Permite o controle de usuário de exatamente quais componentes para uso na reação de transcrição reversa e este modo de cDNA síntese provou bem sucedido para a deteção de TiLV32. Uma alternativa para esta montagem é um mestre-mistura comercialmente comprou contendo todos os componentes necessários para a reação de transcrição reversa e é muito rápido e simples sem o protocolo habitual de várias etapa, pipetagem e multi-temperatura. Isto é vantajoso, pois minimiza a manipulação e promove a uniformidade em todas as amostras. Tais mestre-misturas frequentemente incluem oligo (descolamento) e primers aleatórios tornando-o aplicável a diferentes modelos de RNA e gerando cópias de cDNA representativa das sequências de todo o comprimento dos RNAs em uma população (viral e tilápia hospedar mRNA) e, em teoria, todas as espécies de RNA desejada então podem ser medida por PCR convencional ou de qPCR de tal uma amostra. Esta versatilidade é a principal vantagem de uma abordagem de RT-PCR 2-passo; fornece um pool de longo prazo que pode ser usado para muitas experiências diferentes. Nos resultados, uma abordagem de RT-PCR de uma etapa tem sido representada no qual iniciadores específicos de sequência (tabela 1) foram usados e o RT e PCR foram realizadas em um tubo (veja a lista de material). Em geral, primers específicos de sequência permitem para uma maior eficiência de RT do alvo específico do RNA do que usando a escorva aleatória, mas o alvo específico do RNA é o único que pode ser quantificado em uma amostra tão cDNA que pode ser o único objetivo de determinados laboratórios (ver Tabela de materiais para sugestões de produto de síntese de cDNA).
Enquanto RT-PCR convencional parece ser comumente usado até agora na TiLV diagnóstico9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR mostrou ser uma ferramenta mais poderosa para a detecção e quantificação de pequenas quantidades de TiLV nos tecidos de peixes ou muco32,37. Em geral, qPCR é amplamente utilizado em laboratórios de diagnóstico de virologia clínica devido a sua alta sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade boa, ampla faixa dinâmica e velocidade21. Enquanto qPCR pode ser inicialmente mais caro de implementar do que RT-PCR convencional, ele oferece muitas vantagens importantes sobre PCR convencional; tem um mais rápido tempo de rotação da amostra para resultados e não requer quaisquer etapas de post-PCR. Este último ponto significa que há um risco mínimo para a contaminação do laboratório e pode ser mais facilmente adaptado para situações de alto rendimento como em caso de surtos. Além disso, é inerentemente mais sensível do que a RT-PCR convencional, que é de vital importância para detectar baixas cargas virais em infecções sub-clínica21. Isso exigiria uma abordagem PCR aninhada que exige a transcrição reversa, duas outras reações de PCR e depois análise de agarose electroforese do gel. Estes passos muitos levam muito tempo e aumentam as chances de erros ou de contaminação. No entanto, devido a sua alta sensibilidade, RT-qPCR exige meticuloso desenho experimental e um conhecimento aprofundado das técnicas de quantificação para gerar resultados precisos56,57.
O ligação de DNA fluoróforo, SYBR Green demonstrou-me neste protocolo. É um corante de ligação dsDNA inespecífica DNA e, assim, a especificidade do ensaio encontra-se inteiramente no conjunto de primers, que podem gerar falsos positivos58. Portanto, enquanto o dsDNA derretendo análise de curva, realizada no final de cada PCR é especialmente importante para a reação de PCR porque confirma que apenas um PCR amplicons do correto Tm é produzido (isto deve também ser alcançado por gel eletroforese quando novos ensaios estão sendo implementados). O Tm de um fragmento de DNA é dependente de uma variedade de características tais como o seu comprimento, composição de GC, sequência, vertente complementaridade, concentração, bem como no buffer componentes e potenciadores de PCR. As análises de curva derretimento nos resultados representativos mostradas de dois laboratórios não revelaram a presença de dímeros-primeira demão ou outros produtos PCR indesejados, mas se isto for observado com outras amostras e/ou experimentais set-ups, o ensaio deve ser Re-otimizado. As tecnologias mais avançadas de qPCR não requer um passo de curva tão derretendo e com efeito, desde este métodos paper foi escrito, um TaqMan baseado TiLV RT-qPCR foi desenvolvido utilizando dois primers e uma sonda, tornando-se altamente específico de TiLV34.
Sem dúvida, as primeiras demão projetadas para ensaios de RT-qPCR são fundamentais para o sucesso do ensaio e os primers aqui foram projetados com base em cima os publicamente disponíveis dados genomic da TiLV o tempo de32. No entanto, vírus de RNA são bem conhecidos para apresentam taxas de mutação alta e possíveis estirpes irão escapar os testes de diagnóstico atuais, como foi observado por ISAV59. Sempre vai ser difícil para esses tipos de vírus gerar um universal pan-TiLV RT-qPCR ensaio e desses ensaios serão apenas continuamente melhorados se dados genomic da mais TiLV de longo alcance locais e períodos de tempo se tornam disponíveis.
Finalmente, é essencial para executar duplicata ou triplicata se possível, as reacções em ambos intra e inter ensaios qPCR. Se os valores det C são muito elevados, então o uso de repetições é especialmente importante para verificar que a reação de PCR é confiável e reprodutível. Em geral, se replicam dados de reações varia mais do que 0,5 ciclos, as reações devem ser repetidos e se os valores det C consistentemente variam ciclos > 0,5 na Replica, o ensaio deve ser re-otimizado. O uso de um robô de pipetagem integrado qPCR ajuda imensamente com esta questão, mas é uma ferramenta de luxo. Como com qualquer experimento, os controles adequados e pertinentes de inclusão são de extrema importância para o desenvolvimento de ensaios moleculares robustos, especialmente em laboratórios de diagnóstico onde tais ensaios tem que ser credenciado. Controles devem incluir positivo (amostra positiva de TiLV, TiLV do plasmídeo padrão) e amostras de controles negativo (NTC e -RT), bem como a detecção de genes de tilápia endógena das tarefas domésticas. Esses controles não podem ser subestimados e devem ser incluídos em cada ensaio de entender corretamente a qualidade de cada etapa do ensaio e interpretar corretamente os resultados.

O fornecimento de peixe per capita global atingiu um novo recorde de 20 kg em 2014, e isso foi devido ao crescimento vigoroso na aquicultura. Aquicultura continua sendo um dos setores de produzir alimentos de origem animal mais cresce em todo o mundo e é o sector de produção de alimentos só animais que está crescendo mais rápido do que a população humana1. Cichilds peixes compõem o segundo mais importante peixe de água doce cultivado em todo o mundo com uma produção global total de 6,4 milhões de toneladas (MT) e um valor estimado de 9,8 bilhões de dólares em 20152. Os produtores de top 10 da tilápia são China (1.78 MT), Indonésia (1.12 MT) e Egito (0.88 MT), seguido por Bangladesh, Vietnã, Filipinas, Brasil, Tailândia, Colômbia e Uganda2. Espera-se que a produção de tilápia global será cerca de 7,3 MT por 20303. Tilápia tornaram-se como uma fonte de alimento global importante não apenas porque eles são uma fonte barata de proteínas4 mas também porque eles são fáceis de procriar em capacidade sob uma ampla gama de água e clima condições5,6. Apenas há algumas décadas, acreditava-se que existiam poucas doenças comercialmente significativas ameaçando o cultivo de tilápia, mas isto não é mais verdade. Uma doença emergente viral chamada doença de vírus de Lago de tilápia (TiLVD) é a primeira epidemia de doença crítica já encontrados em tilápia e toda a indústria está em risco. Esta doença tem graves consequências sócio-económicas e é uma ameaça directa para a segurança alimentar milhões de pessoas na África7, Ásia e América do Sul. No início de 2018, a Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) relatou que o agente etiológico da doença, TiLV, tinha sido detectado oficialmente em três continentes, cobrindo oito países8 e desde que este cartão de informação do patógeno foi atualizado lá foram mais de TiLV, na Tanzânia, Uganda9, Indonésia10, Formosa11 e Peru12. TiLV é um novo single-stranded RNA vírus descrito para ser um orthomyxo-como vírus porque ele contém uma variedade de características, uma reminiscência de outros orthomyoxoviruses como a gripe ou infecciosa anemia salmão vírus (ISAV)13. Ele foi identificado no rescaldo da enorme perda de caça selvagem e tilápia no lago da Galileia, Israel14. Depois disso, surtos de doenças semelhantes conhecido como mortalidade de verão e o mês síndrome de mortalidade associado com infecção TiLV foram relatados em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) no Egito15 e Nilo e tilápia híbrida vermelho (Oreochromis spp.) na Tailândia16, respectivamente. Detecção de vírus de animais aquáticos é historicamente realizada pelo crescimento e isolamento de vírus em cultura de células. Várias linhas de células foram testadas para a propagação e isolamento de TiLV incluindo, E-11 células derivadas de cabeça de cobra de17,de peixe (Ophiocephalus striatus)18, OmB e TmB provenientes Oreochromis mossambicus18e OnlB e OnlL, proveniente de Nile tilapia (o. niloticus)19. Enquanto cultura de vírus tem a vantagem que fornece material para novas experiências, mas tem a desvantagem que requer pelo menos 4-7 dias para observar a formação de efeitos citopático (CPE) e crucialmente, diferentes vírus piscine, que são o mais apto para replicar podem ser propagadas e produzir CPE semelhante.
Nas últimas décadas, tem havido um movimento longe de métodos de diagnóstico tradicionais, muitas vezes demorados como cultura celular, sorologia e deteção do antígeno e substituição do ácido nucleico mais rápido e mais sensível à base de testes de deteção20, 21. Isso é evidente pelo fato de que muitos qPCR ensaios foram desenvolvidos como métodos de diagnóstico importantes para uma infinidade de doenças virais dos animais aquáticos, tais como para ISAV22,23, vírus septicemia hemorrágica viral (VHS)24 ,25, betanodavirus26,27 alphavirus salmonídeos28, peixe iridovirus29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30e Lymphocystis doença vírus (LCDV)31 . Métodos robustos para diagnóstico e patógeno vigilância são urgentemente necessários para reduzir a propagação da TiLV. Tais métodos devem permitir a detecção precoce da infecção antes de desenvolvem sinais clínicos e detecção de vírus baixas cargas. Até à data, diferentes protocolos PCR incluindo RT-PCR14,,32, de RT-PCR aninhado18, semi aninhados de RT-PCR33e RT-qPCR32,34 foram desenvolvidos para a detecção de TiLV em tecidos de peixes. Uma comparação de isolamento de vírus e RT-qPCR em linhas de células sensíveis para a deteção de TiLV revelou que RT-qPCR era 1.000 vezes mais sensível do que o isolamento de vírus32. Embora cada protocolo PCR publicado tem relatado diferentes sensibilidades para a detecção de TiLV, a maioria dos ensaios são altamente sensíveis com os limites de detecção de cópias virais em 7,5 cópias33, 7 cópias18 ou 2 cópias32 por reação.
O objetivo deste artigo de métodos é para explicar, em detalhes, como realizar ensaios de deteção de TiLV, começando com a coleção de tecido de tilápia, para extração de RNA total, síntese do cDNA e então TiLV PCR específico com base em ensaios. Especificamente, protocolos abrangentes de RT-PCR convencional e também SYBR baseada em verde RT-qPCR têm sido descritos a apelar a uma vasta gama de cientistas com o objetivo de detectar TiLV. O primeiro é menos sensível, mas geralmente é uma opção mais barata de deteção. Este último requer uma infra-estrutura mais elaborada como uma máquina PCR quantitativa e os reagentes mais caros, mas tem as vantagens de ser quantitativa, rápido e altamente sensível, significando que ele pode ser usado para a detecção de TiLV em sub clinicamente Peixes infectados. O RT-PCR e RT-qPCR protocolos foram realizados em dois laboratórios diferentes com isolados geográficos distintos de TiLV e os resultados incluídos destaque a sensibilidade e a reprodutibilidade dos ensaios descritos aqui.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>An alternative to clove oil.&#160; 
			Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilization solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160; AM7020</td>
			<td>For storing tissues if they cannot be processed immediately 
			Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIreagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENEzol</td>
			<td>Geneaid</td>
			<td>GZR100</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisure</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38032</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homemade solution</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 
			30.45 g/L&#160; (400 mM) ammonium thiocyanate 
			8.20 g/L&#160; (100 mM) sodium acetate 
			380 mL/L&#160; (38 % v/v) phenol 
			50 mL/L (5 % v/v) glycerol 
			1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 
			Store up to 2 years at 4oC 
			Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Green Beads</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358941001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL Tube</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116913050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>RCI Labscan</td>
			<td>AR1027E-G2.5L</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9673</td>
			<td>A less toxic alternative to chloroform 
			Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (GC) &#8805; 99.8 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59300</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.09634.2500</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)</td>
			<td>R0551</td>
			<td>Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (purity (GC) &#8805; 99.9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (EMD Millipore)</td>
			<td>1.00983</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck (EMSURE)</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion TURBO DNA-free kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Can be performed at the end of the RNA extraction protocol 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viva cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>cDSK01</td>
			<td>Step 4.1 &#38; 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>A1172K</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Kit</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600107</td>
			<td>An alternative option&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase systems:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>14001012a</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - GoTaq Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separate PCR mixture components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP Mix</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NP2409</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Taq Buffer with KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00348114</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PL1202</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AB1454</td>
			<td>One step RT-PCR exemplified in Figure 3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide solution (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Tris</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PR0612-1KG</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.00063.2500</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0729</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0701-100G</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladders and markers</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NL1405</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel loading dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUP SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>A25779</td>
			<td>Exemplified in Figures4-6B 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1725120</td>
			<td>Exemplified in the video and in Figures 4-6A 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358976001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G Homogenizer</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116005500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Protocol 2 
			Step&#160;2.4, 2.7 &#38; 2.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5418R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>AccuBlock Digital Dry Bath</td>
			<td>Protocol 2 
			Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Protocol 3 
			Step 3.1 - 3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>LSE 6766</td>
			<td>Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 &#38; 6 
			Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>LioFuge</td>
			<td>LM-60</td>
			<td>Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0</td>
			<td rowspan="2">Protocol 6 
			Step 6.6-6.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Pipette-Lite XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol-barrier pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z333328, Z333336, Z333344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr

O objetivo desse método é facilitar a detecção rápida, sensível e específica de tilápia Lago vírus (TiLV) em tecidos de tilápia. Este protocolo pode ser usado como parte de programas de vigilância, medidas de biossegurança e nos laboratórios de pesquisa básica de TiLV. O padrão-ouro de diagnóstico de vírus normalmente envolve o isolamento do vírus seguido por técnicas complementares tais como a reação em cadeia do polymerase transcrição reversa (RT-PCR) para posterior verificação. Isso pode ser complicado, demorado e exige tipicamente pesadamente infectadas com vírus de amostras de tecido. O uso de RT-quantitativa (q) PCR na detecção de vírus é vantajoso devido à sua natureza quantitativa, alta sensibilidade, especificidade, escalabilidade e seu rápido tempo de resultar. Aqui, todo o método de PCR com base em abordagens para TiLV detecção é descrita, tilápia órgão corte, total ácido ribonucleico (RNA) extração usando uma solução de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidium, quantificação de RNA, seguido por uma PCR em dois passos protocolo que impliquem, síntese de ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) e detecção de TiLV por PCR convencional ou identificação quantitativa através de qPCR usando SYBR green tingir. PCR convencional requer etapas pós-PCR e simplesmente informará sobre a presença do vírus. A última abordagem vai permitir a quantificação absoluta de TiLV para tão pouco como 2 cópias e, portanto, é extremamente útil para o diagnóstico de TiLV em casos subclínicos. Uma descrição detalhada das duas abordagens PCR, resultados representativos de dois laboratórios e uma discussão detalhada dos parâmetros críticos de ambos foram incluídos para assegurar que pesquisadores e médicos encontram o seu mais adequado e aplicável método de deteção de TiLV.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR at JoVE.com

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Deteção de tilápia Lago vírus usando convencional RT-PCR e SYBR Green RT-qPCR

Este protocolo diagnostica vírus de Lago de tilápia (TiLV) em tecidos de tilápia, utilizando metodologias de RT-PCR. Todo o método é descrito de dissecção de tecidos para extração de RNA total, seguida pela síntese do cDNA e detecção de TiLV por PCR convencional ou PCR quantitativo usando dsDNA vinculando um corante fluorescente de vinculação.

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Bem-vindos a todos. Meu nome é Win Surachetpong. Sou professor assistente em Microbiologia Veterinária e Faculdade de Imunologia de Medicina Veterinária na Universidade kasetstart, Tailândia.Eu e minha equipe estamos especializados em doenças virais emergentes na tilápia. Estamos trabalhando agora no vírus do lago da tilápia que causam alta mortalidade na tilápia. Como a tilápia é a segunda espécie de peixe mais importante que é a cultura em todo o mundo, ela fornece fonte de proteína para um milhão de pessoas e desempenha papel importante para a segurança alimentar.Assim, o recente surto do vírus do lago de tilápia causa impacto socioeconômico que levou muitos cientistas a tentar encontrar uma solução para este problema. Até agora precisamos de um método muito sensível, rápido e preciso para detectar o vírus. Neste vídeo, mostraremos passo a passo para detectar o vírus do lago de tilápia no tecido de peixes a partir da coleta de amostras, população de amostras e análise de PCR em tempo real.Primeiro, solubilize a overdose de óleo de pano na água para eutanásia do peixe. Coloque o peixe morto em uma bandeja, esterilize o equipamento usando 95% de etanol e depois queime com um queimador de álcool. Corte lentamente o peixe do abdômen inferior para cima, para coletar o fígado.Colete parte do fígado em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. A primeira parte da extração de RNA deve ser realizada em um Capô de Fluxo Laminar, e usar equipamento de proteção. Adicione um mililitro de reagente de extração de RNA no tubo.Pulverize o fígado usando um pilão de tecido em homogêneo. Adicione 200 microliters de clorofórmio no tubo. Em seguida, misture suavemente invertendo o tubo várias vezes.Reserve por três minutos em temperatura ambiente. Centrífuga a 4 graus celsius a 12.000 RCF por 15 minutos. Colecione cuidadosamente os tubos da centrífuga.Transfira suavemente 500 microliters da fase aquosa superior incolor em um novo tubo. Adicione um volume de isopropanol no tubo. Aqueça a menos 20 graus celsius por duas horas ou até a noite para precipitar o RNA.Após a incubação, centrifufique a solução na mesma condição de centrífuga. Recolhe os tubos da centrífuga e, em seguida, descarte o supernatante. A pelota de RNA pode ser vista como apontada pela seta.Adicione um mililitro de 75% de etanol no tubo para lavar a pelota de RNA e inverta várias vezes. Centrífuga a 4 graus celsius, a 10.000 RCF por 15 minutos. Recolhe os tubos da centrífuga e, em seguida, descarte o supernatante.Desenhe o etanol que sobra usando a tubulação automática e o ar seco à temperatura ambiente por cinco a 10 minutos. Adicione 30 a 60 microliters RNase água livre, pré-aquecida a 55 a 60 graus celsius para solubilizar a pelota de RNA. Use de um a dois microliters de solução RNA para medir a concentração usando um espectrômetro de micro volume.Os resultados aparecerão na tela. Diluir a concentração para 200 nanogramas por microliter usando água livre RNase. Realize a síntese de CDNA utilizando os produtos químicos e condições listados da seguinte forma.Use um termociclador para converter RNA em cDNA com condições sugeridas. A seguir estão os produtos químicos e condições utilizados para determinar a carga TiLV usando PCR em tempo real. Dispense seis mililitros da mistura mestre qPCR em cada frasco de tubo branco de tira qPCR.Posteriormente, quatro mililitros de amostra de CDNA são carregados no poço. Nesta fase, uma nova ponta de tubulação deve ser trocada em cada poço, para evitar contaminação de amostra para amostra. Sele firmemente a tira qPCR com uma tampa de tira qPCR transparente.Misture suavemente a solução apertando uma ponta da tira. Em seguida, gire para baixo usando micro centrífuga para coletar todo o líquido na parte inferior dos vasos. Use a condição de dois passos como mostrado no vídeo, selecione o poço em placa de 96 poços que você vai usar.Selecione o verde cibernético como a flora para corante. Selecione desconhecido como o tipo de amostra e insira um nome em uma caixa de nome de amostra. Abra a tampa de uma máquina PCR em tempo real e coloque a tira qPCR no poço atribuído.Em seguida, feche a tampa. Execute a máquina com a condição selecionada. A máquina iniciará e funcionará depois que a tampa atingir a temperatura desejada.Após o término das condições qPCR, a curva de amplificação é mostrada. Aqui, a seta de taxa aponta onde o nível limiar corta entre a fase exponencial e a fase linear que resulta em valor de TC. O valor da TC é então extrapolado em número de cópia de registro de vírus para calcular um número de vírus permanece usando a curva padrão.O pico de fusão também é exibido para identificar se o vírus detectado pelo qPCR é, de fato, TiLV no qual os picos de derretimento geralmente variam entre 79,5 e 80,5 graus celsius. Por isso, esperamos que este método seja uma ferramenta importante para os agricultores e a organização em todo o mundo, que podem exigir a implementação de um controle e limitar a propagação da infecção por TiLV.

Research

JoVE Journal

Environment

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout (Salvelinus namaycush) from Its Prey

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout Salvelinus namaycush from Its Prey

Estimativa Laboratório de Líquido tróficas eficiências de transferência de PCB para Lake Trout (<em&gt; Salvelinus namaycush</em&gt;) De sua rapina

A technique for laboratory estimation of net trophic transfer efficiency (&#947;) of polychlorinated biphenyl (PCB) congeners to piscivorous fish from ...

Ambiente

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

Determinados pelo Laboratório Fósforo Flux do Lago Sedimentos como medida de Fósforo Interno Carregando

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água pela cultura e RT-qPCR. I. Recolha de amostras de vírus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

EPA Método 1615. A medição do Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. II. De ensaio total de Vírus cultiváveis

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Medição e mapeamento de padrões de erosão e deposição relacionadas às concentrações de carbonato de solo sob gestão agrícola

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Coleta e extração de ar ocupacional amostras para análise de DNA fúngico

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

Deteção Molecular no local de Phytopathogens solo-carregadas usando um sistema portátil de PCR em tempo real

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Específicos e detecção precisa do Using PCR convencional em amostras de tecido de folhas cítricas cítricas Greening patógeno Candidatus liberibacter spp.

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...