Name: detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr
Uploaded: 2018-11-10T12:30:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR at JoVE.com

Мы благодарны института ветеринарной бактериология, Vetsuisse факультет, Университет Берн за их поддержку. Эта работа финансировалась Комитета для поощрения из ранней карьеры ученых и гендерного равенства на Vetsuisse факультете, Университет Берн 120% модель финансирования присуждена PN. WS и PR поддерживаются центр перспективных исследований для сельского хозяйства и продовольствия, Институт продвинутых исследований, Университет Касетсарт, Бангкок, Таиланд под высшего образования поощрения исследований и национальных исследований университета проект Таиланда, офис Высшее образование Комиссии, министерства образования, Таиланд. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Kwanrawee Sirikanchana для своего повествования и Piyawatchara Sikarin для редактирования видео.

Авторы не имеют ничего сообщать.

TiLV впервые сообщалось в 2014 году в Израиле14 и с тех пор, она была обнаружена в нескольких странах, включая Египет, Колумбия, Индия, Малайзия, Уганда, Танзания и Таиланд15,16,18, 35 , 48. глобальной осведомленности, в частности, в тилапии, производства стран уделяет больше внимания на вирус и различные ограничения и меры контроля со стороны государственных органов были выполнены пытается предотвратить распространение TiLV. Здесь было объяснено подробный протокол для обнаружения TiLV в тилапии ткани, охватывающих проб, РНК изоляции, cDNA синтеза, ПЦР и ПЦР-анализов. Существуют различные аспекты этих методов, которые требуют конкретного обсуждения. TiLV была обнаружена в рыбе, охватывающих различные размеры9,12,14,15,49 и виды тиляпии до настоящего времени, включая выращиваемых гибридные тилапии (O. niloticus x O. aureus)11,14, Нил тилапии (O. niloticus)9,10,14,,1516, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 и красный тилапии (Oreochromis sp.)16,33,48,51, как хорошо как дикие Нила тилапии9,12, черный тилапии51, zilli т.14,15, S. galilaeus, O. стафилококка и т. Симонис Интермедиа14 и совсем недавно TiLV была выявлена в сазана (Barbonymus schwanenfeldii)52. Образцы ткани из внутренних органов (Гилл, селезенка, печень, сердце, голову почек) или слизь37 можно собранные как здоровых, так и умирающий тилапии независимо от возраста, размера или вида и обрабатываются для изоляции РНК. Общая РНК добыча протокол изложенные здесь использует монофазные раствор фенола и Гуанидиновые тиоцианат, который является агентом денатурируя chaotropic. Ткани непосредственно гомогенизации в этом решении, с последующим добавлением хлороформе и центрифугирования для достижения разделения этап которой генерируется ясно РНК, содержащие верхние водной фазе, интерфаза и Нижняя органические фазы. РНК изолирован от водной фазе высыпанием изопропиловый спирт, после мытья восстановленные РНК избавиться от загрязнений. Изоляция РНК по этой методологии было pioneered Петр Chomczynski и Николетта Sacchi и был передан как Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ извлечения53,54. Этот тип реагент, который используется для извлечения РНК может быть коммерчески приобрели или в лаборатории (см. Таблицу материалов для получения дополнительной информации). Этот протокол занимает немного больше времени, чем методы, основанные на столбце, например очистки на основе силики, но в целом, он является более экономически эффективным и дает более РНК.
В этом протоколе, количественного определения РНК с помощью значения A260 шла whereby спектрофотометрии значения могут указывать на качество РНК (A260/A280 = 1,9-2.1). Хотя этот метод даст хорошее представление о образец чистоты, он не может абсолютно сообщить о качестве извлеченного РНК. Правильно определить, является ли РНК нетронутыми или частично деградировавших, образцы могут быть разделение электрофорезом геля агарозы которой размытие бромистый этидий окрашенных 18S и 28S рРНК полосы указывают РНК деградации. Дальнейшей проверки качества РНК могут включать в себя с помощью инструмента лаборатории на чипе. Кроме того, это также важно усвоить очищенный РНК с DNase I для удаления загрязнения принимающей геномной ДНК, который в зависимости от нисходящие приложения может привести к ложным результатам. Если хост геномная ДНК еще загрязнять образца РНК в значительной степени, дополнительное лечение DNaseI может также выполняться в конце процедуры извлечения РНК (см. Таблицу материалы).
Дополнительные синтеза ДНК может сильно повлиять на общие результаты ПЦР и является аспектом метода, который могут внести изменения. Протокол cDNA, выступает здесь состоит из одного компонента установки с помощью oligo (dT) и таким образом только транскрибирует мРНК, содержащие поля хвосты. Это позволяет точно какие компоненты для использования в реакции обратной транскрипции и этот режим cDNA синтез оказался успешным для обнаружения TiLV32пользовательский элемент управления. Альтернативой этой настройки является коммерчески купил Мастер микс содержащие все компоненты, необходимые для обратной транскрипции реакции и очень быстро и просто без обычных многоступенчатый, дозирования и температурными протокол. Это выгодно, потому что он сводит к минимуму обработку и способствует единообразия во всех образцах. Такие мастер смеси часто включают в себя как oligo(dT), так и случайных праймеров, что делает его применимым к различным РНК шаблоны и создания представительного cDNA копии последовательностей из всей длине РНК в популяции (вирусных и тилапии принимающей мРНК) и в теории, Затем каждый желаемый вид РНК может быть измерен обычных ПЦР или ПЦР из такого образца. Эта универсальность является главным преимуществом 2-шаг ПЦР подхода; Она обеспечивает долгосрочный бассейн, который может использоваться для многих различных экспериментов. В результаты, был представлен подход RT-PCR одношаговый которой последовательности конкретных грунтовки (Таблица 1) были использованы и RT и PCR были выполнены в одной трубе (см. список материалов). В общем последовательность конкретных грунтовки позволяют для более высокой эффективности RT конкретные цели РНК, чем использование случайных грунтовки, но конкретных целевых РНК является единственной, которая может быть определена количественно в такой образец cDNA, которая может быть единственной целью некоторых лабораторий (см. Таблица материалов для синтеза cDNA продукта предложения).
В то время как обычные RT-PCR, как представляется, широко используется так далеко в TiLV диагноз9,13,14,,1516,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-ПЦР было показано, чтобы быть более мощным инструментом для выявления и количественной оценки небольших количеств TiLV в тканях рыбы или слизь32,37. В общем ПЦР широко используется в клинической вирусологии диагностических лабораторий из-за его высокую чувствительность, специфичность, хорошая воспроизводимость, широкий динамический диапазон и скорость21. Хотя ПЦР могут быть изначально дороже, реализовать, чем обычные RT-PCR, он предлагает много важных преимуществ над обычными ПЦР; Он имеет быстрый оборот вокруг времени из образца результатов и не требует каких-либо шагов пост ПЦР. Этот последний момент означает, что существует минимальный риск для лабораторных загрязнения, и она может быть легко адаптирована к высок объём ситуаций таких, как в случае вспышки. Кроме того это по сути более чувствителен, чем обычные RT-PCR, который имеет жизненно важное значение для выявления низкой вирусной нагрузкой в субклинический инфекции21. Это потребует вложенных ПЦР подход, требующий обратной транскрипции, два дальнейших реакциях PCR и затем анализ агарозы электрофорез геля. Эти многие шаги занять много времени и увеличить шансы на ошибки или загрязнения. Тем не менее из-за его высокой чувствительности, RT-ПЦР требует тщательной экспериментальной разработки и глубокого понимания методов количественной оценки для генерации точных результатов56,57.
Привязки Флюорофор ДНК, SYBR Грин я продемонстрировал в этом протоколе. Это dsDNA неспецифических ДНК связывание красителя, и таким образом специфика assay полностью лежит в наборе грунты, которые может создавать ложных срабатываний58. Таким образом, в то время как dsDNA плавления выполняется в конце каждого ПЦР анализа кривой является особенно важной частью реакции PCR, потому, что он подтверждает, что только один Ампликон ПЦР правильную тм производится (это должно также достигаться путем гель электрофорез, когда реализуются новые анализы). Tm фрагмента ДНК зависит целый ряд функций, таких как его длина, GC композиция, последовательности, взаимодополняемости прядь, а также концентрация буфера компонентов и ПЦР усилители. Плавления анализ кривой в представитель результаты от двух лабораторий не выявили присутствия Димеры праймера или других нежелательных продуктов ПЦР, но если это наблюдается с другими образцами и/или экспериментальных установок, то проба должна быть повторно оптимизирован. Более продвинутые технологии ПЦР не требуют такого шага плавления кривой и действительно, поскольку этот документ был написан, методы TaqMan на основе TiLV RT-ПЦР была разработана использования двух праймеров и зонда, что делает его весьма конкретных TiLV34.
Несомненно грунты, предназначенные для RT-ПЦР-анализов имеют основополагающее значение для успеха пробирного и грунты здесь были разработаны основанные на общедоступных геномных данных TiLV на время32. Однако РНК-вирусов хорошо известны высокой мутации темпы и возможных штаммов будет избежать текущих диагностические тесты, как было отмечено для ISAV59. Он всегда будет трудно для таких типов вируса для создания универсальной Пан TiLV RT-ПЦР анализа и такие анализы будут только постоянно совершенствоваться если больше TiLV геномных данных из далеко идущих мест и периодов времени.
Наконец крайне важно для выполнения повторяющихся или если возможно, тройные реакции в обоих intra и Интер анализы ПЦР. Если значенияt C очень высоки, то использование реплицирует это особенно важно, чтобы удостовериться, что реакция PCR надежных и воспроизводимых. В общем если реплицировать данные от реакции зависит от более чем 0,5 циклов, реакции следует повторить и если Ct последовательно значения > 0,5 циклов в реплицирует, assay должны быть оптимизированы, повторно. Использование интегрированных ПЦР дозирования робота помогает больш с этим вопросом, но это роскошь инструмент. Как с любой эксперимент, включение адекватные и соответствующие элементы управления имеют первостепенное значение для развития надежных молекулярные анализы, особенно в диагностических лабораториях, где такие анализы должны быть аккредитованы. Элементы управления должны включать позитивные (положительное TiLV образца, плазмида TiLV стандарт) и негативный контроль (NTC и -RT) образцы, а также обнаружения эндогенного тилапии уборки генов. Такие элементы управления нельзя недооценивать и должны быть включены в калибровочных правильно понять качество каждого шага анализа и правильно интерпретировать результаты.

Поставка рыбы глобальной душу достиг новой записи 20 кг в 2014 году, и это было вследствие энергичного роста в аквакультуре. Аквакультура остается одним из наиболее быстро растущих животных продуктов питания производство секторов во всем мире и является сектор только животных производства продовольствия, которое растет быстрее, чем население1. Tilapiine cichilds составляют второй наиболее важный пресноводная рыба, выращиваемых во всем мире с общего глобального производства 6,4 миллиона тонн (МТ) и предполагаемое значение 9,8 млрд долларов США в 2015 году2. Топ 10 производителей тиляпии являются Китай (1,78 MT), Индонезия (1.12 MT) и Египет (0,88 MT), а затем2Бангладеш, Вьетнама, Филиппин, Бразилии, Таиланда, Колумбии и Уганды. Ожидается, что глобальная тилапии производство будет около 7,3 MT 20303. Тилапии стали таким важным глобальным источником пищи, не только потому, что они являются недорогой источник белка4 , но и потому, что они легко размножаются в емкость под широкий спектр водных и климатических условий5,6. Всего лишь несколько десятилетий назад, считалось, что там было несколько коммерчески значимых заболеваний угрожает тилапии земледелия, но это больше не так. Новые вирусная болезнь под названием тилапии озеро вирусных заболеваний (TiLVD) — первый когда-либо критического заболевания эпидемии в тилапии и вся промышленность находится в опасности. Эта болезнь имеет серьезные социально экономические последствия и представляет собой прямую угрозу для продовольственной безопасности для миллионов людей в Африке7, Азии и Южной Америке. В начале 2018 Всемирной организации по здоровью животных (МББЭ) сообщил, что этиологический агент этого заболевания, TiLV, было официально выявлено на трех континентах, охватывающий восемь стран8 , и поскольку этот возбудитель информационная карточка Обновление там были больше сообщения о TiLV в Танзании, Уганда9, Индонезия10, Тайвань11 и Перу12. TiLV — Роман одноцепочечной РНК вирус описанных быть orthomyxo как вирус, потому что он содержит целый ряд характеристик напоминают другие orthomyoxoviruses, таких как грипп или инфекционный лосося анемии вирус (ISAV)13. Она была впервые выявлена в результате массовые потери диких и выращиваемых тилапии в озеро Кинерет, Израиль14. Впоследствии аналогичные вспышки заболеваний, упоминаемые как летняя смертность и один месяц, синдром смертности, связанные с TiLV инфекцией сообщалось в Нил тилапии (Oreochromis niloticus) в Египте15 и Нила и красных гибридных тилапии (Oreochromis sрр.) в Таиланде16соответственно. Исторически обнаружение водных животных вирусов осуществляется роста и изоляции вируса в культуре клеток. Были протестированы различные клеточные линии для распространения и изоляции TiLV, в том числе, E-11 клетки, полученные из змееголов рыб (Ophiocephalus striatus)17,18, OmB и ТМБ возникая от Oreochromis mossambicus18и OnlB и OnlL, возникая от Нила тилапии (O. niloticus)19. В то время как вирус культура имеет то преимущество, что она предоставляет материал для дальнейших экспериментов, он имеет тот недостаток, что он требует по крайней мере 4-7 дней, чтобы наблюдать за формирование цитопатического воздействия (CPE) и критически, piscine различные вирусы, которые больше подходят для Репликация может быть унаследован и производить аналогичные CPE.
В последние несколько десятилетий наблюдается отход от традиционных, зачастую много времени методы диагностики как культуру клеток, серологии и обнаружения антигена и замена с быстрее и более чувствительных нуклеиновой кислоты на основе обнаружения испытаний20, 21. Это становится очевидным тот факт, что многие анализы ПЦР были разработаны как важные диагностические методы для множества вирусных заболеваний водных животных, таких как для ISAV22,23, вирусная геморрагическая септицемия вирус (VHSV)24 25 ,, betanodavirus,2627 лососевых альфавирус28, рыбы iridovirus29, Anguillid герпеса 1 (AngHV1)30и Lymphocystis болезни вирус (НКУ)31 . Надежные методы для диагностики и возбудителя наблюдения необходимы для уменьшения распространения TiLV. Такие методы должны позволить раннего обнаружения инфекции, прежде чем разработать клинические признаки и низкой вирусной нагрузки. На сегодняшний день, различные протоколы PCR, включая ПЦР-14,32, вложенные ПЦР-18, полу вложенных ПЦР-33и RT-ПЦР32,34 были разработаны для обнаружения TiLV в тканях рыбы. Сравнение RT-ПЦР и вирус изоляции в восприимчивых клеточных линий для обнаружения TiLV показало, что RT-ПЦР 1000 раз чувствительнее, чем вирус изоляции32. Хотя каждый опубликованный протокол PCR разные чувствительности для обнаружения TiLV, большинство анализов являются весьма чувствительными с пределов обнаружения вирусных копий на 7,5 копии33, 7 копий18 или 2 копии32 в реакция.
Цель этой статьи методов является объяснить в деталях, как для выполнения анализов обнаружения TiLV, начиная с тилапия ткани коллекции, чтобы общее извлечение RNA, синтез cDNA и затем TiLV конкретного ПЦР на основе анализов. В частности всеобъемлющей протоколы обычных RT-PCR и SYBR на основе зеленого RT-ПЦР были описаны призыв к широкому спектру ученых стремится обнаружить TiLV. Первая менее чувствителен, но обычно является более дешевый вариант обнаружения. Последнее требует более сложной инфраструктуры, например Количественная ПЦР машины и дороже реагенты, но она имеет преимущества количественных, быстро и чувствительный, означает, что он может использоваться для обнаружения TiLV в суб-клинически зараженной рыбы. RT-PCR и RT-ПЦР протоколы были исполнены в двух разных лабораториях с различных географических изолятов TiLV и включенные результаты выделения чувствительность и воспроизводимости анализов, описанных здесь.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>An alternative to clove oil.&#160; 
			Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater stabilization solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160; AM7020</td>
			<td>For storing tissues if they cannot be processed immediately 
			Step 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIreagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENEzol</td>
			<td>Geneaid</td>
			<td>GZR100</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisure</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38032</td>
			<td>Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homemade solution</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 
			30.45 g/L&#160; (400 mM) ammonium thiocyanate 
			8.20 g/L&#160; (100 mM) sodium acetate 
			380 mL/L&#160; (38 % v/v) phenol 
			50 mL/L (5 % v/v) glycerol 
			1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 
			Store up to 2 years at 4oC 
			Step 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Green Beads</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358941001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL Tube</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116913050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>RCI Labscan</td>
			<td>AR1027E-G2.5L</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9673</td>
			<td>A less toxic alternative to chloroform 
			Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (GC) &#8805; 99.8 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59300</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.09634.2500</td>
			<td>Step 2.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)</td>
			<td>R0551</td>
			<td>Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (purity (GC) &#8805; 99.9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich (EMD Millipore)</td>
			<td>1.00983</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck (EMSURE)</td>
			<td>1.00983.2500</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td>Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion TURBO DNA-free kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Can be performed at the end of the RNA extraction protocol 
			optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viva cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>cDSK01</td>
			<td>Step 4.1 &#38; 4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>A1172K</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Kit</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>An alternative option&#160; 
			see discussion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600107</td>
			<td>An alternative option&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase systems:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>14001012a</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - GoTaq Mastermix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separate PCR mixture components:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP Mix</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NP2409</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mM MgCl2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0971</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Taq Buffer with KCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00348114</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PL1202</td>
			<td>Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AB1454</td>
			<td>One step RT-PCR exemplified in Figure 3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide solution (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Tris</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PR0612-1KG</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur)</td>
			<td>Merck KGaA (EMSURE)</td>
			<td>1.00063.2500</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; - Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0729</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PC0701-100G</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladders and markers</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>NL1405</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel loading dye (6X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUP SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>A25779</td>
			<td>Exemplified in Figures4-6B 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1725120</td>
			<td>Exemplified in the video and in Figures 4-6A 
			Step 6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNA Lyser Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3358976001</td>
			<td rowspan="2">An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above 
			Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G Homogenizer</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>116005500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Protocol 2 
			Step&#160;2.4, 2.7 &#38; 2.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 5418R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat box</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>AccuBlock Digital Dry Bath</td>
			<td>Protocol 2 
			Step 2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Protocol 3 
			Step 3.1 - 3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu</td>
			<td>Protocol 5 
			Step 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>LSE 6766</td>
			<td>Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 &#38; 6 
			Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>LioFuge</td>
			<td>LM-60</td>
			<td>Step 6.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0</td>
			<td rowspan="2">Protocol 6 
			Step 6.6-6.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine and software</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1-1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Pipette-Lite XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol-barrier pipette tips</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z333328, Z333336, Z333344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of tilapia lake virus using conventional rt-pcr and sybr green rt-qpcr

Цель этого метода заключается в содействии быстрый, чувствительной и конкретных обнаружения вируса тилапии озеро (TiLV) в тканях тилапии. Этот протокол может использоваться в рамках программ наблюдения, мер по обеспечению биозащищенности и в TiLV основных исследовательских лабораториях. Золотым стандартом диагностики вируса обычно включает изоляции вируса, следуют дополнительные методы, такие как обратное транскрипция полимеразной цепной реакции (ПЦР) для дальнейшей проверки. Это может быть громоздким, времени и обычно требует образцов тканей, сильно заражены вирусом. Из-за его количественный характер, высокая чувствительность, специфичность, масштабируемость и его быстрое время, чтобы привести выгодно использование количественного RT-PCR (q) для обнаружения вирусов. Здесь весь метод ПЦР на основе подходов для обнаружения описано, от тилапии орган резания, Общая рибонуклеиновой кислоты (РНК) добычи с помощью guanidium тиоцианат фенол хлороформ раствор, количественного определения РНК, следуют ПЦР двухэтапный TiLV влекущие за собой протокол, синтез взаимодополняющих дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) и обнаружения TiLV обычных ПЦР или количественных идентификации через ПЦР с помощью SYBR зеленый я красителя. Обычные PCR требует шагов пост ПЦР и будет просто сообщить о присутствии вируса. Последний подход позволит абсолютной количественной оценки TiLV вниз как 2 копии и таким образом является исключительно полезным для диагностики TiLV в югу клинических случаях. Подробное описание двух подходов PCR, представитель результаты из двух лабораторий и тщательное обсуждение критических параметров обоих были включены обеспечить, что исследователи и диагносты найти их наиболее подходящим и применимым метод обнаружения TiLV.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR at JoVE.com

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Обнаружение тилапии озеро вирус с помощью обычных RT-PCR и SYBR зеленый RT-ПЦР

Этот протокол диагнозов тилапии озеро вирус (TiLV) в тканях тилапии с помощью ПЦР-методологии. Весь метод описан от рассечение тканей в общее извлечение RNA, следуют синтеза cDNA и обнаружения TiLV обычных ПЦР или количественного PCR используя dsDNA привязки краска люминесцентные привязки.

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Добро пожаловать все. Меня зовут Вин Сурачетпонг. Я доцент кафедры ветеринарной микробиологии и иммунологии ветеринарной медицины Университета Касетстарт, Таиланд.Я и моя команда специализируемся на новых вирусных заболеваний в тилапии. В настоящее время мы работаем над вирусом озера Тилапия, который вызывает высокую смертность в тилапии. Поскольку тилапия является вторым по величине видом рыб, который является культурой во всем мире, она обеспечивает источником белка для миллиона человек и играет важную роль в продовольственной безопасности.Так недавняя вспышка вируса озера Тилапия вызвать социально-экономические последствия, которые привели многих ученых, чтобы попытаться найти решение этой проблемы. Пока нам нужен очень чувствительный, быстрый и точный метод для обнаружения вируса. В этом видео, мы покажем вам шаг за шагом, чтобы обнаружить вирус озера тилапии в рыбьей ткани, начиная с сбора образцов, выборка населения, и в режиме реального времени ПЦР анализа.Во-первых, solubilize передозировки тканевого масла в воде, чтобы усыпить рыбу. Поместите мертвую рыбу на поднос, стерилизовать оборудование с использованием 95% этанола, а затем сожгли с алкогольной горелки. Медленно разрежьте рыбу из нижней части живота вверх, чтобы собрать печень.Соберите часть печени в 1,5 миллилитровую центрифугу. Первая часть извлечения РНК должна быть выполнена в Ламинарной капюшоне потока и носить защитное оборудование. Добавьте в трубку один миллилитр реагента извлечения РНК.Pulverize печени с помощью ткани пестик в однородной. Добавьте в трубку 200 микролитров хлороформа. Затем аккуратно перемешайте трубку несколько раз.Отложите на три минуты при комнатной температуре. Центрифуга при четырехградусах по Цельсию при 12 000 RCF в течение 15 минут. Аккуратно соберите трубки из центрифуги.Аккуратно перенесите 500 микролитров бесцветной верхней фазы в новую трубку. Добавьте один том изопропанола в трубку. Тепло при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение двух часов или до ночи, чтобы вызвать РНК.После инкубации центрифуга раствора в том же состоянии центрифуги. Соберите трубки из центрифуги, а затем отбросьте супернатант. Гранулы РНК можно увидеть, как указал на стрелку.Добавьте один миллилитр 75%этанола в трубку, чтобы вымыть гранулы РНК, и инвертировать несколько раз. Центрифуга при четырех градусах по Цельсию, при 10 000 RCF в течение 15 минут. Соберите трубки из центрифуги, а затем отбросьте супернатант.Нарисуйте оставшийся этанол с помощью автоматической трубы, и воздух сухой при комнатной температуре в течение пяти до 10 минут. Добавить от 30 до 60 микролитров RNase свободной воды, предварительно нагревается до 55 до 60 градусов по Цельсию, чтобы solubilize РНК гранулы. Используйте один-два микролитера РНК-раствора для измерения концентрации с помощью микрообнамеренного спектрофотометра.Результаты будут показаны на экране. Разбавить концентрацию до 200 нанограмм на микролитер с помощью свободной воды RNase. Выполните синтез кДНК с использованием химических веществ и условий, перечисленных следующим образом.Используйте термоциклер для преобразования РНК в cDNA с предлагаемыми условиями. Ниже приведены химические вещества и условия, используемые для определения нагрузки TiLV с использованием ПЦР в режиме реального времени. Разпределите шесть миллилитров мастер-микса qPCR в каждый флакон белой трубки полосы qPCR.Впоследствии в колодец загружаются четыре миллилитров образца кДНК. На этом этапе новый наконечник трубы должен быть изменен в каждой из них, чтобы избежать загрязнения от образца к образцу. Печать полосы qPCR плотно с прозрачной крышкой полосы qPCR.Аккуратно смешайте раствор, щелкивая на кончике полосы. Затем спина вниз с помощью микро центрифуги, чтобы собрать всю жидкость на дне сосудов. Используйте два шага условие, как показано на видео, выберите хорошо в 96 хорошо пластины, которые вы собираетесь использовать.Выберите кибер-зеленый, как флора для красителя. Выберите неизвестный тип образца и вставьте имя в поле имени образца. Откройте крышку машины PCR в режиме реального времени и поместите полосу qPCR в назначенный колодец.Затем закройте крышку. Запустите машину с выбранным условием. Машина запустится и запустится после того, как крышка достигла желаемой температуры.После окончания условий qPCR отображается кривая усиления. Здесь стрелка скорости указывает, где пороговый уровень отрезается между экспоненциальной фазой и линейной фазой, что приводит к значению КТ. Значение КТ затем экстраполируется на номер копирования вирусного журнала для расчета количества вирусов, останков с использованием стандартной кривой.Пик таяния также отображается для определения того, является ли вирус, обнаруженный qPCR, действительно, TiLV, в котором пики расплава обычно варьируются от 79,5 до 80,5 градусов по Цельсию. Поэтому мы надеемся, что этот метод будет важным инструментом для фермеров и организаций по всему миру, которые могут потребовать осуществления контроля и ограничения распространения инфекции TiLV.

Research

JoVE Journal

Environment

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout (Salvelinus namaycush) from Its Prey

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout Salvelinus namaycush from Its Prey

Лаборатория Оценка Net трофических Transfer КПД ПХБ в озерной форели (<em&gt; Salvelinus namaycush</em&gt;) От его добычи

A technique for laboratory estimation of net trophic transfer efficiency (&#947;) of polychlorinated biphenyl (PCB) congeners to piscivorous fish from ...

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

Лабораторно-определяется Фосфор поток от озерных отложениях в качестве меры внутреннего фосфора Загрузка

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 Измерение энтеровирус и Норовирус Происшествия в воде культуры и RT-КПЦР. I. Сбор образцов вирусов

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

EPA Метод 1615. Измерение энтеровирус и Норовирус встречаемости в воде культуры и РТ-КПЦР. II. Итого культивируемых Вирус Анализ

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Метод 1615 Измерение энтеровирус и Норовирус Происшествия в воде культуры и РТ-КПЦР. Часть III. Обнаружение Вирус РТ-КПЦР

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Измерение и сопоставление моделей осаждения, относящиеся к концентрации карбоната почвы под управление сельским хозяйством и эрозии почвы

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Сбор и извлечения образцов профессиональных воздуха для анализа ДНК, грибковых

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

На месте молекулярной обнаружение почвообитающих фитопатогенов, используя систему портативный ПЦР в реальном времени

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Конкретные и точного обнаружения цитрусовых озеленение возбудителя Candidatus liberibacter spp. Использование обычных ПЦР на цитрусовые образцы тканей листа

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...