Name: noninvasive, in-pen approach test for laboratory-housed pigs
Uploaded: 2019-06-05T12:30:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive, In-pen Approach Test for Laboratory-housed Pigs at JoVE.com

Gli autori desiderano riconoscere i finanziamenti dell'Office of Naval Research (Grant #12166253). Inoltre, gli autori ringraziano gentilmente il personale addetto alla cura degli animali, i veterinari e gli studenti della Kansas State University e della Virginia Tech per il loro sostegno durante il lavoro sugli animali. Gli autori desiderano anche ringraziare Nadège Krebs per la sua assistenza tecnica, e gli studenti Shelby Stair, Sarah Greenway e Mikayla Goering per la loro assistenza tecnica e la cura degli animali supplementare.

Il singolo IACUC in ogni sede (Kansas State University e Virginia Tech University) ha approvato l'uso di strutture e procedure.
1. Set-up delle telecamere e penne e la creazione di una routine
<ol><li>Prima di posizionare gli animali nelle loro penne, fissare le telecamere con un angolo di 90 gradi su ogni penna (vedere Tabella dei materiali per un sistema di telecamere suggerito).</li>
	<li>Registrare gli animali in modo continuo a 30 fotogrammi/s (fps), sia per la durata dello studio che solo durante le sessioni di test.</li>
	<li>Fissare ciotole, fattorini, stuoie e giocattoli con bulloni e catene.</li>
	<li>Posizionare macchine audio che riproduconocontinuamente rumore bianco o rosa (ad esempio, il suono delle cascate) nella struttura dei maiali. NOT:</</c2> I rumori improvvisi esterni (ad es. porte che si aprono e si chiudono) possono causare un riflesso di ribassazione durante le sessioni23,24.</li>
	<li>Randomizzare o stratificare i trattamenti con penna attraverso la struttura.</li>
	<li>
Istituire una routine di allevamento animale stabilito. Questo aiuterà i maiali a sapere quando aspettarsi che gli esseri umani puliscano le penne, le alimentino e le maneggiano ed eseguano il test.
	<ol>
<li>Usa un trattamento familiare per consentire ai maiali di associare gli esseri umani a una ricompensa.</li>
		<li>Utilizzare un clicker durante la ricompensa per consentire ai maiali di associare il suono del clic con una ricompensa. Non usare vocalizzazioni e segnali visivi per familiarizzare i maiali con la ricompensa (vedi Tabella deiMateriali).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Condurre le sessioni prima del pasto del mattino o prima di mettere un nuovo mangime per i suini alimentati ad libitum.</li>
</ol>2. Identificazione dei suini
<ol><li>Rendi i soggetti identificabili sul feed video, anche se sono monohouse.</li>
	<li>Assicurarsi che gli osservatori rimangano ciechi ai trattamenti e imparziali durante il timestamp con un sistema di marcatura non correlato ai trattamenti. Utilizzare un nastro di qualità medica (vedere Tabella deimateriali) aderito a una striscia di nastro adesivo di un colore specifico, forma rotonda e modello.</li>
	<li>Utilizzare una patch rotonda per contrassegnare la parte superiore del maiale e una verso il basso per ogni lato (vedere Figura 1, indicatori verdi e blu).</li>
	<li>Smear tag cemento (meno di 0,35 g) sugli angoli del nastro per contribuire ad aumentare la longevità di aderenza. NOT:</</c2> Troppo cemento etichetta non si asciugherà molto rapidamente, causando la caduta prematura del nastro.</li>
	<li>Risolvere i problemi e personalizzare la strategia di marcatura durante il periodo di acclimatazione in modo che i test ufficiali vengano eseguiti in modo efficiente e senza ulteriore stress ai suini.</li>
	<li>Utilizzare i fogli di raccolta dati per tenere traccia dei contrassegni e dell'identificazione del soggetto (vedere il file supplementare 1 per una scheda dati di esempio). NOT:</</c4> Per rimuovere il nastro, non strappare il nastro perché causerà dolore se i capelli vengono tirati fuori. Può o slough off da solo, un lubrificante a base d'acqua può aiutare a sloggiare, o può essere rasato con clipper. Se il nastro si spegne in momenti indesiderati, preparare il nastro di marcatura supplementare e riapplicarlo mentre il maiale sta mangiando un pasto piuttosto che trattenere il maiale.</li>
</ol>3. Sessioni HAT
<ol><li>Chiedi ai test-umani di indossare lo stesso cappello, coperture, stivali, odori, ecc. ogni volta che la sessione viene condotta.</li>
	<li>Condurre sessioni giornaliere, almeno 3x, prima del trattamento e, quindi, ogni giorno.</li>
	<li>Il maiale può trovarsi in qualsiasi area della penna prima di iniziare la sessione. Per avviare la sessione, chiedere all'uomo di prova di rilasciare il trattamento nella ciotola o davanti alla penna e fare clic sul clicker 3x.</li>
	<li>L'uomo di prova deve mettere le mani fuori dalla vista del maiale e stare fermo durante la prova. Chiedi a un altro ricercatore di contrassegnare l'inizio della sessione nella scheda dati e avviare un timer. Dopo 120 s, il ricercatore segnala silenziosamente al test-umano di passare al soggetto successivo e riavviare il test.</li>
</ol>4. Istituzione di etogrammi HAT per il software
<ol><li>Costruire ethogrammi (vedi Figure 1 e 2 e Supplementary Video 1) in un unico progetto utilizzando software specializzato. NOT:</</c3> I comportamenti spaziali sono la posizione dell'animale rispetto all'umano. Negli ethogrammi, le relazioni spaziali devono essere personalizzate sulla penna dell'animale e pubblicate ogni volta che viene utilizzato un nuovo set-up di penna (Figura 1). All'interno di questa categoria, i comportamenti sono considerati che si escludono a vicenda. Lo spazio è suddiviso in quattro aree, con diversi livelli di approccio (Figura 1). Le aree sono standardizzate tra i tipi di alloggiamento. Più vicino, o salire (Cl) significa che i maiali possono salire sulla recinzione per ottenere l'accesso all'umano; pertanto, l'arrampicata è considerata un comportamento spaziale che indica che il maiale è più attivamente alla ricerca del contatto umano. Vicino (Co) indica l'area entro 61 cm dall'essere umano. Mid (M) è l'area entro 61-122 cm dall'uomo. Lontano (F) è l'area di 123 cm o più dall'uomo.</li>
	<li>
I comportamenti strutturali si concentrano sull'orientamento dell'intero corpo o di parti del corpo (Figura 2). Creare due categorie strutturali: 1) la posizione del naso di maiale e 2) lo stato attivo del maiale. Utilizzare la Figura 2A per identificare la direzionalità (direzione 1 indica che il maiale dirige il naso verso l'umano; direzione 2 significa che il maiale dirige il naso lontano dall'umano).</li>
	<li>Dividere i comportamenti di attività ( Figura2B) in tre stati di approccio che si escludono a vicenda: NNOB, stand o walk without NNOB e riposo senza NNOB (vedere la codifica a colori negli ethogrammi nel video). NOT:</</c12> NNOB è usato per descrivere quando un maiale sta usando la sua bocca, muso, o faccia a leccare, annusare, masticare, mordere, strofinare, o root un oggetto non nutritivo per cercare la familiarità o nuove opportunità. Pertanto, quando è in questo stato attivo, è interessato all'umano e a uno stato di approccio. Se le telecamere aeree vengono utilizzate ad angoli di 90 gradi, la posizione del naso del maiale e il movimento della testa sono indicatori di NNOB. Occasionalmente, i maiali saranno chomp o masticare sham; il naso può essere visto, ma la testa si muove su e giù. Stare in piedi o camminare senza NNOB è abituato a descrivere quando il maiale è in posizione eretta, la testa è ferma e il naso non tocca un substrato o chomping, il che significa che è in uno stato di approccio meno. Riposo senza NNOB è usato descrivere quando il maiale è a riposo sdraiato o seduto, che è lo stato meno approccio sotto questa categoria di comportamenti.</li>
</ol>5. Timestamping dei video per l'efficienza e l'affidabilità
<ol><li>In base agli orari di inizio registrati dal raccoglitore dati, modificate il metraggio in sessioni esatte di 3 min. Il metodo per il timestamp richiederà 9 min per sessione.</li>
	<li>Utilizzare solo fino a due osservatori addestrati per timestamp i video. NOTA:: Se vengono utilizzati due osservatori, la variazione intra-osservatore deve essere quantificata, valutata, regolata e quindi segnalata come coefficiente di correlazione di Pearson dopo che gli osservatori hanno timestampato dello stesso video campione (per i metodi, vedere Martin e Bateson25).</li>
	<li>Impostare la velocità di riproduzione a una velocità regolare di 1x (ad es. 30 fps). Non mettere in pausa, riavvolgere o timestamp fotogramma per fotogramma.</li>
	<li>
Timestamp ogni categoria di comportamenti che si escludono a vicenda separatamente.
	<ol>
<li>Comportamenti spazialitimestamp . Riavviare il video.</li>
		<li>Comportamenti strutturalidel timestamp . Riavviare il video.</li>
		<li>Timestamp per i comportamenti strutturali/di posizione del naso .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare la durata di ogni risultato del comportamento (vedere Video supplementari 2 e 3)per riepilogare i dati. Le misurazioni della durata devono essere convertite in una percentuale di tempo per categoria.</li>
</ol>6. Indice di approccio
<ol><li>Applicare la formula (Figura 3) in modo che ogni comportamento strutturale e spaziale venga combinato per creare un'IA (Figura 3, Figura 4). L'IA viene utilizzata oltre a segnalare i comportamenti e le categorie separatamente come figure (Figura 5) o in formato tabulare. NOT:</</c4> Vedere Tabella dei materiali per i dettagli sul software. All'interno di ogni categoria, le durate del comportamento vengono prima convertite in percentuali (la durata dei comportamenti divisa per la durata totale della sessione di test). Ogni comportamento viene ponderato in base al livello di approccio (Figura 3). Comportamenti di prevenzione (la percentuale di tempo nell'area lontana, a riposo, con il naso allontanato) vengono moltiplicati per 0. Comportamenti di approccio moderato (la percentuale di tempo nella zona centrale, rivolta verso l'umano, e in piedi con la testa ancora) sono moltiplicati per 1. Il più grande livello di comportamenti di approccio (la percentuale di tempo nell'area vicina e più vicina e mostrando NNOB) vengono moltiplicati per 2. Quindi, ogni categoria viene ulteriormente ponderata 3, 2 e 1 rispettivamente per lo spazio, l'orientamento del naso e l'attività. Viene applicata una costante (0,10) per creare una scala percentuale. Ad esempio, se il maiale affronta l'umano, si trova nell'area vicina/più vicina ed esegue NNOB durante l'intera sessione di test, si noti che l'IA è 100% (il maiale rosso nella figura3). Al contrario, se il maiale si trova nella zona lontana, non si trova di fronte all'umano e rimane nella posizione di riposo durante l'intera sessione di test, l'IA è 0% (il maiale nero nella figura 3). I suini nella zona vicina possono avere la stessa IA di un suino che esegue NNOB nella zona centrale se vengono allontanati dall'umano e in piedi con la testa ferma (i maiali arancioni nella Figura3).</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lievi lesioni al cervello che non provocano cambiamenti anatomici e strutturali superabili rilevabili con l'imaging all'avanguardia possono essere difficili da identificare e trattare28. Tuttavia, i pazienti con mTBI sono particolarmente vulnerabili a ulteriori insulti che possono causare danni significativi al cervello, e quindi, è importante per questa popolazione da identificare. Test comportamentali sviluppati in un modello mini-maiale di mTBI sono particolarmente rilevanti per i pazienti umani mTBI perché i maiali hanno una fisiologia simile a quella degli esseri umani ed esprimono stati affettivi simili, come l'anedonia8,9,10 ,20. Qui, abbiamo sviluppato un test comportamentale non invasivo, in-pen (il HAT), e abbiamo dimostrato che è abbastanza sensibile da distinguere i maiali mTBI dai maiali finti. Inoltre, è stato sviluppato un indice ponderato (l'IA) per i comportamenti osservati durante il HAT che sono onnipresenti tra i tipi di abitazioni e maiali.
Modifiche e risoluzione dei problemi:
Le metodologie per il HAT sono state stabilite sulla base delle linee guida etologia25 e di diverse strategie di prova ed errore per migliorare l'affidabilità, la ripetibilità e la validità del test6. Le misure di affidabilità hanno contribuito a identificare i punti di forza e i limiti del test. L'affidabilità definisce la misura in cui la misurazione è ripetibile e coerente e priva di errori casuali28,29. In precedenza abbiamo riferito sull'affidabilità intra e interosservatoria del HAT, e con gli ethogrammi strutturali aggiuntivi, le risorse sono altrettanto alte (R2 > 0.90 di Pearson per la durata6). Le misure di frequenza e latenza richiedono osservatori addestrati, mentre le misure di durata sono meno dipendenti dall'osservatore e quindi più affidabili tra i laboratori30.
L'affidabilità all'interno di un laboratorio e la ripetibilità tra i laboratori dipende dai metodi. Nel nostro laboratorio, il sistema video registrato continuamente, i file sono stati inizialmente memorizzati come file di 5 minuti, e alcune sessioni HAT si sono verificati su due file. Meno errori sono stati fatti quando l'ora esatta dalla scheda dati è stata utilizzata per ritagliare e combinare i video. Prima di sviluppare l'etogramma, agli osservatori è stato permesso di mettere in pausa, arrestare e riavvolgere il filmato per fare un timestamp a tutti i comportamenti dell'intero etogramma. Questo metodo non solo ha causato variazioni nel timestamp di ogni campione, che vanno da 3 min a 20 min, ma l'affidabilità tra e all'interno dell'osservatore era anche scarsa per la maggior parte dei comportamenti. Pertanto, abbiamo impostato la velocità di riproduzione e abbiamo avuto osservatori timestamp ogni categoria alla volta. Pertanto, quando l'affidabilità era bassa in una sola categoria, gli osservatori hanno regolato in modo indipendente solo la categoria piuttosto che l'intero etogramma, dopo aver consultato le definizioni e il metraggio insieme. I metodi di riproduzione e categoria impostati hanno consentito una previsione coerente di quanto tempo era necessario per impostare il timestamp di ogni campione. Per i progetti che durano più di un mese, è importante misurare la revisione di routine dei video codificati e l'affidabilità all'interno dell'osservatore.
Un altro fattore che riduce l'affidabilità e la ripetibilità è la configurazione del video. Inizialmente, sono stati utilizzati una fotocamera portatile e un treppiede, che sono stati spostati da una penna all'altra. Quando è stato utilizzato questo metodo, i maiali dovevano essere introdotti al treppiede e alla telecamera prima del HAT; in caso contrario, i maiali sembravano reagire al treppiede e al movimento più che al test-umano. Inoltre, gli angoli di ripresa non generali limitavano la visione dell'osservatore durante il timestamp e la percezione della profondità dello spazio aumentava la variazione all'interno e tra l'osservatore nelle misure di comportamento spaziale; quindi, abbiamo sviluppato il protocollo con telecamere fisse. Quando si utilizza questo metodo, è necessaria una cura supplementare per assicurarsi che la fotocamera sia posizionata correttamente prima di ogni test e che sia necessario più tempo per la configurazione tra la sessione di ogni maiale. Tuttavia, abbiamo appreso che il sistema continuo di sovraccarico video doveva iniziare la registrazione iniziale almeno 24 h prima del primo HAT. La visualizzazione timestamp per molti sistemi video non è accurata e viene sincronizzata fino al fotogramma; pertanto, non ci affidiamo più ai tempi di visualizzazione. Gli inizi di mezzanotte consentivano l'esatta acquisizione dei fotogrammi e l'editing video e la visualizzazione del timestamp non è stata utilizzata.
Inoltre, l'acclimatamento dei suini e la creazione di una routine era importante per la risoluzione di questo test. Nei filmati di maiali che non erano ben acclimatati al loro ambiente, il ritmo è stato osservato durante l'HAT. Questo è un indicatore che il maiale può essere in uno stato agitato31 piuttosto che in uno stato esplorativa32. I periodi di accmineralazione di tre o più settimane possono ridurre il numero di suini che ritmo in un esperimento. Tuttavia, se il ritmo persiste per tutti i periodi di campionamento, potrebbe essere necessario regolare questo etogramma per includere passeggiate e piedi fermi.
La validità è la misura in cui una misura rappresenta l'ambito previsto della domanda che viene posta25. Quando abbiamo sviluppato per la prima volta l'HAT, abbiamo usato solo un etogramma spaziale. Le definizioni del comportamento etogramma spaziale descrivono in modo accurato e specifico la vicinanza ai soggetti umani e dicono direttamente all'osservatore quanto spazio il maiale lascia tra se stesso e un essere umano. Tuttavia, una volta che questi metodi sono necessari per essere applicati a un nuovo set-up di laboratorio, abbiamo riconosciuto che gli ethogrammi spaziali sono specifici del laboratorio. Le dimensioni della penna e il posizionamento di altri oggetti influenzano il risultato dell'etogramma spaziale; pertanto, un diagramma con le misure e le specifiche della penna dovrà essere pubblicato se la configurazione della penna non è stata segnalata in precedenza. Oltre ai report sull'ambiente della penna, i comportamenti strutturali sono stati aggiunti all'etogramma. A differenza dei comportamenti spaziali, i comportamenti strutturali possono essere valutati più facilmente tra i laboratori; questi comportamenti hanno validità perché descrivono specificamente il livello di stato attivo del maiale. Quando un maiale riposa, è probabile che non sia motivato ad avvicinarsi e non è in grado di cambiare posizione per avvicinarsi con la velocità di un maiale in piedi. Allo stesso modo, un suino che mostra NNOB è in uno stato esplorativo, ma un maiale con la testa ferma mentre è in piedi è più probabile in uno stato catatonico. L'orientamento del naso aiuta con la validità perché il naso, le orecchie e poi gli occhi sono ciò che il maiale usa per raccogliere informazioni sull'uomo.
Limitazioni della tecnica:
Una potenziale preoccupazione per questa tecnica è la variabilità nelle risposte dei suini all'uomo di prova. Inoltre, i maiali guarderanno le mani dell'uomo di prova, che può causare spunto involontario da quella persona. Pertanto, queste limitazioni sono state espresse attraverso la sperimentazione sperimentale di 1) le risposte dei suini a un uomo familiare e non familiare, e 2) standardizzando che, dopo che il pellet è caduto, il test-umano si ferma e mette le mani fuori dal vista maiale. I dati hanno mostrato che non vi erano trattamenti o differenze di tempo durante il HAT (Tabella 2), suggerendo che l'HAT poteva essere somministrato da esseri umani familiari o sconosciuti. Altri ricercatori suggeriscono che i suini tendono a generalizzare sugli esseri umani sulla base di precedenti interazioni11,12,13; pertanto, le precedenti esperienze di un maiale con gli esseri umani devono essere positive. Questa sfida può anche essere soddisfatta con un progetto sperimentale vigile; per ogni blocco, è necessario un numero sufficiente di unità sperimentali rappresentate per ogni trattamento di interesse.
In questo studio, anche se c'erano solo due osservatori esperti che avevano fatto il timestamp di tutti i video per tutti e tre i tipi di alloggio, c'erano differenze tra i tipi di alloggiamento per risultati di comportamento specifici (Tabella 1). Ad esempio, i suini in alloggiamento di tipo B sono entrati nell'area più vicina più spesso di quelli nei tipi di abitazione A e C. Ciò è probabilmente dovuto a una differenza nel materiale della penna; nell'alloggiamento B, la parte anteriore della penna era un cancello a catena con barre orizzontali che permettevano al maiale di salire sul cancello durante l'HAT. I tipi di abitazione A e C, d'altra parte, avevano barre verticali e meno superfici orizzontali su cui salire i suini. Questa variabilità può essere riacissa aggiungendo la spesa per la durata nelle aree vicine e più vicine prima di confrontarle tra i tipi di alloggio (Tabella 1; P > 0,10). Tuttavia, i suini nell'alloggio di tipo C hanno trascorso più tempo nella zona lontana rispetto a quelli dei tipi di abitazione A e B (tabella1; P < 0,05), probabilmente dovuto al posizionamento degli acquilanti nella parte posteriore della penna piuttosto che nella parte anteriore della penna. Si tratta di una limitazione che può essere risolta se i laboratori scelgono di standardizzare il posizionamento di waterer, ciotole e giocattoli e assicurarsi che siano fissati in modo che il maiale non sposti l'oggetto in un'altra area.
Questo test ha una grande accessibilità per laboratori di tutti i tipi, ma, come accennato in precedenza, l'ethogram e le misurazioni spaziali stampate manualmente varieranno maggiormente tra i laboratori. Ciò nonostante, gli etogrammi strutturali del corpo e della testa sono onnipresenti. I laboratori che hanno accesso al tracciamento automatico convalidato per i suini possono trarre vantaggio dall'tracciamento automatico dell'etogramma spaziale anziché manualmente, in quanto la distanza spostata e il tasso di movimento possono essere ulteriori risultati delle misure di comportamento l'HAT. Le limitazioni derivanti dalla configurazione in-pen e dalle tecnologie tradizionali piuttosto che dalle aree di prova e dalle tecnologie di tracciamento automatico possono essere samentate adattando la formula di IA. L'IA fornisce misure e terminologia standardizzate su come i singoli maiali usano il loro spazio della penna ed esprimono interesse per un essere umano. Questo calcolo, derivato da misure comportamentali comuni, è sensibile ai modelli di suine di mTBI subconcussive e, eventualmente, ad altri stati di lesioni subcliniche o malattia. Inoltre, l'IA riduce le variazioni casuali durante la sperimentazione e può essere più facilmente confrontata tra esperimenti e laboratori rispetto ai metodi che si basano su misurazioni più specifiche dell'esperimento. I comportamenti strutturali hanno fornito le basi per questa formula, perché questi comportamenti sono misurazioni standard tra i trattamenti, mentre i comportamenti spaziali dipendono dall'impostazione della penna, dal numero di suini in una penna e dal sistema di tracciamento. Per esempio, abbiamo osservato che quando due maiali sani vengono testati in una penna, eseguiranno comportamenti spaziali simili avvicinandosi insieme, ma il maiale che segue il primo può orientare il naso più verso il suo compagno di penna che verso l'umano ed esprimere più NNOB , perché il maiale che conduce serve come sentinella. Ciò nonostante, l'IA aiuta a ridurre questa variazione anche dai comportamenti accoppiati.
Anche se l'IA è un eccellente set di strumenti per standardizzare il test tra laboratori, i ricercatori potrebbero comunque voler esaminare i risultati del comportamento specifico dei test all'interno di un laboratorio o di un esperimento, soprattutto se hanno abbastanza potenza (cioè unità sperimentali e test ripetuti) in un unico esperimento. Di conseguenza, nella tabella 1, contenente tutti i risultati del comportamento, la varianza, la distribuzione e un test calcolato per il numero di animali per ogni comportamento specifico, sono stati inclusi in questo campo. Ad esempio, se i ricercatori hanno ambienti di penna che consentono ai maiali di arrampicarsi costantemente durante l'HAT e conoscono le loro cause di trattamento per oltre una differenza del 75% nei comportamenti di arrampicata, possono giustificare il numero di animali in base alla varianza misurata. Se nuovi comportamenti vengono aggiunti all'etogramma, gli scienziati dovranno giustificare quali comportamenti sono indicativi di approccio o ritiro prima di incorporarli nell'indice. Ad esempio, se la maggior parte degli animali all'interno di un ritmo di esperimento lungo le pareti della penna (cioè thigmotaxis)32, la durata di questo comportamento potrebbe essere incorporata nella categoria dell'etogramma strutturale del corpo. Il comportamento potrebbe essere rappresentato nel grafico a barre in pila dettagliato (ad esempio, Figura 5) o in formato tabulare e quindi, può essere sommato con stand-still prima di applicare il calcolo dell'indice. L'IA, pertanto, può rappresentare comportamenti onnipresenti tra i laboratori, ma ulteriori comportamenti univoci possono comunque essere rappresentati separatamente.
Significato rispetto ai metodi esistenti:
I metodi esistenti per l'HAT sono stati istituiti per i suini nelle aziende agricole commerciali per valutare il benessere degli animali. In questo caso, è stato istituito un protocollo per i suini di laboratorio, che può aiutare i ricercatori a valutare il benessere degli animali e distinguere i maiali mTBI dai suini trattati con finzione. Un test tradizionale alternativo potrebbe essere quello di utilizzare un test a campo aperto. Questo test è stato precedentemente utilizzato per valutare l'emotività e il benessere dei suini33. I test a campo aperto sono stati originariamente progettati per testare gli stati affettivi dei roditori misurando la loro avversione naturale verso lo spazio aperto e la luce. Al contrario, i suini sani possono vedere gli stessi stimoli come appetitoso10, e dopo una malattia, lesioni, o trattamento di stress, probabilmente esprimono paura. Questo test richiede più spazio di laboratorio e richiederà ai maiali di acclimatarsi per essere trattati e collocati in un'arena a campo aperto. Se i laboratori dispongono di spazio e di protocolli per la manipolazione dei suini, le ripetute sessioni HAT, oltre a un test a campo aperto, possono aiutare a distinguere ulteriormente gli animali trattati dagli animali trattati con finzione.
Passaggi critici all'interno del protocollo:
I primi tre passaggi del protocollo sono i più critici per il successo delle misure HAT. Le sessioni per maiale prendono solo 3 min; tuttavia, una preparazione adeguata contribuirà a rendere affidabile questo test. Come detto sopra, la posizione della telecamera e la registrazione del set-up sono fondamentali per la chiarezza e la replica. Angoli di ripresa impropri possono limitare la visione dell'osservatore, che aggiungerà errori alle misurazioni. Un altro passo spesso trascurato è fissare gli oggetti nella penna. Il maiale si muoverà oggetti non fissi, e questo può influenzare la sua motivazione ad avvicinarsi all'uomo. Il sistema di allestimenti e gestione è importante perché i suini devono essere acclimatati al loro ambiente prima di poter eseguire il test in modo coerente. I maiali che non sono ben acclimatati alle loro penne di casa o di routine o stanno vivendo lo stress defecantano in altre aree piuttosto che sul retro della penna34. L'area di defecazione può influenzare la loro motivazione ad avvicinarsi. Dal punto di vista della telecamera, l'osservatore dovrebbe essere in grado di identificare i singoli suini; tuttavia, è importante che il sistema di marcatura non fornisca informazioni sul trattamento dell'animale, in quanto ciò pregiudicherà l'osservatore25.
L'identificazione dei suini è molto importante per ottenere i dati comportamentali corretti per il maiale giusto, anche quando sono mono-casati. I maiali sono spesso spostati per i loro trattamenti, e una marcatura riassicura l'osservatore che stanno guardando lo stesso maiale dopo che è stato rimosso e rimesso nella sua penna. I maiali possono essere alloggiati in coppie, come nel tipo di abitazione C, e quindi diventa molto importante identificare i maiali. Le vernici e i marcatori di marcatura del bestiame richiedono un'applicazione quotidiana; pertanto, questo protocollo richiede l'uso di un nastro di grado medico e uno striscio di cemento tag. Il nastro si attacca meglio ai maiali con i capelli più lunghi. I suini con i capelli corti e la pelle secca slough fuori il nastro più spesso di maiali con i capelli più lunghi.
Applicazioni future:
In sintesi, il test HAT in-pen non invasivo descritto qui è abbastanza sensibile da rilevare lievi e temporali cambiamenti dipendenti nei suini dopo mTBI. Inoltre, abbiamo sviluppato un indice ponderato chiamato AI per valutare i cambiamenti nei suini ospitati in diversi tipi di penna, così come in diversi tipi di maiale. Anche se il HAT è stato utilizzato per rilevare cambiamenti nei suini esposti a mTBI, questo test comportamentale può essere utile per rilevare cambiamenti comportamentali misurabili negli animali che sperimentano stress o condizioni prepatologiche.

MTBI umano è spesso definito da deficit funzionali nonostante l'assenza di cambiamenti strutturali globali o edema significativo all'interno del cervello1,2,3. Infatti, in alcuni pazienti mTBI, la caratteristica di questa lesione è un cambiamento nel loro stato psicologico in assenza di cambiamenti neuroanatomici4,5. Abbiamo utilizzato un modello di porcina di mTBI6 perché il cervello del maiale è sia anatomicamente che fisiologicamente più vicino agli esseri umani rispetto ai roditori7e le misurazioni corrispondenti potrebbero fornire una serie rilevante di elementi di dati comuni con gli esseri umani.
Negli ultimi anni, il modello di suine ha guadagnato l'interesse degli scienziati del neurotrauma e delle parti interessate mTBI per le indagini precliniche; tuttavia, a differenza dei modelli di roditori di TBI, sono pubblicati solo pochi test comportamentali standardizzati che consentono di valutare lo stato affettivo del maiale di laboratorio (cioè lo stato psicologico)7,8,9, 10. Un obiettivo a lungo termine per il nostro laboratorio è quello di sviluppare diversi set di strumenti comportamentali complementari che siano abbastanza sensibili da misurare quando i maiali soffrono di malattia subclinica o quando gli animali sono in uno stato prepatologico legato allo stress.
Test comportamentali ripetuti che misurano il cambiamento dello stato affettivo in un maiale di laboratorio possono essere buoni candidati per distinguere un animale con una condizione prepatologica da animali sani. Ad esempio, gli HAT in-pen sono stati utilizzati per la produzione commerciale di suini per aiutare gli agricoltori a selezionare maiali sani con un buon temperamento o modificare le strategie di gestione e alloggiamento che causavano disagio, lesioni e malattie11,12. Questi test sono stati utilizzati per quantificare la motivazione e lo stato affettivo generale di un suino o di un gruppo di suini13.
Il nostro laboratorio e altri ricercatori hanno misurato la motivazione nei suini quantificando tre categorie di comportamenti: 1) stati esplorativi che si esprimono attraverso comportamenti orali non nutritivi (NNOB), dove il maiale usa la bocca, il muso o il viso per annusare, leccare, masticare, e sradicare un substrato, o chomp senza un substrato14,15; 2) relazioni spaziali del maiale con un oggetto odi 16anni; 3) direzione del naso, che viene utilizzato al posto del contatto visivo perché i maiali hanno17monoculare , ma visione miope, e danno priorità al loro senso dell'olfatto sulla visione18. Se un maiale sano associa gli esseri umani a stimoli gratificanti, esprimono un'alta frequenza di NNOB, dirigono il naso verso l'umano e cercano di guadagnare più vicino alla umana11,16. Tuttavia, dopo la malattia, lesioni, o un'esperienza stressante, la motivazione a cercare anche stimoli piacevoli è ridotta, e quindi, questi comportamenti misurabili sono probabilmente ridotti19. I ricercatori sul comportamento suino hanno notato che l'anedonia, la mancanza di motivazione a sperimentare stimoli piacevoli, è riconoscibile e misurabile nei maiali all'interno del loro ambiente domestico20. Pertanto, gli HAT ripetuti (prima e dopo il trattamento) possono servire come misura sensibile per distinguere i suini di laboratorio trattati con mTBI subconcussivo da soggetti trattati con sham (solo anestesia). L'anedonia è uno stato affettivo che i pazienti TBI possono sperimentare21. Il HAT utilizzato qui ha il potenziale per contribuire a semplificare la traduzione dei risultati comportamentali da un modello animale al lavoro clinico. Gli HAT possono essere somministrati quotidianamente nel corso di un esperimento, che può anche aiutare a standardizzare la cura dei suini di laboratorio per ottimizzare il benessere degli animali e l'allevamento22.
Qui, usando il HAT, vengono sondate le differenze comportamentali risultanti da mTBI nei mini-suini. La riduzione della variabilità comportamentale è stata ottenuta utilizzando misure non invasive dell'HAT e consentendo ai suini di acclimatarsi alle penne domestiche, alla gestione di routine e a un trattamento quotidiano. Tradizionalmente, un'arena di prova viene utilizzata per misurare i comportamenti (ad esempio, test a campo aperto). Un test in penna può essere utile nei laboratori che hanno spazio limitato. Lo spostamento e la manipolazione dei suini in un'arena di prova possono causare una risposta allo stress (angoscia o eustress) e potenzialmente aumentare la variazione delle risposte al test. Un test in penna rimuove tale componente di movimentazione e, di conseguenza, riduce probabilmente le variazioni dalla manipolazione-stress17. Per questi motivi sopra indicati, abbiamo sviluppato un HAT quotidiano, in-pen per questo modello mTBI.
Le misure standardizzate e quantificate che definiscono in modo appropriato lo stato affettivo dell'animale sono aspetti importanti nello sviluppo di un nuovo test di comportamento. Inoltre, i test devono essere ripetibili in più laboratori. Qui, per lo sviluppo di questo protocollo, l'HAT è stato testato nei diversi sistemi abitativi di tre laboratori. Tre subethogram sono stati creati per timestamp comportamenti specifici da video di esempio. Successivamente, è stata creata una formula ponderata per incorporare i tre etogrammi e consentire l'uso di HAT in più laboratori. Anche se questo test è stato sviluppato e utilizzato specificamente per il mini-maiale trattato con mTBI subconcussive, i metodi e il protocollo sviluppati qui avranno applicazioni per distinguere la differenza tra un maiale subclinicamente ferito/malato o afflitto e un maiale sano.
I risultati comportamentali possono essere influenzati da abitazioni singole e di gruppo, indennità di spazio libero, il tipo di pavimento utilizzato, il tipo di recinzione utilizzato, la posizione di alimentazione e acqua, l'area di defecazione e la posizione di arricchimento ambientale. Pertanto, tre tipi di alloggio è stato esaminato (Figura 1): tipo di abitazione A era alla Kansas State University (Manhattan, KS); alloggiamenti B e C erano alla Virginia Tech University (Arlington, VA). Il singolo Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) in ogni sede ha approvato l'uso delle strutture e delle procedure.
Per lo sviluppo dell'etogramma del tipo di alloggiamento A (Figura1A), del mini-suvi odore del Minnesota (bofrattari - 7, dorato 1; National Swine Research Resource Center, Columbia, MO; 25,6 x 3,66 settimane di misura media (SD)] sono state alloggiate all'interno in singole penne con pavimentazione rispettosa degli animali (IACUC #3881). I suini utilizzati per questo protocollo erano in buona salute non avevano trattamenti applicati. Per lo sviluppo del protocollo per l'alloggio B, i mini-maiali dello Yucatan (età 25,3 x 2,80 settimane [media SD] sono stati ospitati in una sola sede (Figura 1B) presso le strutture Virginia Tech (IACUC #15-060). I trattamenti sugli animali sono descritti altrove29 e includevano l'induzione di mTBI subconcussive utilizzando sovrapressione delle onde blastriche o controlli finti (solo anestesia). Per lo sviluppo del protocollo di alloggiamento di tipo C, cinque mini-maiali femminili di Gottinga (età: 23,7 x 1,18 settimane ) sono stati alloggiati a Virginia Tech con una grande penna (Figura 1C; IACUC #15-060). I primi due ambienti abitativi sono tipici alloggi di laboratorio o contengono maiali monolocali. Il tipo di abitazione C è un ambiente residenziale atipico che può ospitare due o più maiali e può essere considerato più di un ambiente arricchito rispetto alle abitazioni di laboratorio standard. Questo protocollo può essere utilizzato in tutti i tipi di alloggiamento se vengono seguiti i seguenti metodi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="879">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:229px;">Dome 3.0 Megapixel Cameras with 2.8-12mm lens set between 2.8-3.2 mm</td>
			<td style="width:240px;">Points North Surveillance, Auburn, ME</td>
			<td style="width:115px;">CDL7233S</td>
			<td style="width:296px;">Lower mm lenses are needed for low-profile pens</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Manfrotto 244 friction arm kit</td>
			<td style="width:240px;">B&#38;H Photo</td>
			<td style="width:115px;">B&#38;H # MA244; MFR # 244</td>
			<td style="width:296px;">To mount and secure cameras at a 90 degree angle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Video Recording System</td>
			<td style="width:240px;">Points North Surveillance, Auburn, ME</td>
			<td style="width:115px;">NVR-RACK64</td>
			<td style="width:296px;">NVR is customized</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:229px;">Colored and patterned duct tape attached to a double-sided medical grade tape</td>
			<td style="width:240px;">&#160;MBK Tape Solutions, Chatsworth, CA</td>
			<td style="width:115px;">3M 1522H</td>
			<td style="width:296px;">Sustainable marking of pigs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Approach Index Formula generator</td>
			<td style="width:240px;">Dinasym, Manhattan, KS</td>
			<td style="width:115px;">Approach Formula</td>
			<td style="width:296px;">Company will customize macros for specific lab needs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Geovision Software</td>
			<td style="width:240px;">Points North Surveillance, Auburn, ME</td>
			<td style="width:115px;">Geovision</td>
			<td style="width:296px;">Software to edit video time into 180 second clips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Clicker</td>
			<td style="width:240px;">Petco</td>
			<td style="width:115px;">Good2Go Dog Training Clicker</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:229px;">Reward treat (feed pellet, carob chip, raisin, marshmallow)</td>
			<td style="width:240px;">Variable</td>
			<td style="width:115px;">N/A</td>
			<td style="width:296px;">Depending on previous exposure, adult pigs are very&#160; neophobic when new food is introduced. Limit-fed pigs can be fed a few pellets of feed.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Statistical Analysis System (SAS)</td>
			<td style="width:240px;">SAS Institute, Cary, North Carolina</td>
			<td style="width:115px;">SAS 9.0</td>
			<td style="width:296px;">Our laboratories preference for analyzing mixed models and repeated measures</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Observer 11.5 software</td>
			<td style="width:240px;">Noldus Information Technology, Leesburg, VA</td>
			<td style="width:115px;">Observer 11.5</td>
			<td style="width:296px;">Software to manually timestamp video clips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive, in-pen approach test for laboratory-housed pigs

L'incidenza traumatica delle lesioni cerebrali (TBI) è aumentata sia nelle popolazioni civili che militari, e molti ricercatori stanno adottando un modello di suini per la TBI. A differenza dei modelli di roditori per TBI, ci sono pochi test comportamentali che sono stati standardizzati. Un animale più grande richiede una manipolazione più invasiva nelle aree di prova rispetto ai roditori, il che potenzialmente aggiunge stress e variazione alle risposte degli animali. Qui, viene descritto il test di approccio umano (HAT), che è stato sviluppato per essere eseguito di fronte alla penna di casa dei maiali di laboratorio. Non è invasivo, ma abbastanza flessibile da consentire differenze negli allestimenti delle abitazioni.
Durante il HAT, sono stati sviluppati tre ethogrammi comportamentali e quindi è stata applicata una formula per creare un indice di approccio (AI). I risultati indicano che l'HAT e il suo indice, AI, sono abbastanza sensibili da rilevare alterazioni lievi e temporanee nel comportamento dei suini dopo un lieve TBI (mTBI). Inoltre, anche se i risultati di comportamento specifici dipendono dall'alloggiamento, l'uso di un'IA riduce le variazioni e consente misurazioni coerenti tra i laboratori. Questo test è affidabile e valido; HAT può essere utilizzato in molti laboratori e per vari tipi di modelli di porcini di lesioni, malattia e angoscia. Questo test è stato sviluppato per un metodo di timestamp manuale ottimizzato in modo che l'osservatore spenda costantemente non più di 9 min su ogni campione.

Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive, In-pen Approach Test for Laboratory-housed Pigs at JoVE.com

Noninvasive, In-pen Approach Test for Laboratory-housed Pigs

Questo protocollo descrive un nuovo test comportamentale, il test di avvicinamento umano nella penna domestica dei suini, per rilevare i deficit funzionali nei suini di laboratorio dopo lesioni cerebrali traumatiche subconcussive.

Test di avvicinamento non invasivo e in-pen per suini ospitati in laboratorio

Traumatic brain injury (TBI) incidences have increased in both civilian and military populations, and many researchers are adopting a porcine model for ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, in particolare sul neurotrauma. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede un'arena o una gestione extra del soggetto. Il mio team di ricerca può essere visto dimostrare le procedure in tutto il protocollo. Questo include Eduarda Bortoluzzi, Mikayla Goering, Luke Ruiz, Jared Mumm e Morgan Coffin.Prima di mettere gli animali nelle loro penne fissare le telecamere a un 90

Research

JoVE Journal

Behavior

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

Contestuali e Cued paura condizionata test utilizzando un sistema di video Analizzare in topi

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

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Noninvasive, High-throughput Determination of Sleep Duration in Rodents

Determinazione non invasiva, High-throughput di durata di sonno in roditori

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