Name: measuring and interpreting oxygen consumption rates in whole fly head segments
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments at JoVE.com

Vi takker Andreas Ladurner, Carla Margulis og deres hold for omfattende eksperimentel understøttelse. Vi takker Caitlin Ondracek for hendes kommentarer til manuskriptet. Vi vil gerne takke Sofia Vikstrom for at hjælpe os med at etablere de tidlige faser af denne teknik. Vi takker også kan Sanderhoff for hendes teknisk hjælp. LB er finansieret af den tyske føderale ministerium for uddannelse og forskning (Infrafrontier grant 01KX1012). SP blev finansieret af et AXA forskningsfond postdoc stipendium og NSFC (Grant nummer 81870900). AVV er finansieret af QBM.

1. instrument forberedelse
Bemærk: For dette eksperiment, har vi brugt en søhest XF24 enhed med "islet plader". Driften af teknikken, der bruger forskellige cyklusser af blanding, venter på målinger samt muligheden for at tilføje stoffer til måling rum.
<ol><li>Tænde maskine godt før starten af forsøget, således at der er tilstrækkelig tid til at nå den ønskede temperatur og forblive stabil.</li>
	<li>I software installation (administration-tilstand), skal du vælge længden af kassette kalibreringen (her, 20 min blev valgt) og den ønskede temperatur. Bemærk: Mens mitokondrier eller pattedyrvæv målinger foretages typisk ud ved 37 ° C, flyve hoved temperaturen er 25 ° C, men offentliggøres resultaterne af målinger på 31 ° C. Vi brugte 31 ° C, da dette er den laveste temperaturindstilling for enheden ved stuetemperatur. For at nå temperaturer på 25 ° C eller lavere, placere maskinen i et koldere værelse eller på 11 ° C som for nylig udgivet21.</li>
	<li>I softwaren, kan bruge følgende protokol: 3 min blanding – 2 min venter – 2 min måling. Afhængigt af det eksperimentelle design, tilføje indsprøjtning skridt fra havne A-D efter en valgte måling skridt.<ol>
<li>For kvalitetskontrol, og bestemmelse af basal OCR, vente mindst tre måling cyklusser før injektion den første drug via port A. For en detaljeret tidslinje over protokollen, se venligst reference Becker et al. 13 .
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. patron forberedelse
<ol><li>Pre kalibrere patronen en dag (eller mindst 4 h) forud for testning. Tilsæt 1,0 mL af kalibratoren (pH 7,4) til hver brønd og placere sensoren patronen på toppen af pladen og butik ved 37 ° C uden CO2 for natten eller op til 72 h. forhindre fordampning af patronen med parafilm hvis det er at blive hydreret i mere end 24 timer.</li>
	<li>Sikre, at de eksperimentelle narkotika godt opløst i medium (frisk medium + 2,5% glukose) før starten af forsøget.</li>
	<li>Mål og Juster pH-værdien af stoffet løsning af køretøjet ved den ønskede temperatur til at undgå enhver pH forskel under stof injektion pH-værdi.</li>
	<li>Med pipette overfoeres drug løsning til sin tildelte injektion port. For eksempel bruge 77 μL for port A for at opnå en 1:10 fortynding i en 770 μL løsning og efterfølgende 85 μL for port B.</li>
	<li>Indlæse patronen ind i maskinen og begynde kalibrering.</li>
</ol>3. plade forberedelse
Bemærk: Det anbefales kraftigt at to mennesker forberede pladen samtidigt. Varigheden af en plade forberedelse pr. to personer kan kræve ~ 45-60 minutter.
<ol><li>Justere den frisklavede medier + 2,5% glukose til den ønskede pH med 1 N HCl. Sørg for, at pH ikke påvirkes af ændringer i temperatur.</li>
	<li>Forberede en ice box og placere en metal plade på isen.</li>
	<li>Åbn pakken islet plade (24-godt plade) og fordybe redskaber i en petriskål (92 mm x 16 mm) med medier.</li>
	<li>Indsamle en netto med inserter (et lille instrument, der placerer nettet fast i brønden) og har inserter stå ved siden af mikroskopet. Tilføje en lille dråbe af medier til nettet knyttet til inserter.</li>
	<li>Bedøver fluer (én uge eller 4 uger gamle canton hanner blev brugt her) ved at placere fluer på iskold metalpladen.</li>
	<li>Bruge pincet, få fat i maven af en flue og fordybe det i medierne i en petriskål under mikroskop.</li>
	<li>Ved hjælp af et andet par pincet, forsigtigt fjerne lederen af fluen. Placer det i midten af nettet er knyttet til inserter og kontrollere, at hovedet er nedsænket i medierne.</li>
	<li>Center hovedet når der er 16 af dem på nettet. Fjern overflødig væske før centrering hoveder for at forhindre tab af hoveder samtidig med at placere dem i brønden. Bemærk: 16 flyve hoveder blev brugt som dette nummer gav tilstrækkelige og stabile data inden for en rimelig frist af plade forberedelse under metode etablering.</li>
	<li>Bruger inserter, placere nettet i brønden. Sikre, at lederne er fanget under net. Langsomt tilføje 700 μL af medier + 2,5% glukose (figur 1). Gentag processen for hvert af brøndene. Bemærk: 20 wells af flyve hoved prøver og 4 tomme brønde for baggrunden kalibrering pr. plade anbefales. Sørg for, at Tom wells også indeholde et net med 700 μL af bufferen + 2,5% glukose.</li>
	<li>Kontrollere brønde for luftbobler under net via mikroskop. Med pipette overfoeres forsigtigt op og ned med en 1 mL pipette til at fjerne eventuelle bobler. Holde hovedet centreret for en pålidelig OCR læsning.</li>
	<li>Tilføj pladen til maskinen og start måling.</li>
</ol>4. analyse af OCR-målinger
<ol><li>Fjerne patronen for enden af protokollen.</li>
	<li>For at kontrollere kvaliteten, observere nogen synlige rester i port fyldninger. Kassér patron og plade (mulighed 1) hvis hovedet ikke skal bruges til protein udvinding, fx (jf. valgmulighed 2).</li>
	<li>Uddrag regnearksfiler og kvalitet check hver godt for ilt og pH niveauer. Sørg for, at baggrunden wells viser ingen OCR og at iltindholdet er stabil.<ol>
<li>Brug en algoritme til dataanalyse, hvoraf nogle kan vælges i de respektive software. Brug AKOS algoritme for OCR værdier2 hvis rækken af ilt niveauer under hele målingen, mellem den første og sidste kryds (= sub måling) er ens mellem to biologiske prøver og iltindholdet i de sidste tæger er ikke lavere end () 95 mmHg) (hoveder OCR er markant lavere på dette ilt niveau), (figur 2).</li>
		<li>Nogle betingelser vil forårsage prøve at generere en hurtig OCR og kan vise lavere iltindhold under 1st kryds og/eller i den sidste kryds (iltmangel) (figur 3A). I et sådant scenario, bruge en alternativ målemetode som den faste algoritme. I iltmangel, er OCR stærkt reduceret på grund af lavt indhold af ilt i løsningen. Som sådan, udbytter AKOS algoritme vildledende aflæsninger. Bemærk: Den nyere maskine mangler den faste algoritme. Derfor er det foretrukket at udtrække de samlede iltindhold og plot sats pr. tid for først 3-5 flåter (figur 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. (mulighed 2) biokemiske analyser af hoved-segmentet
<ol><li>Til måling af det biokemiske (metabolitter, proteomet, etc.) egenskaber af et hoved segment, justere operationstiden kravet; Det er dog muligt at afbryde protokollen til enhver tid og fjerne pladen.</li>
	<li>Når pladen er fjernet, skal du bruge ikke-skærpet pincet til at lave et hul i nettet og fjerne det dermed frigøre hoveder til at flyde.</li>
	<li>Ved hjælp af en 1 mL pipette med et snit tip og overføre hovedet til et hætteglas.</li>
	<li>Hurtigt slette bufferen og snap-fryse hovedet i flydende kvælstof. Gemme hoveder på-80 ° C for fremtidige analyser.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial diseases in man and mouse. 283 (5407), 1482-1488 (1999).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Cunnane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+fuel+metabolism,+aging,+and+Alzheimer's+disease.">Brain fuel metabolism, aging, and Alzheimer's disease.</a> Nutrition. 27 (1), 3-20 (2011).</li><li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li><li>Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+energetics+and+therapeutics.">Mitochondrial energetics and therapeutics.</a> Annual review of pathology. 5, 297-348 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mitochondrial+dysfunction+as+a+strategy+for+targeting+tumour+cells+in+metabolically+compromised+microenvironments.">Induction of mitochondrial dysfunction as a strategy for targeting tumour cells in metabolically compromised microenvironments.</a> Nature communications. 5, 3295 (2014).</li><li>Wheaton, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+inhibits+mitochondrial+complex+I+of+cancer+cells+to+reduce+tumorigenesis.">Metformin inhibits mitochondrial complex I of cancer cells to reduce tumorigenesis.</a> eLife. 3, e02242 (2014).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS one. 6 (3), e18317 (2011).</li><li>Baker, D. J., Peleg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+Modeling+of+Mitochondrial+Metabolism+Dysregulation+during+Aging.">Biphasic Modeling of Mitochondrial Metabolism Dysregulation during Aging.</a> Trends in biochemical sciences. 42 (9), 702-711 (2017).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation. 327 (5968), 1000-1004 (2010).</li><li>Baeza, J., Smallegan, M. J., Denu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Dynamics+of+Protein+Acetylation+in+Mitochondria.">Mechanisms and Dynamics of Protein Acetylation in Mitochondria.</a> Trends in biochemical sciences. 41 (3), 231-244 (2016).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers.">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li><li>Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., de Angelis, M. H., Peleg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+transient+oxygen+consumption+increase+following+acute+HDAC/KDAC+inhibition+in+Drosophila+tissue.">Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue.</a> Scientific reports. 8 (1), 4199 (2018).</li><li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Glycolysis+Is+Essential+for+Neuronal+Survival+in+Drosophila.">Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila.</a> Cell metabolism. 22 (3), 437-447 (2015).</li><li>Newell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physiological Entomology. 41, 96-102 (2016).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS one. 6 (7), e21746 (2011).</li><li>Wikstrom, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+assay+for+islet+respiration+reveals+uncoupling+of+rodent+and+human+islets.">A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets.</a> PloS one. 7 (5), e33023 (2012).</li><li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans.">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 11 (10), 1798-1816 (2016).</li><li>Kumar, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Glycolysis+and+Mitochondrial+Respiration+in+a+Zebrafish+Model+of+Dravet+Syndrome.">Altered Glycolysis and Mitochondrial Respiration in a Zebrafish Model of Dravet Syndrome.</a> eNeuro. 3 (2), (2016).</li><li>Neville, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ex+vivo+method+for+measuring+whole+brain+metabolism+in+model+systems.">A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems.</a> Journal of neuroscience. 296, 32-43 (2018).</li><li>Neville, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Analysis+of+Drosophila+melanogaster+Larval+and+Adult+Brains.">Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Peleg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+extension+by+targeting+a+link+between+metabolism+and+histone+acetylation+in+Drosophila.">Life span extension by targeting a link between metabolism and histone acetylation in Drosophila.</a> EMBO reports. 17 (3), 455-469 (2016).</li><li>Peleg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice. 328 (5979), 753-756 (2010).</li><li>Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+world+of+protein+acetylation.">The world of protein acetylation.</a> Biochimica et biophysica acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).</li><li>Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+the+life+span,+vitality+and+fine+structure+of+Drosophila+melanogaster.">Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster.</a> Mechanisms of ageing and development. 5 (5), 347-370 (1976).</li><li>Banh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTP1B+controls+non-mitochondrial+oxygen+consumption+by+regulating+RNF213+to+promote+tumour+survival+during+hypoxia.">PTP1B controls non-mitochondrial oxygen consumption by regulating RNF213 to promote tumour survival during hypoxia.</a> Nature cell biology. 18 (7), 803-813 (2016).</li><li>Falkenberg, K. J., Johnstone, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+and+their+inhibitors+in+cancer,+neurological+diseases+and+immune+disorders.">Histone deacetylases and their inhibitors in cancer, neurological diseases and immune disorders.</a> Nature reviews. Drug discovery. 13 (9), 673-691 (2014).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Vores nye teknik tilbyder en ny tilgang for at studere metaboliske ændringer i aldring og sygdom i forbindelse med hele flyve hoved segmenter22. Metoden kan også være egnet til at undersøge virkningen af KDAC natrium butyrat på iltforbrug. Som vi har påvist, resultere lysin deacetlyase hæmmere (HDAC'er/KDACs) i OCR ændringer. Det væsentlige mål af disse inhibitorer er normalt ikke lokaliseret i mitokondrierne (disse hæmmere ikke indflydelse klasse III deacetyltransferase, sirtuiner)24, sådanne lægemidler kan kun testes på et mindst væv niveau. Faktisk, forskellige narkotika er injiceres direkte til hjernen, derved omgåelse mulig behandling/ændring/inaktivering af fordøjelsessystemet. Som sådan, tilbyder vores teknik roman indsigt i hvordan sådan narkotika direkte indvirkning hoved-segmentet.
Der er flere kritiske trin. Først, som anført i protokollen, vi varmt anbefale forbereder en plade under en time, med to par hænder forbereder pladen. Fra vores erfaring er kvalitet og stabilitet af OCR målinger bedre, når forberedt i tide. Når man tager alt for lang, stiger forekomsten af lav OCR tidskrævende brønde og kortere varighed af stabil OCR. For det andet er det vigtigt at foretage en kvalitetskontrol af og sikre, at de eksperimentelle betingelser mellem forskellige prøver er lignende (pH, ilt niveauer). Endelig, en kritisk trin er at vælge den korrekte algoritme til at analysere prøverne. Som vi har påvist, givet standard AKOS algoritme en vildledende og sommetider modstridende beregning i prøver, der forbruges ilt ved høje priser13. Vi understreger derfor betydningen af at kontrollere de rå data for iltindholdet og sammenligne den deraf følgende OCR.
I øjeblikket, er der flere begrænsninger med denne teknik. Ved stuetemperatur, maskinen varmer op til 31 ° C (dette er den minimale måle temperatur mens maskinen er ved stuetemperatur), som kan repræsentere en stress tilstand for flyve hoveder25. Dette kan dog løses ved at placere maskinen i et koldt rum, hvorved målingerne ved 25 ° C og dermed uden en mulig varmestress at flyve hoveder. Seneste rapport har vist placere maskinen på 11 ° C, således at OCR-optagelse af fluer på 25 ° C21. Ikke desto mindre bør flyve hoved adskillelse udføres ved stuetemperatur. Derudover temperatursvingninger gør det udfordrende at kontrollere pH-ændringer og derfor er det stærkt anbefales at teste virkningen af fysiologiske betingelser/narkotika på OCR ved hjælp af lignende eksperimentelle opsætninger. Derudover er bidrag af iltforbrug af ikke-mitokondrie-uafhængige mekanismer endnu ikke etableret26. Ved hjælp af forskellige respiratorisk hæmmere, der er effektiv i flyve hoveder, ville det være muligt at etablere sådanne ikke-mitokondrie ilt forbrug satser.
Det er bemærkelsesværdigt, at forskellige pattedyr maladies er karakteriseret ved ændringer i energimetabolisme. Blandt dem sygdomme, der er karakteriseret ved enten metaboliske reduktion såsom Alzheimers sygdom eller metaboliske rewiring som kræft. Det er interessant, anvendes KDAC hæmmere for både Alzheimers sygdom og kræft behandling27. De præcise mekanismer, af hvilke KDAC hæmmere er at opnå den terapeutiske aspekt er stadig uklart, understøtter data fra vores teknik roman forestillingen om, at sådanne hæmmere kan modulere stofskifte.
I Resumé er denne metode værdifuld for måling samlede iltforbrug satser i vivo og mere præcist viser narkotika effekter på generelle stofskifte, som kan blive overset i isolerede mitochondrier protokoller12. For eksempel, har resultaterne fra denne metode, snarere end tidligere teknikker, impliceret roman indsigter for alder-associerede metaboliske ufleksibilitet på KDAC behandling. Mens yderligere arbejde er nødvendigt at optimere de eksperimentelle betingelser for flyve hoveder, kombinationen af vores teknik og egner sig analysen kan føre til yderligere udredning af mitokondrie-aktivitet i forbindelse med hele levende væv.

Regulerede metaboliske aktivitet er afgørende for overlevelsen af celler og sunde funktion af en væv. Dereguleret metaboliske aktivitet har udstrakt grad vist sig at være knyttet til debut og progression af forskellige maladies1. For eksempel, lavere metaboliske aktivitet var tidligere beskrevet i neurodegenerative sygdomme som Alzheimers og alder-associerede hukommelse nedskrivninger2,3. Derudover menes mitokondriel dysfunktion at være kausalt involveret i den aldrende proces4,5. På den anden side var højere mitokondrie og metaboliske priser beskrevet i kræft celler6, hvor brugen af mitokondrie hæmmere reduceret tumordannelse7.
En udlæsning af metaboliske aktivitet er ilt forbrugssats (OCR) af mitokondrier. Interessant, denne type af udlæsning er primært fremstillet af isolerede mitochondrier eller celler, således at størstedelen af hvad er beskrevet i litteraturen er hovedsagelig baseret på en udlæsning, der ikke ligner den fysiologiske tilstand. Der er dog flere ulemper til denne teknik. Først kan protokollen af mitokondrie isolation potentielt skade dens integritet8, som kan være en relevant artefakt, når man sammenligner mitokondrier isoleret fra unge versus ældre væv9. Derudover isolation processen er lang og kan resultere i tab af relevante protein posttranslationelle modifikationer, der regulerer mitokondrie funktion9,10,11. Desuden har det vist at isolerede mitochondrier ikke konsekvent repræsenterer hele væv stofskifte12,13. Sådanne cellulære biologisk kompleksitet kan ses som, "hele er større end summen af dens dele", dvs, mitokondrier kan vise forskellige stofskifte inde i en kompleks celle sammenlignet med deres stofskifte når isoleret.
Mens celler kan tilbyde en bedre OCR udlæsning end isolerede mitochondrier, kan celle til celle kommunikation inden for rammerne af en hel væv gå tabt. F.eks. den metaboliske aktivitet af neuroner i hjernen er stærkt afhængige af den metaboliske aktivitet af omkringliggende gliaceller14. Som sådan, kan om oprettelse af nye teknikker til at undersøge OCR i hele væv eller hele organismer bevise mere indsigtsfulde for debut og progression af forskellige lidelser.
For nylig, er der opstået nye teknikker for at løse disse problemer og aktiverer måling af OCR fra hele væv, segment eller levende organismer. For eksempel, rapporteret værk ilt måling fra en Bille flyvningen muskler ved hjælp af en permeabilized fiber tilgang med en respirometer15. Nye maskiner til mikro-respirometri tillader måling af OCR pancreas Holme16,17. Derfor, det er blevet rapporteret, at denne teknologi muliggør måling af OCR fra hele orme18 og Zebra fisk19. Men tilstedeværelsen af fordøjelsessystemet barrieren kan udgøre en udfordring til at teste forskellige stoffer i forbindelse med OCR ændringer. Interessant, har de seneste rapporter fra Neville og kolleger vist en ny teknik til måling af enkelt drosophila larve hjernen med godt plade20,21.
I denne undersøgelse, har vi brugt en lignende setup hen til muliggøre måling af hele OCR fra hele levende og ikke-mobile Drosophila22. Denne teknik tilbyder også en sekundær fordel i at måle virkningerne af forskellige narkotika på metaboliske aktivitet i en hel segment, uden at skulle passere gennem fordøjelsessystemet barriere13,22. Eksempelvis blev det tidligere påvist, at direkte indsprøjtning af lysin deacetylase hæmmer (KDACi), en medicin menes for at ændre epigenetiske mekanisme i hjernen, resulterede i en forbedret erindringer dannelse23. Men ved hjælp af vores nye teknik, vi opdagede, at KDAC hæmning resulterede i en hurtig stigning af OCR, som kan være en medvirkende faktor i sig selv i den neuronal aktivitet. Vores protokol giver en enkel og roman metode til at vurdere virkningerne af forskellige stoffer, genetisk manipulation eller fysiologiske stater (sygdom, aldring) på OCR i forbindelse med en hele hovedet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:763px;" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8644</td>
			<td style="width:335px;">D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XF assay Medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">817500</td>
			<td>Dissolved in XF assay buffer</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Seahorse XF24/e24 analyzer</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XF24/e24 Extracellular Assay Kit</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">100850-001</td>
			<td>Cartridge</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XF24/e24 Islet Capture Microplates</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">101122-100</td>
			<td>Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Seahorse Capture Screen Insert Tool</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td>101135-10</td>
			<td>Insertor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:93px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">821,472</td>
			<td>Petri dish 92 x 16 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring and interpreting oxygen consumption rates in whole fly head segments

Regulerede metaboliske aktivitet er afgørende for den normale funktion af levende celler. Ændret metabolisk aktivitet hænger faktisk aarsagsforbundet med progression af kræft, diabetes, neurodegeneration og aldring at nævne nogle få. For eksempel, er ændringer i mitokondrie-aktivitet, cellens stofskifte kraftcenter, blevet karakteriseret i mange sådanne sygdomme. Generelt, ilt forbrug satser af mitochondrier blev betragtet som en pålidelig udlæsning af mitokondrie-aktivitet og målinger i nogle af disse undersøgelser var baseret på isolerede mitochondrier eller celler. Sådanne forhold kan ikke repræsentere kompleksitet en hel væv. For nylig, har vi udviklet en ny metode, der muliggør dynamisk måling af ilt forbrug satser fra hele isolerede flyve hoveder. Ved at benytte denne metode, har vi indspillet lavere ilt forbrug satser hele hovedet-segmentet i unge versus alderen fluer. For det andet har vi opdaget at lysin deacetylase hæmmere hurtigt ændre iltforbrug i hele hovedet. Vores nye teknik kan derfor støtte i afdække nye egenskaber af forskellige stoffer, som kan påvirke stofskifte. Vores metode kan desuden give en bedre forståelse af metaboliske adfærd i en eksperimentel opsætning, der mere ligner fysiologiske stater.

Evnen til at optage høj kvalitet OCR måling bygger på centrering hoved midt i nettet (figur 1). Dette er vigtigt for den XF24 maskine, der har en ret lille ilt sensor plet i forhold til den nyere XFe24 maskine hvorpå sensoren er større. Som tidligere vist, centrering vise lederne en stabil OCR for mindst 20 på hinanden følgende målinger i unge fluer13.
Et kritisk aspekt for at bruge maskinerne er at anvende den korrekte analyse. Det anbefales at kontrollere ilt niveauer under forsøgene. Hver 2 min måling er opdelt i 10 sub målinger (flåter). En brønd med 16 sund hoveder viser normalt en oxygen partialtrykket (pO2) 140-170 (mmHg) for det første kryds. I det første eksempel sammenlignede vi unge vs midlife flyve hoveder (figur 2A og 2B). Mens ilt-niveauet falder hurtigere i den midaldrende hoveder, den observerede forskel er små (figur 2A). Derudover er rækken af ilt niveauer ens mellem betingelser, med 165 under den første kryds til 120 under den sidste kryds. I sådanne tilfælde er det bedre at bruge AKOS algoritme til automatisk for at generere den OCR (pmol/min)2, som pålideligt spejler ilt niveau drop mellem unge versus midlife hoveder (figur 2B). Af note vælger programmet analyse af maskinen automatisk AKOS algoritme.
Men, baseret på vores observationer, automatisk ved hjælp af AKOS algoritme kan give, vildledende, hvis ikke modsatte resultater af den korrekte OCR. Disse artefakter kan genereres i betingelserne for en meget tidskrævende prøve, som når iltmangel13,22. For eksempel, ændrer tilsætning af natrium butyrat (SB), en KDAC-hæmmer, forbigående dynamikken i ilt niveauer (figur 3A). Der henviser til, at køretøjets forskellige betjeningsapparater vise støt niveauer af ilt i løbet af de første og sidste tæger, forårsager SB tilføjelse en betydelig og forbigående slip af ilt niveauer i disse flåter (figur 3A). SB i sig selv ændrer ikke iltindholdet i baggrunden brønde, hvor ingen hoveder er tilføjet (data ikke vist). Data, der understøtter den forestilling, at SB øger oxygen forbrug. Som samlingen af første kryds er forsinket (12 sekunder, indtil den første kryds er indspillet i fasen for måling) er det første datapunkt allerede lavere i SB behandlet brønde. Derfor er det vanskeligt at fange de tidlige ændringer i forbrug af ilt efter tilsætning af denne HDAC-hæmmer. Derudover reduceres iltindholdet i SB behandlet prøver til allerede lave niveauer (iltmangel) som angivet af indsamlingen af de sidste tæger. På iltmangel bremse ledere deres iltforbrug i de sidste tæger (figur 3A). Fordi AKOS beregningen tager højde for alle tæger og ignorerer en anoxiske stat, genererer det en vildledende OCR. Faktisk, den ikke-normaliserede AKOS baseret OCR niveauer Vis lille ændring på injektion (stiplet linje) af port en (Veh/SB) (figur 3B).
Normalisere OCR niveauer til før injektion måling baseret på AKOS afslører meget lignende niveauer af OCR, før og efter indsprøjtning af port A, som ikke understøtter ilt niveau ændringer (figur 3A). Under disse omstændigheder, er den faste algoritme, som nærmere modeller/ligner de OCR og ilt niveau ændringer anbefales (figur 3 c). Derfor, den faste algoritme baseret normaliseret målingen afslører en øget OCR på SB behandling (figur 3 c).
En ulempe med den nye maskine er fravær af det faste algoritme. Derfor, i eksperimenter hvor meget tidskrævende prøve/behandling bruges, anbefales det at beregne OCR målinger manuelt, og beregning af fald i ilt niveau pr. gang for først 3-5 flåter i hver måling.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig1.jpg"> Figur 1 . Et eksempel på en brønd, der indeholder 16 én - uge gamle hoveder af mandlige fluer. Hovederne er centreret under en netto og flydende i medierne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig2.jpg"> Figur 2 . Et repræsentativt eksempel på OCR måling sammenligning mellem én - uge gamle flyve hoveder (unge) og fire - uge gamle flyve hoveder (midaldrende). A iltindholdet er vist for tre separate målinger; hver 2 min måling er opdelt i ti sub målinger (flåter). (B) en kvantificering af (A). De første og sidste tæger er lignende, selv om den midaldrende prøve er lidt lavere. En kvantificering af hældningen af fald i ilt niveauer bruges til at generere OCR niveauer. Som tidligere beskrevet22er OCR af midterste alderen fluer 10% - 15% højere end unge fluer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig3.jpg"> Figur 3 . Et eksempel på ændringen af OCR af natrium butyrat (SB) i unge flyve hoveder. (A) iltindholdet optaget fra syv målinger efter tilsætning af 15 mM SB. Den stiplede linje markerer injektion af lægemiddel (eller køretøj) fra port A. Af note, mens ilt niveauer af flåter 1 og 10 være uændret i kontrolgruppen (blå), niveauer af ilt under disse flåter er forbigående (seks målinger efter injektion) reduceret i SB behandlet prøver (orange). Fald i ilt niveauer er stærkt reduceret i løbet af de sidste tæger SB behandlet prøver. N = 3 pr. gruppe (B) [venstre] ikke-normaliseret OCR niveauer beregnes fra AKOS algoritme. Beregningen viser forkert lignende niveauer af OCR før og efter indsprøjtning af SB ved port A. [højre] normalisering af OCR til målingen før injektion af port A. (C) [venstre] «Faste» algoritmeberegning af (A) viser den ikke-normaliserede OCR . Her, repræsenterer OCR tæt den forbigående stigning i ilt forbrug af hoveder på SB behandling; [Højre] Normalisering af OCR til målingen før injektion af port A. fejllinjer angive S.E.M. i alle grafer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments at JoVE.com

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling af ændringer i stofskifte er centrale for forståelse progression af forskellige sygdomme og aldring. Vi præsenterer her, en ny teknik til at måle hele hovedet iltforbrug, der nærmere ligner det fysiologiske tilstand og kan støtte i afslører nye lægemidler, der ændrer mitokondrie-aktivitet.

Måling og fortolke ilt forbrug satser helt flyve hoved segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i stofskiftet område såsom, hvordan metabolisk aktivitet er ændret under aldringsprocessen. Den største fordel ved denne teknik er brugen af et intakt kropssegment, som har data, der ligner den naturlige og fysiologiske tilstand i forhold til den klassiske mitokondrielle isolation. Demonstration af proceduren vil være Anuroop og Annika, en grad studerende i mit laboratorium.For at starte protokollen skal du tænde for maskinen en time, før du starter forsøget, så der er tilstrækkelig tid til at nå den ønskede temperatur og forblive stabil. Vælg derefter længden af patronkalibreringen og den ønskede temperatur under administrationstilstand i softwareopsætningen under administrationstilstand. Indtast derefter følgende protokol:Afhængigt af det eksperimentelle design skal du tilføje injektionstrin fra port A til D efter et valgt måletrin.For at kontrollere kvaliteten og bestemmelsen af den basale OCR, justere protokollen for mindst tre målecyklusser, før du indstiller injektionen af det første lægemiddel via port A.Pre-kalibrere patronen en dag, eller mindst fire timer før test, ved at tilføje 1,0 milliliter kaliber til hver brønd, og placere sensorpatronen på toppen af pladen. Dæk patronen med Parafilm, hvis den er planlagt til at fugte i mere end 24 timer for at forhindre fordampning. Opbevar patronen ved 37 grader Celsius uden CO2, natten over.Dernæst sikre de eksperimentelle lægemidler er grundigt opløst i frisk medium, plus 2,5% glukose. Mål og juster pH-slutningen af lægemidlet opløsning til pH af køretøjet ved den ønskede temperatur. Pipette lægemidlet løsning i det tildelt injektion port.Læg derefter patronen i maskinen, og begynd kalibreringen. Juster frisklavede medier plus 2,5% glukose til den ønskede pH med en normal HCl. Derefter forberede en isboks og placere en metalplade på isen.Åbn pakken med øjepladen. Nedsænk net i medierne med 16 millimeter petriskål. Opsaml et net med indsatseren, og få indsatseren til at stå op ved siden af mikroskopet.Føj en lille dråbe medier til det net, der er fastgjort til inserteren. Derefter bedøve fluerne ved at placere dem på en iskold metalplade. Brug afcepenser, grib maven på en flue og nedsænkes i medierne i en petriskål under mikroskopet.Brug et andet par scecet, forsigtigt fjerne hovedet af fluen. Placer hovedet i midten af nettet fastgjort til indsatseren, og kontroller, at hovedet er nedsænket i medierne. Fjern overflødig væske, før centrering af hovederne for at undgå at miste hoveder, mens du placerer dem i brønden.Når der er 16 hoveder på nettet, centrere dem. Brug indsatseren til at placere nettet i brønden. Sørg for, at hovederne er fanget under nettet og langsomt tilføje 700 mikroliter af medier plus 2,5% glukose.Sørg for, at de tomme brønde, som bruges til baggrund, også indeholder et net med 700 mikroliter af bufferen plus 2,5% glukose. Kontroller brøndene for luftbobler under nettene via mikroskopet. Pipette forsigtigt op og ned ved hjælp af en en millimeter pipette til at fjerne eventuelle bobler.Hold hovederne centreret for en pålidelig OCR læsning. Tilsæt derefter pladen til maskinen og start målingen. Fjern patronen i slutningen af protokollen.Bekræft visuelt, at der ikke er synlige rester i portfyldningerne. Kassér derefter patronen og pladen, hvis hovederne ikke skal bruges til proteinekstraktion. Husk at se på ilt og pH-niveauer, for at opdage eventuelle unormale brønde forud for analysen.Desuden er det vigtigt at vælge den passende beregning af iltforbruget baseret på iltniveauerne. Ved udførelsen af protokollen, blev det observeret, at ilt niveauer af midlife hoveder faldt hurtigere end unge flyve hoveder. Når iltniveauerne er det samme mellem forholdene, er det bedre at bruge AKOS-algoritmen til automatisk at generere iltforbruget eller OCR, som pålideligt afspejler iltniveauets ændringer under en måling mellem unge versus midlife-hoveder.Tilsætning af natrium butyrat, eller SB, en KDAC-hæmmer, transiently ændrer dynamikken i iltniveauer. Mens køretøjets kontrol har et stabilt iltindhold under den første og sidste flåt, medfører SB-tilsætning en betydelig og forbigående dråbe iltindholdet i disse flåter. Fordi AKOS beregning overvejer alle flåter og ignorerer en anoxisk tilstand, det genererer en vildledende OCR, som observeret i den ikke-normaliserede AKOS-baserede OCR niveauer, som viser lidt forandring ved injektion af port A.The faste algoritme, som mere tæt modeller og ligner OCR og iltniveau ændringer, afslører en øget OCR på SB behandling.Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at arbejde med to personer sammen for at sikre en relativ kort tid til at forberede en enkelt plade. Efter denne procedure, andre biokemiske metoder, såsom Western Blot og massespektrometri kan udføres for at besvare spørgsmål i forbindelse med molekylære mekanismer, for eksempel dem, der moderate metaboliske ændringer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifikation af små molekyler-bindende proteiner i en Native Cellular Environment af live-cell fotoaffinitetsmærkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Måling af mitokondrie iltforbrug i Permeabilized fibre fra Drosophila bruger minimale mængder af væv

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetriske metode til måling af jernindhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Prøveudtagning og forbehandling af tand emalje carbonat for stabil Carbon og Oxygen isotop analyser

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein oprensning og kinetisk analyse via ilt elektrode til at studere DesB Dioxygenase aktivitet og hæmning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Måling af leveren mitokondrie iltforbrug og Proton lækage kinetik for at anslå mitokondrie Respiration i Holsten malkekvæg

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteom-analyse af menneskers makrofag polarisering Under en lav ilt miljø

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Udtryk og rensning af nuklease-fri oxygen Scavenger Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Påvisning af totalreaktive iltarter i klæbende celler med 2',7'-Dichlordihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Måling af proteinomsætningshastigheder i senescerende og ikke-delende dyrkede celler med metabolisk mærkning og massespektrometri

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...