Name: measuring and interpreting oxygen consumption rates in whole fly head segments
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments at JoVE.com

Wir danken Andreas Ladurner, Carla Margulis und ihre Teams für umfangreiche experimentelle Unterstützung. Wir danken für ihre Kommentare in das Manuskript Caitlin Ondracek. Wir möchten danken, dass Sofia Vikstrom half uns bei der Festlegung der frühen Phasen dieser Technik. Wir danken auch können Sanderhoff für ihre technische Hilfe. LB wird vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (Infrafrontier Grant 01KX1012) finanziert. SP wurde durch ein AXA Research Fund postdoctoral Fellowship und der NSFC (Grant-Nummer 81870900) finanziert. AVV wird durch die QBM finanziert.

(1) Instrumenten-Aufbereitung
Hinweis: Für dieses Experiment haben wir eine Seepferdchen XF24 Gerät mit"Inselchen" verwendet. Der Betrieb der Technik nutzt verschiedene Zyklen mischen, warten und Messungen sowie die Möglichkeit der Messung Fach Substanzen hinzu.
<ol><li>Schalten Sie die Maschine rechtzeitig vor Beginn des Experiments, so dass es genügend Zeit, um die gewünschte Temperatur zu erreichen und stabil bleiben.</li>
	<li>Wählen Sie in der Software-Setup (Admin-Modus), die Länge der Patrone Kalibrierung (hier 20 min gewählt wurde) und die gewünschte Temperatur. Hinweis: Während Mitochondrien oder Säugetier-Gewebe Messungen in der Regel durchgeführt werden, bei 37 ° C, fliegen Sie Kopf ambient Temperatur liegt bei 25 ° C, aber die Ergebnisse der Messungen bei 31 ° C veröffentlicht. Wir haben 31 ° C, da es sich bei dem Gerät bei Raumtemperatur die niedrigste Temperaturstufe. Um Temperaturen von 25 ° C oder darunter zu erreichen, stellen Sie die Maschine in einem kühleren Raum oder bei 11 ° C als kürzlich veröffentlichten21.</li>
	<li>In der Software verwenden das folgende Protokoll: 3 min. mischen – 2 min warten – 2 min messen. Abhängig von den experimentellen Design Injektion Schritte hinzufügen von Ports A-D nach einer gewählten Messschritt.<ol>
<li>Warten Sie für die Qualitätsprüfung und Bestimmung des basalen OCR mindestens drei Messzyklen vor der Injektion der ersten Medikament über Port A. Für eine detaillierte Chronik des Protokolls, siehe Referenz Becker Et al. 13 .
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Patrone Vorbereitung
<ol><li>Pre-kalibrieren Sie die Patrone einen Tag (oder mindestens 4 h) vor dem testen. 1,0 mL der Kalibrator (pH 7,4) in jede Vertiefung und der Sensorkassette oben auf der Platte und Speicher bei 37 ° C ohne CO2 für Übernachtung oder bis 72 h. vermeiden die Verdunstung der Patrone mit Parafilm wenn es länger als 24 h hydratisiert werden.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass die experimentelle Medikamente gut vor Beginn des Experiments in das Medium (frisches Medium + 2,5 % Glukose) aufgelöst werden.</li>
	<li>Messen Sie und Regeln Sie den pH-Wert der Droge-Lösung für den pH-Wert des Fahrzeugs auf der gewünschten Temperatur keinen pH-Unterschied bei Injektion von Drogen zu vermeiden.</li>
	<li>Pipettieren der Wirkstofflösung an seinen zugewiesenen Injektion-Port. Z. B. 77 μL für Port A zu einem 01:10 Verdünnung in eine 770 μl Lösung und anschließend 85 μL für Port B.</li>
	<li>Laden Sie die Patrone in die Maschine und beginnen Sie Kalibrierung.</li>
</ol>3. Platte Vorbereitung
Hinweis: Es wird dringend empfohlen, dass zwei Personen gleichzeitig die Platte vorbereiten. Die Dauer der Vorbereitung einer Platte pro zwei Personen erfordern ~ 45-60 Minuten.
<ol><li>Passen Sie die frisch zubereiteten Medien + 2,5 % Glukose zu den gewünschten pH-Wert mit 1 N HCl. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert nicht betroffen ist der Temperatur ändert.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Eisbox und legen Sie eine Metallplatte auf dem Eis.</li>
	<li>Öffnen Sie das Inselchen Platte (24-Well-Platte) Paket und Tauchen Sie die Netze in einer Petrischale (92 x 16 mm) mit den Medien.</li>
	<li>Sammeln Sie ein Netz mit der Inserter (ein kleines Instrument, das im Netz fest in den Brunnen stellt) zu und haben Sie die Inserter stehen neben dem Mikroskop. Einen kleinen Tropfen der Medien an das Netz angeschlossen, der Inserter.</li>
	<li>Die fliegen (eine Woche oder 4 Wochen alten Kanton Männer wurden hier verwendet) zu betäuben, indem Sie die fliegen auf die eiskalte Metallplatte.</li>
	<li>Mit Pinzette, schnappen Sie sich den Bauch einer Fliege und Tauchen Sie ihn in den Medien in einer Petrischale unter die Lupe genommen.</li>
	<li>Mit einer zweiten Zange, entfernen Sie vorsichtig den Kopf der Fliege. Legen sie in der Mitte das Netz an der Inserter befestigt und stellen Sie sicher, dass der Kopf in den Medien eingetaucht ist.</li>
	<li>Zentrieren Sie die Köpfe, wenn es 16 davon im Netz gibt. Entfernen Sie überflüssige Flüssigkeit vor der Zentrierung der Köpfe, um Verlust der Köpfe zu verhindern, indem man sie in den Brunnen. Hinweis: 16 fliegen Köpfe wurden verwendet, da diese Zahl ausreichende und stabile Daten innerhalb einer angemessenen Frist der Platte Vorbereitung während der Methode Einrichtung gab.</li>
	<li>Mit der Inserter, legen Sie das Netz in den Brunnen. Stellen Sie sicher, dass die Köpfe unter dem Netz gefangen sind. Fügen Sie langsam 700 μl Medien + 2,5 % Glukose (Abbildung 1). Wiederholen Sie den Vorgang für jede der Vertiefungen. Hinweis: 20 Brunnen von fliegen Kopf Proben und 4 leere Brunnen für Hintergrund-Kalibrierung pro Platte wird empfohlen. Stellen Sie sicher, dass leere Brunnen auch ein Netz mit 700 μl Puffer + 2,5 % Glukose enthalten.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Brunnen für die Luftblasen unter der Netze über das Mikroskop. Pipettieren sanft rauf und runter mit einer 1 mL pipettieren, um eventuell Luftblasen zu entfernen. Halten Sie die Köpfe für eine zuverlässige OCR lesen zentriert.</li>
	<li>Die Maschine der Platte hinzu und starten Sie die Messung.</li>
</ol>4. Analyse der OCR-Messungen
<ol><li>Am Ende des Protokolls entfernen Sie die Patrone.</li>
	<li>Als einen Qualitäts-Check beobachten Sie alle sichtbaren Reste in der Port-Füllungen. Die Patrone und Platte (Option 1) zu verwerfen, wenn die Köpfe nicht für Protein-Extraktion, z. B. verwendet werden (siehe Option 2).</li>
	<li>Extrahieren Sie die Kalkulationstabelle Dateien und Qualität kontrollieren jeden gut für Sauerstoff und pH Niveaus. Stellen Sie sicher, dass der Hintergrund Brunnen keine OCR zeigen und Sauerstoffgehalt stabil sind.<ol>
<li>Verwenden Sie einen Algorithmus für die Datenanalyse, von denen einige in der jeweiligen Software gewählt werden können. Verwendung der AKOS Algorithmus für OCR Werte2 wenn das Angebot an Sauerstoff während der gesamten Messung zwischen der ersten und letzten Tick Ebenen (= Sub-Messung) ähneln zwischen zwei biologischen Proben und der Sauerstoffgehalt der letzten Ticks sind nicht niedriger als 95) MmHg) (die Köpfe OCR ist deutlich niedriger bei diesem Sauerstoffgehalt), (Abbildung 2).</li>
		<li>Einige Bedingungen werden dazu führen, dass die Probe um eine schnelle OCR zu generieren und möglicherweise niedriger Sauerstoffgehalt angezeigt, während die 1St Zecke bzw. in den letzten Tick (Anoxie) (Abb. 3A). Verwenden Sie in einem solchen Szenario eine Alternative Messverfahren wie die festen Algorithmus. Die OCR ist Anoxie aufgrund des niedrigen Sauerstoff in die Lösung stark reduziert. AKOS-Algorithmus ergibt als solche irreführende Lesungen. Hinweis: Die neuere Maschine fehlt den feste Algorithmus. Daher ist es bevorzugt, den gesamten Sauerstoff-Niveaus zu extrahieren und Plotten der Rate pro Zeit für die ersten 3-5 Zecken (Abbildung 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. (Option 2) biochemische Analyse des Segments Kopf
<ol><li>Die biochemische messen (Metaboliten, Proteom, etc.) Eigenschaften eines Kopfes Segments passen Sie die Laufzeit der Anforderung; jedoch ist es möglich, das Protokoll jederzeit abbrechen und entfernen die Platte.</li>
	<li>Sobald die Platte entfernt wird, verwenden Sie nicht geschärft Zange macht ein Loch in das Netz und entfernen es dadurch lösen die Köpfe zu schweben.</li>
	<li>Mit Hilfe einer 1 mL Pipettieren mit einem Schnitt Tipp und die Köpfe zu einem Fläschchen zu übertragen.</li>
	<li>Schnell verwerfen Sie den Puffer zu und Snap-Freeze die Köpfe in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie die Köpfe bei-80 ° C zur späteren Analyse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial diseases in man and mouse. 283 (5407), 1482-1488 (1999).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Cunnane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+fuel+metabolism,+aging,+and+Alzheimer's+disease.">Brain fuel metabolism, aging, and Alzheimer's disease.</a> Nutrition. 27 (1), 3-20 (2011).</li><li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li><li>Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+energetics+and+therapeutics.">Mitochondrial energetics and therapeutics.</a> Annual review of pathology. 5, 297-348 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mitochondrial+dysfunction+as+a+strategy+for+targeting+tumour+cells+in+metabolically+compromised+microenvironments.">Induction of mitochondrial dysfunction as a strategy for targeting tumour cells in metabolically compromised microenvironments.</a> Nature communications. 5, 3295 (2014).</li><li>Wheaton, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+inhibits+mitochondrial+complex+I+of+cancer+cells+to+reduce+tumorigenesis.">Metformin inhibits mitochondrial complex I of cancer cells to reduce tumorigenesis.</a> eLife. 3, e02242 (2014).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS one. 6 (3), e18317 (2011).</li><li>Baker, D. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Glycolysis+and+Mitochondrial+Respiration+in+a+Zebrafish+Model+of+Dravet+Syndrome.">Altered Glycolysis and Mitochondrial Respiration in a Zebrafish Model of Dravet Syndrome.</a> eNeuro. 3 (2), (2016).</li><li>Neville, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ex+vivo+method+for+measuring+whole+brain+metabolism+in+model+systems.">A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems.</a> Journal of neuroscience. 296, 32-43 (2018).</li><li>Neville, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Analysis+of+Drosophila+melanogaster+Larval+and+Adult+Brains.">Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Peleg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+extension+by+targeting+a+link+between+metabolism+and+histone+acetylation+in+Drosophila.">Life span extension by targeting a link between metabolism and histone acetylation in Drosophila.</a> EMBO reports. 17 (3), 455-469 (2016).</li><li>Peleg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice. 328 (5979), 753-756 (2010).</li><li>Drazic, A., Myklebust, L. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTP1B+controls+non-mitochondrial+oxygen+consumption+by+regulating+RNF213+to+promote+tumour+survival+during+hypoxia.">PTP1B controls non-mitochondrial oxygen consumption by regulating RNF213 to promote tumour survival during hypoxia.</a> Nature cell biology. 18 (7), 803-813 (2016).</li><li>Falkenberg, K. J., Johnstone, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+and+their+inhibitors+in+cancer,+neurological+diseases+and+immune+disorders.">Histone deacetylases and their inhibitors in cancer, neurological diseases and immune disorders.</a> Nature reviews. Drug discovery. 13 (9), 673-691 (2014).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Unsere neue Technik bietet einen neuartigen Ansatz um Stoffwechselveränderungen im Altern und Krankheit im Zusammenhang mit der gesamten fliegen Kopf Segmente22zu studieren. Die Methode kann auch angepasst werden, um die Auswirkungen von KDAC Natrium Butyrate auf Sauerstoffverbrauch zu untersuchen. Wie wir gezeigt haben, führen Lysin-Deacetlyase-Hemmer (HDACs/KDACs) OCR Veränderungen. Im Wesentlichen die Ziele solcher Inhibitoren normalerweise nicht in den Mitochondrien lokalisiert sind (diese Inhibitoren haben keine Auswirkungen auf die Klasse III Deacetylases, die Sirtuine)24, solche Medikamente konnten nur getestet auf eine mindestens Gewebe Ebene. In der Tat sind verschiedene Medikamente direkt an das Gehirn, also unter Umgehung möglich Bearbeitung/Änderung/Inaktivierung durch das Verdauungssystem injiziert. So steht Ihnen unsere Technik Roman Einblick, wie solche direkt Auswirkungen Medikamente Segment Kopf.
Es gibt mehrere wichtige Schritte. Zuerst, wie im Protokoll erwähnt, wir empfehlen Vorbereitung einer Platte unter einer Stunde mit zwei paar Hände, die Vorbereitung der Plattenrandes. Aus unserer Erfahrung sind die Qualität und Stabilität der OCR Messungen besser, wenn Sie in einer fristgerechten Weise vorbereitet. Wenn zu lange dauert, ist das Auftreten von niedrigen OCR raubend Brunnen sowie kürzere Dauer der stabilen OCR erhöht. Zweitens ist es wichtig, einen Qualitäts-Check durchzuführen und sicherzustellen, dass die experimentellen Bedingungen zwischen verschiedenen Proben sind ähnlich (pH-Wert, Sauerstoffgehalt). Schließlich ist ein entscheidender Schritt den korrekten Algorithmus zur Analyse der Proben auswählen. Wie wir gezeigt haben, ergab der Standardalgorithmus AKOS eine irreführende und manchmal gegensätzliche Berechnung in Proben, die bei hohen13Sauerstoff verbraucht. Deshalb betonen wir die Bedeutung der Überprüfung der unformatierten Daten für Sauerstoffgehalt und vergleicht die daraus resultierende OCR.
Derzeit gibt es mehrere Einschränkungen mit dieser Technik. Bei Raumtemperatur, die Maschine heizt bis zu 31 ° C (Dies ist die minimale Messtemperatur, während die Maschine bei Raumtemperatur), die ein Spannungszustand für die fliegen Köpfe25darstellen kann. Dies kann jedoch überwunden werden, indem die Maschine in einem kalten Raum, die Messungen bei 25 ° C ermöglichen und damit ohne eine mögliche Hitzestress zu fliegen Köpfe. Den letzten Bericht hat gezeigt, platzieren die Maschine bei 11 ° C, wodurch es OCR-Aufnahme von fliegen bei 25 ° C21. Dennoch sollte die Fliege Kopf Trennung bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Darüber hinaus Temperaturschwankungen machen es schwierig, Steuerungsänderungen pH-Wert und daher ist es dringend empfohlen, die Auswirkungen der physiologischen Bedingungen/Drogen auf OCR mit ähnlichen Versuchsaufbauten testen. Darüber hinaus wurde der Beitrag der Sauerstoffverbrauch durch mitochondriale-unselbständige Mechanismen etablierte26noch nicht. Durch die Verwendung verschiedener Atemwegserkrankungen Inhibitoren, die effizient in fliegen Köpfe, wäre es möglich, solche nicht mitochondriale Sauerstoff-Verbrauch zu etablieren.
Es ist bemerkenswert, dass verschiedenen Säugetiere Krankheiten durch Veränderungen im Energiestoffwechsel gekennzeichnet sind. Darunter sind Krankheiten, die durch entweder metabolische Reduktion wie Alzheimer oder metabolischen auszeichnen wie Krebs Neuverkabelung. Interessanterweise sind KDAC-Hemmer für die Behandlung von Alzheimer und Krebs27verwendet. Während die genauen Mechanismen, durch welche, die KDAC Inhibitoren den therapeutische Aspekt erreichen, unklar bleiben, unterstützt die Daten aus unserer Technik der neuartige Vorstellung, dass solche Inhibitoren Stoffwechsel modulieren können.
Zusammenfassend lässt sich sagen ist diese Methode wertvolle Messung insgesamt Sauerstoffverbrauch in Vivo Preise und mehr zeigt genau Drogenwirkungen auf allgemeinen Stoffwechsel, die in isolierten Mitochondrien Protokolle12übersehen werden kann. Zum Beispiel haben Ergebnisse, die von dieser Methode, sondern als bisherige Techniken, neue Einblicke für Alters-assoziierten metabolischen Inflexibilität bei KDAC Behandlung verwickelt. Zusätzliche Arbeit ist notwendig, optimieren die experimentellen Bedingungen für fliegen Köpfe, die Kombination von Technik und geeignete Analyse kann zur weiteren Aufklärung der mitochondrialen Aktivität im Rahmen des lebenden Gewebes führen.

Geregelten Stoffwechselaktivität ist essentiell für das Überleben der Zellen und gesunde Funktion eines Gewebes. Deregulierten Stoffwechselaktivität nachweislich ausgiebig mit der Entstehung und Progression von verschiedenen Krankheiten1verknüpft werden. Z. B. geringere Stoffwechselaktivität wurde zuvor beschrieben bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und altersassoziierter Speicher Beeinträchtigung2,3. Darüber hinaus ist mitochondriale Dysfunktion geglaubt, um der Alterung Prozess4,5ursächlich beteiligt sein. Auf der anderen Seite wurden höhere mitochondriale und metabolische Rate in Krebs Zellen6beschrieben wo der mitochondrialen Inhibitoren Tumorgenese7reduziert.
Ein Auslesen der Stoffwechselaktivität ist der Sauerstoff-Verbrauch (OCR) von Mitochondrien. Interessant ist, diese Art von Auslesen ergibt sich in erster Linie aus isolierten Mitochondrien oder Zellen, also die Mehrheit der was in der Literatur beschrieben basiert hauptsächlich auf einer Anzeige, die nicht den physiologischen Zustand ähneln. Es gibt jedoch einige Nachteile dieser Technik. Erstens kann das Protokoll der mitochondrialen Isolation möglicherweise seine Integrität8, beschädigen die relevanten Artefakt sein kann, beim Vergleich von Mitochondrien von jungen im Vergleich zu älteren Gewebe9isoliert. Darüber hinaus die Isolierung Prozess ist lang und Verlusten des entsprechenden Proteins posttranslationale Modifikationen die mitochondriale Funktion9,10,11Regeln führen kann. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass isolierte Mitochondrien nicht konsequent ganze Gewebe Stoffwechselraten12,13darstellen. Diese zellulären biologischen Komplexität als angesehen werden könnte, "das ganze ist mehr als die Summe seiner Teile", z. B. Mitochondrien zeigt möglicherweise an verschiedenen Stoffwechselraten innerhalb einer komplexen Zelle gegenüber ihre metabolische Rate, wenn Sie isoliert.
Während Zellen eine bessere OCR auslesen als isolierte Mitochondrien anbieten können, kann Zelle zu Zelle Kommunikation im Kontext des gesamten Gewebes verloren gehen. Beispielsweise ist die Stoffwechselaktivität der Nervenzellen im Gehirn, stark abhängig von der Stoffwechselaktivität der benachbarten Gliazellen14. Als solche erweisen zur Gründung neuer Techniken, um OCR im gesamten Gewebe oder ganze Organismen untersuchen mehr aufschlussreich für die Entstehung und Progression von verschiedenen Erkrankungen.
Vor kurzem sind neue Techniken entstanden, um diese Probleme anzugehen und ermöglichen die Messung von OCR von ganzen Gewebe, Segment oder Lebewesen. Beispielsweise berichtet eine neuere Arbeiten die Sauerstoffmessung aus einen Käfer-Flug-Muskel durch einen permeabilized Faser Ansatz mit einem Respirometer15. Neue Maschinen für Mikro-Respirometrie ermöglichen die Messung von OCR von pankreatischen kleinen Inseln16,17. Infolgedessen wurde berichtet, dass diese Technologie die Messung von OCR von ganzen Würmer18 und Zebrafisch19 ermöglicht. Jedoch kann das Vorhandensein der Verdauungs-Schranke zum Testen von verschiedenen Drogen im Zusammenhang mit OCR Veränderungen eine Herausforderung. Interessanterweise haben die jüngsten Berichte von Neville und Kollegen eine neue Technik zur Messung der einzelnen Drosophila Larve Gehirn mit dem well-Platte20,21gezeigt.
In dieser Studie haben wir ein ähnliches Setup verwendet, ermöglichen die Messung der gesamten OCR von lebenden und nicht-mobilen Drosophila22. Diese Technik bietet auch einen sekundäre Vorteil bei der Messung der Auswirkungen von verschiedenen Drogen auf metabolische Aktivität in ein ganzes Segment, ohne durch das Verdauungssystem Barriere13,22übergeben. Beispielsweise war es zuvor demonstrierte, dass Lysin Deacetylase Inhibitor (KDACi), Direkteinspritzung ein Medikament geglaubt, epigenetischer Mechanismus im Gehirn, führte zu einer verbesserten Erinnerungen Bildung23ändern. Jedoch durch unsere neuartige Technik, entdeckten wir, dass KDAC Hemmung zu einem raschen Anstieg der OCR führte, die möglicherweise ein Faktor allein in der neuronalen Aktivität. Unser Protokoll bietet eine einfache und neuartige Methode zur Bewertung der Auswirkungen der verschiedenen Medikamente, genetische Manipulation oder physiologischen Zuständen (Krankheit, Altern) auf OCR im Zusammenhang mit einen ganzen Kopf.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:763px;" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8644</td>
			<td style="width:335px;">D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XF assay Medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">817500</td>
			<td>Dissolved in XF assay buffer</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Seahorse XF24/e24 analyzer</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XF24/e24 Extracellular Assay Kit</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">100850-001</td>
			<td>Cartridge</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XF24/e24 Islet Capture Microplates</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">101122-100</td>
			<td>Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Seahorse Capture Screen Insert Tool</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td>101135-10</td>
			<td>Insertor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:93px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">821,472</td>
			<td>Petri dish 92 x 16 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring and interpreting oxygen consumption rates in whole fly head segments

Geregelten metabolische Aktivität ist wichtig für das normale Funktionieren der lebenden Zellen. In der Tat ist veränderte Stoffwechselaktivität kausal verbunden mit das Fortschreiten von Krebs, Diabetes, Neurodegeneration und Altern um nur einige zu nennen. Zum Beispiel wurden Veränderungen der mitochondrialen Aktivität, metabolische Kraftwerk der Zelle, bei vielen solchen Krankheiten charakterisiert. In der Regel die Sauerstoff-Verbrauch der Mitochondrien galten eine zuverlässige Anzeige der mitochondrialen Aktivität und Messungen in einigen dieser Studien stützten sich auf isolierte Mitochondrien oder Zellen. Solche Bedingungen können jedoch nicht die Komplexität des gesamten Gewebes dar. Vor kurzem haben wir eine neue Methode entwickelt, die es die dynamische Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen aus ganz isoliert fliegen Köpfe ermöglicht. Durch die Verwendung dieser Methode, verzeichneten wir niedrigerere Sauerstoff-Verbrauchsmengen des Segments ganzen Kopf bei jungen im Vergleich zu im Alter von fliegen. Zweitens haben wir entdeckt, dass Lysin Deacetylase Inhibitoren den Sauerstoffverbrauch in den ganzen Kopf schnell ändern. Unsere neuartige Technik kann daher bei Aufdeckung neuer Eigenschaften von verschiedenen Drogen, helfen die Stoffwechselrate auswirken können. Darüber hinaus kann unsere Methode ermöglichen ein besseres Verständnis der metabolischen Verhalten in einer Versuchsanordnung, die physiologische Zuständen eher ähnelt.

Die Möglichkeit, qualitativ hochwertige OCR Messung aufzunehmen stützt sich auf die Zentrierung der Kopf in der Mitte des Netzes (Abbildung 1). Dies ist wichtig für die XF24-Maschine, die hat einen eher kleine Sauerstoff-Sensor vor Ort im Vergleich zu den neueren XFe24-Maschine, in der der Sensor größer ist. Wie bereits gezeigt, Zentrierung die Köpfe einer stetigen OCR für mindestens 20 aufeinander folgenden Messungen in jungen fliegen13angezeigt.
Ein kritischer Aspekt bei der Verwendung der Maschinen ist die korrekte Analyse anwenden. Es wird empfohlen, die Sauerstoff-Niveaus während der Experimente zu überprüfen. Jede 2 min Messung gliedert sich in 10 Sub-Messungen (Zecken). Ein Brunnen mit 16 gesunde Köpfe zeigt in der Regel ein Sauerstoffpartialdruck (pO-2) von 140-170 (MmHg) für die erste Zecke. Im ersten Beispiel verglichen wir junge vs. midlife fliegen Köpfe (Abb. 2A und 2 b). Während der Sauerstoff in den mittleren Alters Köpfen schneller sinkt, der beobachtete Unterschied ist gering (Abbildung 2A). Darüber hinaus gleicht sich das Leistungsspektrum der Sauerstoffgehalt zwischen den Bedingungen, mit 165 während der ersten Tick auf 120 während der letzte Tick. In einem solchen Fall ist es vorzuziehen, AKOS Algorithmus zu verwenden, zum automatischen Generieren von OCR (Pmol/min)2, die zuverlässig den Sauerstoff Ebene Tropfen zwischen jungen versus midlife Köpfe (Abbildung 2 b) widerspiegelt. Der Hinweis wählt das Analyseprogramm von der Maschine automatisch den AKOS-Algorithmus.
Aber aufgrund unserer Beobachtungen, automatisch mit dem AKOS Algorithmus irreführend geben kann, wenn nicht Gegenteil ergibt sich für die richtige OCR. Diese Artefakte können unter den Bedingungen einer höchst raubend Probe die Anoxie13,22erreicht generiert werden. Beispielsweise ändert der Zusatz von Natrium Butyrate (SB), ein KDAC-Hemmer, vorübergehend die Dynamik des Sauerstoff-Niveaus (Abbildung 3A). Während der Fahrzeug-Kontrollen stetige Konzentrationen von Sauerstoff während der ersten und letzten Zecken anzuzeigen, verursacht SB Zusatz einen erheblichen und Transienten Tropfen der Sauerstoffgehalt in diese Zecken (Abbildung 3A). SB alleine ändert nichts an der Sauerstoffgehalt in den Hintergrund-Brunnen, wo keine Köpfe (Daten nicht gezeigt) hinzugefügt werden. Die Daten unterstützen die Vorstellung, dass SB Sauerstoffverbrauch steigt. Wie die Sammlung der ersten Tick (12 Sekunden verzögert wird, bis die erste Zecke in der Messphase aufgezeichnet wird) ist der erste Datenpunkt in der SB behandelt Wells bereits niedriger. Daher ist es schwierig, die frühen Veränderungen im Sauerstoff-Verbrauch nach dem Hinzufügen dieser HDAC-Inhibitor zu erfassen. Darüber hinaus werden der Sauerstoffgehalt in den SB behandelt Proben bereits niedrigen Niveau (Anoxie) reduziert, wie durch die Sammlung der letzten Ticks. Bei Sauerstoffmangel verlangsamen die Köpfe ihrer Sauerstoff-Verbrauch in den letzten Zecken (Abb. 3A). Da die AKOS-Berechnung alle Zecken berücksichtigt und einen anoxischen Zustand ignoriert, generiert es eine irreführende OCR. In der Tat basiert nicht normalisierte AKOS OCR Ebenen zeigen wenig Veränderung auf die Injektion (gestrichelte Linie) von Port ein (Veh/SB) (Abb. 3 b).
Normalisierung der OCR-Ebenen auf die Voreinspritzung Messung anhand der AKOS zeigt sehr ähnliche Niveaus der OCR vor und nach der Injektion von Port A, die die Sauerstoff Pegeländerungen (Abbildung 3A) nicht unterstützt. Unter diesen Umständen empfiehlt der feste Algorithmus, der eher Modelle/OCR und Sauerstoff Pegeländerungen ähnelt (Abbildung 3). Infolgedessen normalisiert die feste Algorithmus basiert Messung zeigt eine erhöhte OCR auf SB Behandlung (Abbildung 3).
Ein Nachteil mit der neuen Maschine ist das Fehlen des festen Algorithmus. Daher, in Experimenten wo sehr aufwendig Probenbehandlung/verwendet wird, es wird empfohlen, die OCR-Messungen manuell berechnen, und berechnen die Abnahme der Sauerstoff pro Zeit für das erste level 3-5 Zecken bei jeder Messung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig1.jpg"> Abbildung 1 . Ein Beispiel eines Brunnens mit 16 ein - Wochen alten Köpfe der männlichen fliegen. Die Köpfe sind zentriert unter einem Netz und schwebend in den Medien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig2.jpg"> Abbildung 2 . Ein repräsentatives Beispiel für OCR Messung Vergleich zwischen 1 - Wochen alten fliegen Köpfe (jung) und vier - Wochen alten fliegen Köpfe (mittleren Alters). (A) die Sauerstoffwerte sind für drei getrennte Messungen gezeigt; jede 2 min Messung gliedert sich in zehn Sub-Messungen (Zecken). (B) eine Quantifizierung von (A). Das Niveau der ersten und letzten Ticks sind ähnlich, obwohl die Ebenen der mittleren Alters Probe etwas niedriger sind. Eine Quantifizierung der Neigung der die Abnahme des Sauerstoffgehalts wird verwendet, um die OCR-Ebenen zu erzeugen. Wie zuvor beschrieben22ist die OCR der mittleren gealterten fliegen 10-15 % höher als junge fliegen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig3.jpg"> Abbildung 3 . Ein Beispiel für die Veränderung von OCR von Natrium Butyrat (SB) in jungen Köpfen fliegen. (A) Sauerstoff-Niveaus von sieben Messungen nach Zugabe von 15 mM SB aufgenommen. Die gestrichelte Linie markiert die Injektion des Medikaments (oder Fahrzeug) von Port A. Der Hinweis, während die Sauerstoffwerte von Zecken 1 und 10 in der Kontrollgruppe (blau), stabil bleiben die Konzentrationen von Sauerstoff während diese Zecken sind vorübergehend (sechs Messungen nach der Injektion) reduziert in den SB behandelt Proben (Orange). Darüber hinaus ist die Abnahme der Sauerstoff-Niveaus während der letzten Zecken SB behandelt Proben stark reduziert. N = 3 pro Gruppe (B) [Links] nicht normalisiert OCR Ebenen aus der AKOS-Algorithmus berechnet. Die Berechnung zeigt fälschlicherweise vergleichbarem OCR, vor und nach der Injektion von SB von Port A. [rechts] Normalisierung der OCR zur Messung vor der Injektion von Port A. (C) [Links] 'Fixed' Algorithmus Berechnung von (A) zeigt die nicht normalisierte OCR . Hier stellt die OCR eng die vorübergehenden Anstieg der Sauerstoffverbrauch der Köpfe auf SB Behandlung; [Rechts] Normalisierung der OCR zur Messung vor der Injektion des Hafens, die A. Fehler Balken zeigen die S.E.M in den Diagrammen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Messung der Veränderungen der Stoffwechselrate ist von zentraler Bedeutung für das Verständnis der Progression von verschiedenen Krankheiten und Alterung. Hier präsentieren wir Ihnen eine neuartige Technik zur Messung der ganzen Kopf Sauerstoffverbrauch, die mehr ähnelt die physiologische Zustand und kann Hilfe bei der Aufdeckung von neuer Medikamenten, die mitochondriale Aktivität ändern.

Messung und Interpretation von Sauerstoff-Verbrauch im ganzen fliegen Kopf Segmente

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Stoffwechselbereich zu beantworten, wie, wie metabolische Aktivität während des Alterungsprozesses verändert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung eines intakten Körpersegments, das Daten enthält, die dem natürlichen und physiologischen Zustand im Vergleich zur klassischen mitochondrialen Isolation sehr ähnlich sind. Demonstrieren das Verfahren werden Anuroop und Annika, eine Grad-Studentin in meinem Labor.Um das Protokoll zu beginnen, schalten Sie die Maschine eine Stunde vor Beginn des Experiments ein, damit genügend Zeit bleibt, um die gewünschte Temperatur zu erreichen und stabil zu bleiben. Wählen Sie dann im Software-Setup im Administrationsmodus die Länge der Patronenkalibrierung und die gewünschte Temperatur aus. Geben Sie dann das folgende Protokoll ein:Je nach versuchsweisem Entwurf fügen Sie nach einem ausgewählten Messschritt Injektionsschritte von den Ports A nach D hinzu.Um die Qualität und die Bestimmung des Basal-OCR zu überprüfen, stellen Sie das Protokoll für mindestens drei Messzyklen ein, bevor Sie die Injektion des ersten Medikaments über Port A. vorkalibrieren. Bedecken Sie die Patrone mit Parafilm, wenn sie für mehr als 24 Stunden hydratisiert werden soll, um Verdunstung zu verhindern. Lagern Sie die Patrone bei 37 Grad Celsius ohne CO2, über Nacht.Als nächstes stellen Sie sicher, dass die experimentellen Medikamente gründlich in frischem Medium gelöst werden, plus 2,5% Glukose. Messen und passen Sie den pH-Wert der Arzneimittellösung bei der gewünschten Temperatur auf den pH-Wert des Fahrzeugs an. Pipette die Medikament Lösung in es ist Injektionshafen zugeordnet.Dann laden Sie die Patrone in die Maschine und beginnen Sie mit der Kalibrierung. Frisch zubereitete Medien plus 2,5% Glukose mit einem normalen HCl auf den gewünschten pH-Wert einstellen. Als nächstes bereiten Sie eine Eiskiste vor und legen Sie eine Metallplatte auf das Eis.Öffnen Sie das Ösenplattenpaket. Tauchen Sie die Netze in Medien um 16 Millimeter Petrischale. Sammeln Sie ein Netz mit dem Inserter und lassen Sie den Inserter neben dem Mikroskop aufstehen.Fügen Sie dem Netz, das an den Einfügeer angeschlossen ist, einen kleinen Tropfen Medien hinzu. Dann befeuchten Sie die Fliegen, indem Sie sie auf eine eiskalte Metallplatte legen. Mit Zangen, greifen Sie den Bauch einer Fliege und tauchen Sie sie in die Medien in eine Petrischale unter dem Mikroskop.Entfernen Sie mit einem zweiten Zangenpaar vorsichtig den Kopf der Fliege. Platzieren Sie den Kopf in der Mitte des Netzes, das am Inserter befestigt ist, und überprüfen Sie, ob der Kopf in Medien eingetaucht ist. Entfernen Sie überflüssige Flüssigkeit, bevor Sie die Köpfe zentrieren, um Köpfe zu verlieren, während Sie sie in den Brunnen legen.Wenn es 16 Köpfe im Netz gibt, zentrieren Sie sie. Platzieren Sie das Netz mit dem Inserter in den Brunnen. Stellen Sie sicher, dass die Köpfe unter dem Netz gefangen sind und fügen Sie langsam 700 Mikroliter Medien plus 2,5% Glukose hinzu.Stellen Sie sicher, dass die leeren Brunnen, die für den Hintergrund verwendet werden, auch ein Netz mit 700 Mikroliter n des Puffers plus 2,5% Glukose enthalten. Überprüfen Sie die Brunnen auf Luftblasen unter den Netzen über das Mikroskop. Pipette sanft nach oben und unten mit einer ein Millimeter Pipette, um alle Blasen zu entfernen.Halten Sie die Köpfe zentriert für eine zuverlässige OCR-Lesung. Fügen Sie dann die Platte zur Maschine hinzu und starten Sie die Messung. Entfernen Sie am Ende des Protokolls die Patrone.Bestätigen Sie visuell, dass sich keine sichtbaren Reste in den Portfüllungen befinden. Als nächstes entsorgen Sie die Patrone und die Platte, wenn die Köpfe nicht für die Proteinextraktion verwendet werden sollen. Denken Sie daran, den Sauerstoff- und den pH-Wert zu betrachten, um vor der Analyse ungewöhnliche Brunnen zu erkennen.Darüber hinaus ist es wichtig, die geeignete Berechnung des Sauerstoffverbrauchs zu wählen, basierend auf dem Sauerstoffgehalt. Bei der Durchführung des Protokolls wurde beobachtet, dass der Sauerstoffgehalt der Midlife Heads schneller abfiel als junge Fliegenköpfe. Wenn der Bereich des Sauerstoffgehalts zwischen den Bedingungen ähnlich ist, ist es besser, den AKOS-Algorithmus zu verwenden, um automatisch die Sauerstoffverbrauchsrate zu erzeugen, oder OCR, die die Sauerstoffgehaltsänderungen während einer Messung zwischen jungen und Midlife Heads zuverlässig widerspiegelt.Die Zugabe von Natriumbutyrat, oder SB, einem KDAC-Hemmer, verändert vorübergehend die Dynamik des Sauerstoffgehalts. Während die Fahrzeugsteuerungen während der ersten und letzten Zecken einen konstanten Sauerstoffgehalt aufweisen, verursacht die SB-Zugabe einen erheblichen und vorübergehenden Rückgang des Sauerstoffgehalts in diesen Zecken. Da die AKOS-Berechnung alle Ticks berücksichtigt und einen anoxischen Zustand ignoriert, erzeugt sie eine irreführende OCR, wie sie in den nicht-normalisierten AKOS-basierten OCR-Werten beobachtet wird, die bei der Injektion von Port A wenig Veränderung zeigen.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, mit zwei Personen zusammen zu arbeiten, um eine relativ kurze Zeit zu gewährleisten, um eine einzelne Platte vorzubereiten. Nach diesem Verfahren können andere biochemische Methoden, wie Western Blot und Massenspektrometrie durchgeführt werden, um Fragen im Zusammenhang mit molekularen Mechanismen zu beantworten, zum Beispiel, die metabolische Veränderungen mäßigen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Forschung

Biochemie

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Ein kolorimetrischen Verfahren zur Messung der Eisengehalt in Pflanzen

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Probenahme und Vorbehandlung des Zahnschmelzes Carbonat für stabile Kohlenstoff und Sauerstoff-Isotopen-Analyse

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Messung der Leber mitochondriale Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik zur Abschätzung der mitochondrialen Atmung in Holstein Milchvieh

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteomic Analysen der menschlichen Makrophagen Polarisierung in einer sauerstoffarmen Umgebung

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies insgesamt in anhaftenden Zellen durch 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat-Färbung

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Messung von Proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten Zellen mit metabolischer Markierung und Massenspektrometrie

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...