Name: measuring and interpreting oxygen consumption rates in whole fly head segments
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments at JoVE.com

Ringraziamo Andreas Ladurner, Carla Margulis e le loro squadre per ampio supporto sperimentale. Ringraziamo Caitlin Ondracek per i suoi commenti sul manoscritto. Vorremmo ringraziare Sofia Vikstrom per ci ha aiutato a stabilire le prime fasi di questa tecnica. Ringraziamo anche può Sanderhoff per il suo aiuto tecnico. LB è finanziato dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (Infrafrontier grant 01KX1012). SP è stato finanziato da una borsa di studio post-dottorato di AXA Research Fund e NSFC (concessione numero 81870900). AVV è finanziato dal QBM.

1. strumento Preparazione
Nota: Per questo esperimento, abbiamo utilizzato un dispositivo di Seahorse XF24 con "piastre dell'isolotto". L'operazione della tecnica utilizza diversi cicli di miscelazione, in attesa e misure, nonché la possibilità di aggiungere sostanze al vano di misurazione.
<ol><li>Accendere la macchina ben prima dell'inizio dell'esperimento in modo che vi sia tempo sufficiente per raggiungere la temperatura desiderata e rimanere stabile.</li>
	<li>L'installazione del software (modalità di amministrazione), scegliere la lunghezza della taratura cartuccia (qui, è stato scelto 20 min) e la temperatura desiderata. Nota: Mentre i mitocondri o misurazioni di tessuti di mammiferi di solito sono trasportate fuori a 37 ° C, temperatura ambiente testa Vola è 25 ° C ma sono pubblicati risultati di misurazioni a 31 ° C. Abbiamo usato 31 ° C, poiché questa è l'impostazione di temperatura più bassa per il dispositivo a temperatura ambiente. Per raggiungere temperature di 25 ° C o inferiore, posizionare la macchina in una stanza più fredda o 11 ° c, come recentemente pubblicato21.</li>
	<li>Nel software, utilizzare il seguente protocollo: 3 min – 2 min attesa – min 2 misura di miscelazione. A seconda del design sperimentale, aggiungere iniezione passi da porte A-D dopo un passo di misura prescelta.<ol>
<li>Per controllo di qualità e la determinazione di OCR basale, attendere almeno tre cicli di misura prima di iniettare la droga prima via porta A. Per una cronologia temporale dettagliata del protocollo, vedere riferimento Becker et al. 13 .
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cartuccia preparazione
<ol><li>Pre-calibrare la cartuccia in un giorno (o almeno 4 ore) prima di test. Aggiungere 1,0 mL di calibratore (pH 7.4) in ciascun pozzetto e inserire la cartuccia di sensore in cima alla piastra e il negozio a 37 ° C senza CO2 per una notte o fino a 72 h. impedire l'evaporazione della cartuccia con parafilm se è essere idratata per più di 24 h.</li>
	<li>Garantire che i farmaci sperimentali sono ben sciolto nel medio (medium fresco + 2,5% glucosio) prima dell'inizio dell'esperimento.</li>
	<li>Misurare e regolare il pH della soluzione droga al pH del veicolo alla temperatura desiderata per evitare qualsiasi differenza di pH durante l'iniezione di droga.</li>
	<li>Dispensare la soluzione di droga alla sua porta di iniezione allocato. Ad esempio, uso 77 μL per porta A raggiungere un 01:10 diluizione in una soluzione di 770 μL e successivamente 85 μL per porta B.</li>
	<li>Caricare la cartuccia nella macchina e iniziare la calibrazione.</li>
</ol>3. preparazione
Nota: Si raccomanda vivamente che due persone contemporaneamente, preparare la piastra. La durata della preparazione di un piatto per due persone può richiedere ~ 45-60 minuti.
<ol><li>Regolare la preparata media + 2,5% glucosio al pH desiderato con 1 N HCl. Accertarsi che il pH non è influenzato da variazioni di temperatura.</li>
	<li>Preparare una scatola di ghiaccio e mettere una placca di metallo sul ghiaccio.</li>
	<li>Aprire il pacchetto di piastra (la piastra a 24 pozzetti) isolotto e immergere le reti in una capsula Petri (92 mm x 16 mm) con i media.</li>
	<li>Raccogliere una rete con l'inseritore (un piccolo strumento che pone la rete saldamente nel pozzo) e hanno l'inseritore stand up next to al microscopio. Aggiungere una piccola goccia di supporto alla rete collegata all'inseritore caricamento.</li>
	<li>Anestetizzare le mosche (una settimana o 4 settimane vecchio Cantone maschi sono stati usati qui) inserendo le mosche sulla targhetta metallica e ghiacciata.</li>
	<li>Usando il forcipe, afferrare l'addome di una Mosca e immergetelo in media in una capsula Petri sotto il microscopio.</li>
	<li>Utilizzando un secondo paio di pinze, rimuovere delicatamente la testa della Mosca. Mettere in mezzo la rete collegata all'inseritore caricamento e verificare che la testa è immerso nei media.</li>
	<li>Centrare le teste quando ci sono 16 di loro in rete. Rimuovere il liquido superfluo prima di centrare le teste per evitare la perdita delle teste mentre inserendoli nel pozzo. Nota: 16 teste volare sono state utilizzate come questo numero ha dato dati stabili e sufficienti entro un tempo ragionevole di preparazione durante la definizione del metodo.</li>
	<li>Utilizzando l'inseritore, posizionare la rete nel pozzo. Assicurarsi che le teste sono intrappolate sotto la rete. Lentamente aggiungere 700 μL di media + 2,5% glucosio (Figura 1). Ripetere il processo per ciascuno dei pozzi. Nota: 20 pozzi di volano testa campioni e 4 pozzi vuoti per la calibrazione di sfondo per piastra è consigliato. Assicurarsi che pozzi vuoti contengono anche una rete con 700 µ l di buffer + glucosio 2,5%.</li>
	<li>Verifica i pozzetti per bolle d'aria sotto le reti tramite il microscopio. Pipettare delicatamente su e giù utilizzando una pipetta da 1 mL per rimuovere tutte le bolle. Tenete la testa centrata per un affidabile lettura OCR.</li>
	<li>Aggiungere la piastra alla macchina e avviare la misurazione.</li>
</ol>4. analisi delle misurazioni OCR
<ol><li>Alla fine del protocollo, è necessario rimuovere la cartuccia.</li>
	<li>Come un controllo di qualità, osservare eventuali avanzi visibili nelle otturazioni porta. Smaltire la cartuccia e la piastra (opzione 1) se i capi non devono essere utilizzati per l'estrazione proteica, ad esempio, (vedere opzione 2).</li>
	<li>Estrarre i file di foglio di calcolo e verifica della qualità ogni bene per i livelli di ossigeno e di pH. Assicurarsi che i pozzi di sfondo non mostrano OCR e che i livelli di ossigeno sono stabili.<ol>
<li>Utilizzare un algoritmo per l'analisi dei dati, alcuni dei quali possono essere scelti nel rispettivo software. Utilizzare l'algoritmo AKOS per OCR valori2 se la gamma di ossigeno livelli durante la misura intera, tra il primo e l'ultimo tick (= Sub-misura) sono simili tra due campioni biologici e i livelli di ossigeno delle zecche ultimo non sono inferiori a 95 ( mmHg) (OCR delle teste è nettamente inferiore a questo livello di ossigeno), (Figura 2).</li>
		<li>Alcune condizioni causano il campione generare un OCR rapido e potrebbero essere visualizzato più bassi livelli di ossigeno durante il 1 tickst e/o nell'ultimo segno di graduazione (anossia) (Figura 3A). In tale scenario, utilizzare un metodo alternativo di misurazione quali l'algoritmo fisso. In anossia, l'OCR è notevolmente ridotto a causa di bassi livelli di ossigeno nella soluzione. Come tale, l'algoritmo AKOS produce letture fuorvianti. Nota: La più recente macchina manca l'algoritmo fisso. Pertanto, è preferibile estrarre i livelli di ossigeno totale e tracciare la tariffa a tempo per i primi 3-5 zecche (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. (opzione 2) analisi biochimica del segmento di testa
<ol><li>Per misurare la biochimica (metaboliti, proteoma, ecc.) proprietà di un segmento di testa, regolare la fase di esecuzione per il requisito; Tuttavia, è possibile interrompere il protocollo in qualsiasi momento e rimuovere la piastra.</li>
	<li>Una volta rimossa la piastra, è possibile utilizzare forcipe non affilato per fare un buco nella rete e rimuoverla liberando le teste in float.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta da 1 mL con un taglio punta e trasferire le teste di un flaconcino.</li>
	<li>Rapidamente scartare il buffer e le teste snap-congelamento in azoto liquido. Conservare le teste a-80 ° C per le analisi future.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial diseases in man and mouse. 283 (5407), 1482-1488 (1999).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Cunnane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+fuel+metabolism,+aging,+and+Alzheimer's+disease.">Brain fuel metabolism, aging, and Alzheimer's disease.</a> Nutrition. 27 (1), 3-20 (2011).</li><li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li><li>Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+energetics+and+therapeutics.">Mitochondrial energetics and therapeutics.</a> Annual review of pathology. 5, 297-348 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mitochondrial+dysfunction+as+a+strategy+for+targeting+tumour+cells+in+metabolically+compromised+microenvironments.">Induction of mitochondrial dysfunction as a strategy for targeting tumour cells in metabolically compromised microenvironments.</a> Nature communications. 5, 3295 (2014).</li><li>Wheaton, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+inhibits+mitochondrial+complex+I+of+cancer+cells+to+reduce+tumorigenesis.">Metformin inhibits mitochondrial complex I of cancer cells to reduce tumorigenesis.</a> eLife. 3, e02242 (2014).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS one. 6 (3), e18317 (2011).</li><li>Baker, D. J., Peleg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+Modeling+of+Mitochondrial+Metabolism+Dysregulation+during+Aging.">Biphasic Modeling of Mitochondrial Metabolism Dysregulation during Aging.</a> Trends in biochemical sciences. 42 (9), 702-711 (2017).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation. 327 (5968), 1000-1004 (2010).</li><li>Baeza, J., Smallegan, M. J., Denu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Dynamics+of+Protein+Acetylation+in+Mitochondria.">Mechanisms and Dynamics of Protein Acetylation in Mitochondria.</a> Trends in biochemical sciences. 41 (3), 231-244 (2016).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers.">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li><li>Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., de Angelis, M. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Analysis+of+Drosophila+melanogaster+Larval+and+Adult+Brains.">Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (138), (2018).</li><li>Peleg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+extension+by+targeting+a+link+between+metabolism+and+histone+acetylation+in+Drosophila.">Life span extension by targeting a link between metabolism and histone acetylation in Drosophila.</a> EMBO reports. 17 (3), 455-469 (2016).</li><li>Peleg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice. 328 (5979), 753-756 (2010).</li><li>Drazic, A., Myklebust, L. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTP1B+controls+non-mitochondrial+oxygen+consumption+by+regulating+RNF213+to+promote+tumour+survival+during+hypoxia.">PTP1B controls non-mitochondrial oxygen consumption by regulating RNF213 to promote tumour survival during hypoxia.</a> Nature cell biology. 18 (7), 803-813 (2016).</li><li>Falkenberg, K. J., Johnstone, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+and+their+inhibitors+in+cancer,+neurological+diseases+and+immune+disorders.">Histone deacetylases and their inhibitors in cancer, neurological diseases and immune disorders.</a> Nature reviews. Drug discovery. 13 (9), 673-691 (2014).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

La nostra nuova tecnica offre un nuovo approccio per studiare i cambiamenti metabolici nell'invecchiamento e malattia nel contesto dell'intero tragitti testa22. Il metodo può essere adatto anche per studiare l'impatto del butirrato del sodio KDAC sul consumo di ossigeno. Come abbiamo dimostrato, inibitori di deacetlyase di lisina (HDACs/KDACs) provocare i cambiamenti di OCR. Essenzialmente, come gli obiettivi di tali inibitori sono normalmente non localizzati nei mitocondri (questi inibitori non impatto la deacetilasi di classe III, le sirtuine)24, tali farmaci potrebbero essere testati solo su un minimo livello del tessuto. Infatti, vari farmaci sono iniettati direttamente al cervello, aggirando così possibile elaborazione/modifica/inattivazione dal sistema digestivo. Come tale, la nostra tecnica offre romanzo spaccato di come tali droghe direttamente impatto il segmento di testa.
Ci sono diversi passaggi critici. In primo luogo, come indicato nel protocollo, si consiglia di preparare un piatto meno di un'ora, con due paia di mani preparando la piastra. Dalla nostra esperienza, la qualità e la stabilità delle misurazioni OCR sono migliori se preparati in modo tempestivo. Quando tenuto troppo a lungo, l'avvenimento basso pozzi che richiede OCR sta aumentando, come pure di durata più breve di OCR stabile. In secondo luogo, è importante effettuare un controllo di qualità e garantire che le condizioni sperimentali tra vari campioni sono simili (pH, livelli di ossigeno). Infine, un passo fondamentale è scelta dell'algoritmo corretto per analizzare i campioni. Come abbiamo dimostrato, l'algoritmo AKOS predefinito ha reso un calcolo fuorviante e a volte opposto in campioni che consuma ossigeno alle tariffe alta13. Pertanto, sottolineiamo l'importanza di verificare i dati grezzi per i livelli di ossigeno e confrontando l'OCR risultante.
Attualmente, ci sono diverse limitazioni con questa tecnica. A temperatura ambiente, la macchina si riscalda fino a 31 ° C (questa è la temperatura di misurazione minima mentre la macchina è a temperatura ambiente), che può rappresentare uno stato di stress per le teste volare25. Questo, tuttavia, può essere superato mettendo la macchina in una stanza fredda, che permetterà misurazioni a 25 ° C e quindi senza uno stress termico le testine di volare. Recente rapporto ha dimostrato ponendo la macchina a 11 ° C, consentendo in tal modo la registrazione di OCR di mosche a 25 ° C21. Tuttavia, la separazione di testa Vola dovrebbe essere eseguita a temperatura ambiente. Inoltre, le fluttuazioni di temperatura lo rendono difficile da cambiamenti di pH di controllo e pertanto si consiglia vivamente di testare l'impatto di condizioni fisiologiche/droghe su OCR utilizzando configurazioni sperimentali simili. Inoltre, il contributo del consumo di ossigeno da meccanismi non-mitocondriale-indipendente non è ancora stato stabilito26. Utilizzando vari inibitori respiratori che sono efficienti nel volare teste, sarebbe possibile stabilire tali tassi di consumo di ossigeno non mitocondriale.
È interessante nota che varie malattie nei mammiferi sono caratterizzati da alterazioni nel metabolismo energetico. Fra loro sono malattie che sono caratterizzate da una riduzione metabolica come il morbo di Alzheimer o metabolici ricablaggio come il cancro. È interessante notare che, KDAC inibitori sono usati per il trattamento del morbo di Alzheimer ed il cancro27. Mentre i meccanismi precisi di cui KDAC inibitori stanno raggiungendo l'aspetto terapeutico rimangono poco chiari, i dati dalla nostra tecnica supportano la nozione di romanzo che tali inibitori possono modulare il metabolismo.
In sintesi, questo metodo è utile per misurare il consumo di ossigeno nel complesso i tassi in vivo e visualizza più accuratamente gli effetti della droga sul metabolismo generale, che può essere trascurata nei mitocondri isolati protocolli12. Ad esempio, risultati ottenuti da questo metodo, piuttosto che tecniche precedenti, sono implicati comprensioni novelle per età-collegata di inflessibilità metabolica previo trattamento di KDAC. Mentre il lavoro supplementare è necessario per ottimizzare le condizioni sperimentali per volano teste, la combinazione della nostra tecnica e analisi adeguati può portare a ulteriore delucidazione dell'attività mitocondriale nel contesto di tessuti viventi intero.

Regolamentata l'attività metabolica è essenziale per la sopravvivenza delle cellule e la funzione sana di un tessuto. Attività metabolica deregolamentato ha dimostrato ampiamente di essere collegato all'inizio e la progressione di varie malattie1. Ad esempio, minore attività metabolica è stata precedentemente descritta nelle malattie neurodegenerative come l'Alzheimer e danno età-collegato di memoria2,3. Inoltre, la disfunzione mitocondriale è creduta per essere causalmente coinvolti in invecchiamento processo4,5. D'altra parte, più alti tassi metabolici e mitocondriali sono stati descritti in cancro cellule6, dove l'uso di inibitori mitocondriali ridotta tumorigenesi7.
Una lettura di attività metabolica è il tasso di consumo di ossigeno (OCR) dei mitocondri. Interessante, questo tipo di lettura è ottenuto principalmente da mitocondri isolati o cellule, così la maggior parte di ciò che è descritto nella letteratura si basa principalmente su una lettura che non assomiglia a stati fisiologici. Tuttavia, ci sono diversi inconvenienti a questa tecnica. In primo luogo, il protocollo di isolamento mitocondriale possa potenzialmente danneggiare la sua integrità8, che potrebbe essere un manufatto pertinente quando si confrontano i mitocondri isolati dai giovani contro vecchi tessuti9. Inoltre, il processo di isolamento è lungo e potrebbe causare perdita di modifiche di posttranslational rilevanti proteine che regolano la funzione mitocondriale9,10,11. Inoltre, è stato dimostrato che i mitocondri isolati non rappresentano costantemente intero tessuto tassi metabolici12,13. Tale complessità biologica cellulare potrebbe essere visto come, 'il tutto è maggiore della somma delle sue parti', cioè, i mitocondri possono visualizzare diversi tassi metabolici all'interno di un complesso cellulare rispetto al loro tasso metabolico quando isolato.
Mentre le cellule possono offrire una migliore lettura OCR di mitocondri isolati, la comunicazione tra cellule nel contesto di un intero tessuto potrebbe perdersi. Ad esempio, nel cervello, l'attività metabolica dei neuroni dipende fortemente l'attività metabolica delle vicine cellule gliali14. Come tale, che istituisce nuove tecniche per studiare OCR nell'intero tessuto o interi organismi può rivelarsi più penetranti per l'insorgenza e la progressione di vari disturbi.
Recentemente, sono emerse nuove tecniche per affrontare questi problemi e consentire la misura di OCR dall'intero tessuto, segmento o gli organismi viventi. Ad esempio, un recente lavoro ha riferito la misurazione di ossigeno da un muscolo di volo beetle utilizzando un approccio di permeabilized fibra con un respirometro15. Nuove macchine per micro-respirometry consentono la misura di OCR di isolotti pancreatici16,17. Di conseguenza, è stato segnalato che questa tecnologia consente la misurazione di OCR da intero vermi18 e pesce Zebra19. Tuttavia, la presenza della barriera digestiva può proporre una sfida per testare i vari farmaci nel contesto delle alterazioni di OCR. Interessante, i rapporti recenti di Neville e colleghi hanno indicato una nuova tecnica per la misurazione del cervello della larva della drosofila singolo con la piastra ben20,21.
In questo studio, abbiamo utilizzato una configurazione simile per consentire la misurazione della intera OCR da vivente complesso e non mobile Drosophila22. Questa tecnica offre anche un vantaggio secondario a misurare l'impatto di varie droghe su attività metabolica in un intero segmento, senza dover passare attraverso il sistema digestivo barriera13,22. Ad esempio, è stato precedentemente dimostrato che iniezione diretta dell'inibitore delle deacetilasi di lisina (KDACi), un farmaco creduto di alterare il meccanismo epigenetico nel cervello, ha provocato un miglioramento ricordi formazione23. Tuttavia, utilizzando la nostra tecnica innovativa, abbiamo scoperto che l'inibizione di KDAC ha provocato un rapido aumento di OCR, che può essere un fattore che contribuisce di per sé nell'attività neuronale. Il nostro protocollo fornisce un metodo semplice e romanzo per valutare l'impatto di vari farmaci, manipolazioni genetiche o stati fisiologici (malattia, invecchiamento) su OCR nel contesto di tutta la testa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:763px;" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8644</td>
			<td style="width:335px;">D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XF assay Medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">817500</td>
			<td>Dissolved in XF assay buffer</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Seahorse XF24/e24 analyzer</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XF24/e24 Extracellular Assay Kit</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">100850-001</td>
			<td>Cartridge</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XF24/e24 Islet Capture Microplates</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">101122-100</td>
			<td>Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Seahorse Capture Screen Insert Tool</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td>101135-10</td>
			<td>Insertor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:93px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">821,472</td>
			<td>Petri dish 92 x 16 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring and interpreting oxygen consumption rates in whole fly head segments

Regolamentata l'attività metabolica è essenziale per il normale funzionamento delle cellule viventi. Infatti, attività metabolica alterata causale è collegato con la progressione del cancro, il diabete, neurodegenerazione e invecchiamento per citarne alcuni. Per esempio, cambiamenti nell'attività mitocondriale, powerhouse metabolica delle cellule, sono stati caratterizzati in molti tali malattie. Generalmente, i tassi di consumo di ossigeno dei mitocondri sono stati considerati una lettura affidabile di attività mitocondriale e misure in alcuni di questi studi si basavano su mitocondri isolati o cellule. Tuttavia, tali condizioni non possono rappresentare la complessità di un intero tessuto. Recentemente, abbiamo sviluppato un nuovo metodo che consente la misurazione dinamica dei tassi di consumo di ossigeno da teste volare intero isolate. Utilizzando questo metodo, abbiamo registrato più bassi tassi di consumo di ossigeno del segmento tutta la testa nella giovane contro invecchiato mosche. In secondo luogo, abbiamo scoperto che gli inibitori di deacetylase lisina alterano rapidamente il consumo di ossigeno in tutta la testa. La nostra tecnica novella pertanto può aiutare nella scoprendo nuove proprietà di varie droghe, che possono incidere tassi metabolici. Inoltre, il nostro metodo può dare una migliore comprensione del comportamento metabolico in un'installazione sperimentale che più assomiglia stati fisiologici.

La capacità di registrare misura OCR di alta qualità si basa sul centraggio testa nel mezzo la rete (Figura 1). Questo è importante per la macchina di XF24, che ha un sensore di ossigeno piuttosto piccola chiazza rispetto alle macchine della XFe24 più recenti in cui il sensore è grande. Come precedentemente indicato, centraggio le teste visualizzare un OCR costante per almeno 20 misurazioni consecutive in mosche giovani13.
Un aspetto critico dell'utilizzo delle macchine è quello di applicare l'analisi corretta. Si raccomanda di controllare i livelli di ossigeno durante gli esperimenti. Ogni misurazione 2 min è suddiviso in 10 sotto-misurazioni (zecche). Un pozzo con 16 teste sane Mostra in genere una pressione parziale di ossigeno (pO2) di 140-170 (mmHg) per il primo segno di spunta. Nel primo esempio, abbiamo confrontato il giovane vs midlife teste volare (Figura 2A e 2B). Mentre i livelli di ossigeno scendono più rapidamente nelle testine di mezza età, la differenza osservata è piccola (Figura 2A). Inoltre, la gamma dei livelli di ossigeno è simile tra le condizioni, con 165 durante il primo segno di spunta a 120 durante l'ultimo segno di spunta. In tal caso, è preferibile utilizzare l'algoritmo AKOS per generare automaticamente l'OCR (pmol/min)2, che rispecchia in modo affidabile la goccia livello di ossigeno tra giovani contro teste di mezza età (Figura 2B). Da notare, il programma di analisi dalla macchina sceglie automaticamente l'algoritmo AKOS.
Tuttavia, in base alle nostre osservazioni, automaticamente utilizzando l'algoritmo AKOS può dare fuorvianti, se non opposto risultati per l'OCR corretta. Tali manufatti possono essere generati in condizioni di un campione altamente richiede che raggiunge anossia13,22. Ad esempio, l'aggiunta del butirrato del sodio (SB), un inibitore KDAC, transitoriamente cambia la dinamica dei livelli di ossigeno (Figura 3A). Considerando che i comandi del veicolo visualizzano livelli costanti di ossigeno durante il prime e l'ultima zecche, SB aggiunta provoca un calo considerevole e transitorio dei livelli di ossigeno in questi segni di graduazione (Figura 3A). SB di per sé non altera i livelli di ossigeno nei pozzetti sfondo, dove nessun teste vengono aggiunti (dati non mostrati). I dati sostegno la nozione che SB aumenta il consumo di ossigeno. Come la raccolta del primo tick è ritardata (12 secondi fino a quando il primo segno di spunta viene registrato in fase di misurazione) il primo punto di dati è già inferiore nei pozzetti SB trattati. Di conseguenza, è difficile catturare i primi cambiamenti nel consumo di ossigeno dopo l'aggiunta di questo inibitore HDAC. Inoltre, i livelli di ossigeno nei campioni trattati SB sono ridotti ai livelli già bassi (anossia) come indicato dall'insieme dei segni di graduazione ultimi. All'anossia, le teste di rallentano il consumo di ossigeno nell'ultimo Tick (Figura 3A). Poiché il calcolo di AKOS prende in considerazione tutte le zecche e ignora uno stato anossico, genera un OCR fuorviante. Infatti, il AKOS non normalizzato basato Visualizza livelli OCR piccolo cambiamento al momento dell'iniezione (linea tratteggiata) della porta (Veh/SB) (Figura 3B).
Normalizzazione dei livelli di OCR per la misurazione di pre-iniezione basato sul AKOS rivela livelli molto simili di OCR prima e dopo l'iniezione del Porto A, che non supporta le modifiche del livello di ossigeno (Figura 3A). In queste circostanze, l'algoritmo fisso, che modelli/assomiglia più da vicino i cambiamenti di livello OCR e ossigeno è consigliato (Figura 3). Di conseguenza, l'algoritmo fisso basata normalizzata rivela misura un OCR aumentato previo trattamento di SB (Figura 3).
Un inconveniente con la nuova macchina è l'assenza dell'algoritmo fisso. Pertanto, negli esperimenti dove viene utilizzato il altamente consumando campione per trattamenti e massaggi, si raccomanda di calcolare manualmente le misurazioni di OCR, e calcolare la diminuzione di ossigeno livello a tempo per i primi 3-5 zecche in ogni misurazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig1.jpg"> Figura 1 . Un esempio di un pozzo contenente una - settimana-vecchie 16 teste di mosche maschi. Le teste sono centrato sotto una rete e galleggianti nei media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig2.jpg"> Figura 2 . Un esempio rappresentativo di OCR di misurazione comparazione tra 1 settimana di vita volare teste (giovane) e quattro - settimana-vecchie volare teste (Evo). (A) i livelli di ossigeno sono indicati per tre misurazioni separate; ogni misurazione 2 min è suddiviso in dieci sotto-misurazioni (zecche). (B) una quantificazione di (A). I livelli delle zecche prime e l'ultimo sono simili, anche se i livelli del Medioevo campione sono leggermente inferiori. Una quantificazione del versante della diminuzione del livello di ossigeno è utilizzata per generare i livelli di OCR. Come descritto in precedenza22, l'OCR di mosche invecchiati centrale è 10% - 15% superiore al giovane mosche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig3.jpg"> Figura 3 . Un esempio di alterazione dell'OCR di butirrato del sodio (SB) in giovani teste volare. (A) ossigeno livelli registrati da sette misure dopo l'aggiunta di 15 mM SB. La linea tratteggiata segna l'iniezione del farmaco (o veicoli) da Porto A. Di nota, mentre i livelli dell'ossigeno di segni di graduazione 1 e 10 rimangano stabili nel gruppo di controllo (blu), i livelli di ossigeno durante queste zecche sono transitoriamente (sei misurazioni dopo l'iniezione) ridotto nei campioni trattati SB (arancione). Inoltre, la diminuzione nei livelli di ossigeno è notevolmente ridotto durante l'ultima zecche di SB trattati campioni. N = 3 per gruppo (B) [sinistra] Non-normalizzato OCR livelli calcolati dall'algoritmo AKOS. Il calcolo Mostra livelli analoghi di OCR in modo errato prima e dopo l'iniezione di SB da Porto a. [destra] normalizzazione di OCR per la misurazione prima dell'iniezione di porta A. (C) [sinistra] 'Fixed' algoritmo calcolo di (A) mostrare l'OCR non normalizzato . Qui, l'OCR strettamente rappresenta l'aumento transitorio nell'uso di ossigeno delle teste previo trattamento di SB; [Destra] Normalizzazione di OCR per la misurazione prima dell'iniezione di porta barre di errore r. indicare lo s.e.m. in tutti i grafici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Alterazioni nei tassi metabolici di misurazione è fondamentale per comprendere la progressione di varie malattie e invecchiamento. Qui, presentiamo una nuova tecnica per misurare il consumo di ossigeno tutta la testa che maggiormente assomiglia lo stato fisiologico e può essere di aiuto nel rivelare nuovi farmaci che modificano l'attività mitocondriale.

Misurare e interpretare i tassi di consumo di ossigeno in tutto Vola testa segmenti

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del metabolismo come, come l'attività metabolica viene alterata durante il processo di invecchiamento. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'uso di un segmento corporeo intatto che ha dati che assomigliano molto allo stato naturale e fisiologico rispetto al classico isolamento mitocondriale. A dimostrare la procedura saranno Anuroop e Annika, una studentessa laureata nel mio laboratorio.Per iniziare il protocollo, accendere la macchina un'ora prima di iniziare l'esperimento in modo che ci sia tempo sufficiente per raggiungere la temperatura desiderata e rimanere stabili. Quindi, nella configurazione del software, in modalità di amministrazione, scegliere la lunghezza della calibrazione della cartuccia e la temperatura desiderata. Quindi, immettere il seguente protocollo:A seconda del progetto sperimentale, aggiungere passaggi di iniezione dalle porte A a D dopo un passaggio di misurazione scelto.Per verificare la qualità e la determinazione dell'OCR basale, regolare il protocollo per almeno tre cicli di misurazione prima di impostare l'iniezione del primo farmaco tramite la porta A.Pre-calibrare la cartuccia un giorno, o almeno quattro ore prima del test, aggiungendo 1,0 millilitri di calibante a ciascun pozzo, e posizionare la cartuccia del sensore sopra la piastra. Coprire la cartuccia con Parafilm se è prevista l'idratazione per più di 24 ore per evitare l'evaporazione. Conservare la cartuccia a 37 gradi Celsius senza CO2, durante la notte.Successivamente, assicurarsi che i farmaci sperimentali siano completamente sciolti in mezzo fresco, più il 2,5% di glucosio. Misurare e regolare il pH della soluzione farmacologica al pH del veicolo alla temperatura desiderata. Pipettare la soluzione farmacologica nella porta di iniezione assegnata.Quindi caricare la cartuccia nella macchina e iniziare la calibrazione. Regolare i supporti preparati al momento più il 2,5% di glucosio al pH desiderato con un HCl normale. Quindi, preparare una ghiacciaia e posizionare una piastra metallica sul ghiaccio.Aprire il pacchetto di lastre oculari. Immergere le reti nei media di una piastra di Petri di 16 millimetri. Raccogliere una rete con l'insertore e fare in modo che l'inserter si alimenterà accanto al microscopio.Aggiungere una piccola goccia di supporto alla rete attaccata all'insertore. Quindi, anestetizza le mosche posizionandole su una piastra metallica ghiacciata. Usando le forcep, afferrare l'addome di una mosca e immergerlo nei media in una piastra di Petri al microscopio.Usando un secondo paio di forcep, rimuovere delicatamente la testa della mosca. Posizionare la testa al centro della rete attaccata all'insertore e verificare che la testa sia immersa nei supporti. Rimuovere il fluido superfluo prima di centrare le teste per evitare di perdere la testa mentre le si posiziona nel pozzo.Quando ci sono 16 teste in rete, centrale. Utilizzando l'inserter, posizionare la rete nel pozzo. Assicurarsi che le teste siano intrappolate sotto la rete e aggiungere lentamente 700 microlitri di supporti più il 2,5% di glucosio.Assicurarsi che i pozzi vuoti, utilizzati per lo sfondo, contengano anche una rete con 700 microlitri del tampone più il 2,5% di glucosio. Controllare i pozzi per le bolle d'aria sotto le reti tramite il microscopio. Pipetta delicatamente su e giù utilizzando una pipetta di un millimetro per rimuovere eventuali bolle.Mantieni le teste centrato per una lettura OCR affidabile. Quindi aggiungere la piastra alla macchina e avviare la misurazione. Alla fine del protocollo, rimuovere la cartuccia.Verificare visivamente che non vi siano avanzi visibili nelle otturazioni delle porte. Successivamente, scartare la cartuccia e la piastra se le teste non devono essere utilizzate per l'estrazione di proteine. Ricordarsi di guardare l'ossigeno e i livelli di pH, al fine di rilevare eventuali pozzi anomali prima dell'analisi.Inoltre, è importante scegliere l'appropriato calcolo del tasso di consumo di ossigeno, in base ai livelli di ossigeno. Dopo aver eseguito il protocollo, è stato osservato che i livelli di ossigeno delle teste di mezza età sono diminuiti più velocemente delle giovani teste di mosca. Quando l'intervallo dei livelli di ossigeno è simile tra le condizioni, è meglio utilizzare l'algoritmo AKOS per generare automaticamente il tasso di consumo di ossigeno, o OCR, che rispecchia in modo affidabile i cambiamenti del livello di ossigeno durante una misurazione tra teste giovani e di mezza età.L'aggiunta di butirato di sodio, o SB, un inibitore del KDAC, cambia transitoriamente la dinamica dei livelli di ossigeno. Mentre i comandi del veicolo mostrano livelli costanti di ossigeno durante la prima e l'ultima zecca, l'aggiunta di SB provoca una notevole e transitoria caduta dei livelli di ossigeno in queste zecche. Poiché il calcolo AKOS considera tutte le zecche e ignora uno stato anossico, genera un OCR fuorviante, come osservato nei livelli OCR non normalizzati basati su AKOS, che mostrano pochi cambiamenti nell'iniezione della porta A.L'algoritmo fisso, che modella più da vicino e assomiglia ai cambiamenti del livello di OCR e ossigeno, rivela un aumento dell'OCR sul trattamento SB.Quando si tenta questa procedura, è importante lavorare insieme con due persone al fine di garantire un breve periodo di tempo per preparare una singola piastra. Seguendo questa procedura, altri metodi biochimici, come western Blot e spettrometria di massa possono essere eseguiti per rispondere a domande relative ai meccanismi molecolari, ad esempio quelli che moderano le alterazioni metaboliche.

Research

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Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

L&#39;identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

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