Name: measuring and interpreting oxygen consumption rates in whole fly head segments
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments at JoVE.com

우리는 안드레아스 Ladurner, 칼라 수와 광범위 한 실험적인 지원에 대 한 자신의 팀 감사합니다. 원고에 그녀의 의견에 감사 케이 틀린 Ondracek 하 고. 우리는이 기술의 초기 단계에서 우리를 돕고 소피아 Vikstrom 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 그녀의 기술 도움 수 있습니다 Sanderhoff을 감사합니다. 파운드는 독일 연방 교육 및 연구 (Infrafrontier 그랜트 01KX1012)에 의해 자금이 다. SP는 AXA 연구 기금 박사 친교와 NSFC (보조금 번호 81870900)에 의해 투자 되었다. AVV는 QBM에 의해 자금이 다.

1. 악기 준비
참고:이 실험에 대 한 해 마 XF24 장치 "섬 격판덮개"를 사용 했습니다. 기술의 작업 측정 구획에 물질을 추가 혼합, 대기 및 측정 뿐만 아니라 가능성의 다른 주기를 사용 합니다.
<ol><li>충분 한 시간을 원하는 온도 도달 하 고 안정적으로 유지 되도록 잘 실험의 시작 하기 전에 컴퓨터를 켭니다.</li>
	<li>소프트웨어 설치 프로그램 (관리 모드)에서 카트리지 교정의 길이 선택 (여기, 20 분 선정 되었다)와 원하는 온도. 참고: 미토 콘 드리 아 또는 포유류 조직 측정 일반적으로 수행 하는 동안 밖으로 37 ° C, 에서 비행 머리 주위 온도 25 ° C 그러나 31 ° C에서 측정의 결과가 출판 된다. 우리는 실 온에서 장치에 대 한 낮은 온도 설정 이므로 31 ° C를 사용 합니다. 25 ° C이 하 온도 도달, 장소 기계 추운 방에 또는 11 ° C에서 최근에 출판 된21로.</li>
	<li>소프트웨어에는 다음 프로토콜 사용 하 여: 3 분-2 분 대기-2 분 측정 혼합. 실험 설계에 따라 선택한 측정 단계 후 주입 단계 A-D 포트에서 추가 합니다.<ol>
<li>품질 확인 및 기저 OCR의 결정에 대 한 대기 포트 A. 통해 첫 번째 약물을 주입 하기 전에 적어도 3 개의 측정 주기 프로토콜의 자세한 시간 표시 막대를 참조 하시기 바랍니다에 대 한 참조 베 커 외. 13 .
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 카트리지 준비
<ol><li>하루 (또는 적어도 4 h) 하기 전에 테스트 전 카트리지를 보정. 각 우물에 Calibrant (pH 7.4)의 1.0 mL를 추가 하 고 CO2 하룻밤 또는 최대 72 h. 하 방지 parafilm으로 카트리지의 증발 24 h 이상 화 되는 경우 없이 37 ° C에서 접시와 저장소 센서 카트리지를 놓습니다.</li>
	<li>실험 약물 실험의 시작 하기 전에 (신선한 매체 + 2.5% 포도 당) 매체에 잘 녹아는 확인 하십시오.</li>
	<li>측정 하 고 약물 주입 중 어떤 pH 차이 피하기 위해 원하는 온도에서 pH에 마약 솔루션의 pH를 조정 합니다.</li>
	<li>피펫으로 할당 된 주사 포트에 마약 솔루션. 예를 들어 포트 A 77 μ를 사용 하 여 달성 1시 10분 희석 770 μ 솔루션 및 포트 B. 이후 85 μ</li>
	<li>기계에는 카트리지를 로드 하 고 보정을 시작 합니다.</li>
</ol>3. 접시 준비
참고: 것이 좋습니다 두 사람이 접시를 동시에 준비. 두 사람이 당 한 접시 준비의 기간 해야 ~ 45-60 분.
<ol><li>갓 준비 조정 미디어 + 2.5% 포도 당 1 원하는 pH에 온도 변화 N HCl. 확인 있는지는 pH에 의해 영향을 받지 않습니다.</li>
	<li>얼음 상자를 준비 하 고 얼음에 금속 접시를 놓습니다.</li>
	<li>섬 플레이트 (24-잘 접시) 패키지를 열고 미디어를 페 트리 접시 (92 m m x 16 m m)에 그물을 담가.</li>
	<li>삽입기 (우물에 그물을 단단히 장소 작은 악기)와 그물 하나를 수집 하 고 삽입기는 현미경 옆에 서 있다. 삽입기에 연결 된 인터넷 미디어의 작은 방울을 추가 합니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 금속 접시에 파리를 배치 하 여 파리 (1 주 또는 4 주 오래 된 구획 남성 여기 사용 된) anesthetize.</li>
	<li>집게를 사용 하 여, 파리의 복을 현미경 페 트리 접시에 미디어에 젖어.</li>
	<li>집게의 두 번째 쌍을 사용 하 여, 부드럽게 비행의 머리를 제거 합니다. 삽입기에 연결 하는 그물의 한가운데에 그것을 배치 하 고 머리 미디어에 몰입은 확인 합니다.</li>
	<li>머리 있을 때 인터넷에서 그들의 16 센터. 우물에 그들을 배치 하는 동안 머리의 손실을 방지 하기 위해 머리를 중심으로 하기 전에 불필요 한 액체를 제거 합니다. 참고: 16 비행 머리가이 수 준 충분 하 고 안정적인 데이터 접시 준비 방법 설정 하는 동안 적절 한 시간 내로 사용 되었다.</li>
	<li>삽입기를 사용 하 우물에 그물을 놓습니다. 머리 그물 아래 갇혀 있다 확인 하십시오. 천천히 700 μ 미디어 + 2.5% 포도 당 (그림 1)를 추가 합니다. 우물의 각 과정을 반복 합니다. 참고: 20 웰 스의 머리 샘플 및 4 빈 우물 접시 당 배경 교정에 대 한 것이 좋습니다 있습니다. 버퍼 + 2.5% 포도 당 700 μ와 그물을 포함 하는 빈 우물 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>공기 거품은 그물을 통해 현미경 아래 우물을 확인 하십시오. 피펫으로 부드럽게 위쪽 및 아래쪽을 사용 하 여 1 mL를 피펫으로 모든 거품을 제거. 신뢰할 수 있는 OCR 독서에 대 한 중심으로 머리를 유지.</li>
	<li>컴퓨터에 접시를 추가 하 고 측정을 시작 합니다.</li>
</ol>4입니다. OCR 측정 분석
<ol><li>프로토콜의 끝에, 카트리지를 제거 합니다.</li>
	<li>품질 검사로 서 포트 충전 재에 보이는 남은 모든 관찰 합니다. 머리는 단백질 추출, 예를 들어, 사용할 경우 카트리지 및 플레이트 (옵션 1) 삭제 (옵션 2 참조).</li>
	<li>스프레드시트 파일을 추출 하 고 품질 확인 각 산소와 pH 수준에 대 한 잘. 배경 우물 없음 OCR 보기 산소 수준을 안정 되어 있는지 확인 합니다.<ol>
<li>일부는 해당 소프트웨어에 선택 될 수 있다 데이터 분석을 위한 알고리즘을 사용 합니다. AKOS 알고리즘을 사용 하 여 OCR 값2 경우 산소의 범위 (= 하위 측정) 첫 번째 및 마지막 눈금 사이의 전체 측정 중 레벨에 대 한 두 가지 생물 학적 샘플 사이 비슷합니다 및 마지막 틱의 산소 레벨은 95 (보다 낮은 mmHg) (머리 OCR은 현저 하 게 낮은 산소 수준에서), (그림 2).</li>
		<li>일부 조건 샘플 빠른 OCR 생성을 하면 고 1세인트 틱 하는 동안 및/또는 마지막 틱 (anoxia) (그림 3A)에 낮은 산소 수준 표시 될 수 있습니다. 이러한 시나리오에서는 고정된 알고리즘 같은 다른 측정 방법을 사용 합니다. Anoxia, OCR은 솔루션에 산소의 낮은 수준으로 크게 감소 됩니다. 따라서, AKOS 알고리즘 잘못 된 신호를 생성합니다. 참고: 최신 기계 고정된 알고리즘을 결여 된다. 따라서, 그것은 총 산소 레벨을 추출 하 여 플롯 처음 시간 당 속도 3-5 틱 (그림 3) 선호 된다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. (옵션 2) 머리 세그먼트의 생 화 확 적인 분석
<ol><li>생 화 확 적인 측정을 (대사 산물, proteome)머리 세그먼트의 속성 조정 실행된 시간을 요구; 그러나, 그것은 언제 든 지 프로토콜을 중단 하 고 제거 하십시오입니다.</li>
	<li>일단 접시를 제거는 날카롭게 비 집게를 사용 하 여 그물에 구멍을 만들 float로 머리를 발표 함으로써 그것을 제거.</li>
	<li>1 mL를 피펫으로 컷된 팁 및 이전 머리는 유리병 사용.</li>
	<li>빠르게 버퍼를 삭제 하 고 스냅인-액체 질소에 머리를 고정. 향후 분석을 위해-80 ° C에서 머리를 저장 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTP1B+controls+non-mitochondrial+oxygen+consumption+by+regulating+RNF213+to+promote+tumour+survival+during+hypoxia.">PTP1B controls non-mitochondrial oxygen consumption by regulating RNF213 to promote tumour survival during hypoxia.</a> Nature cell biology. 18 (7), 803-813 (2016).</li><li>Falkenberg, K. J., Johnstone, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+and+their+inhibitors+in+cancer,+neurological+diseases+and+immune+disorders.">Histone deacetylases and their inhibitors in cancer, neurological diseases and immune disorders.</a> Nature reviews. Drug discovery. 13 (9), 673-691 (2014).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

우리의 새로운 기술은 노화에 신진 대사 변화 및 질병 전체 비행 머리 세그먼트22의 맥락에서 연구 하는 새로운 접근 방식을 제공 합니다. 메서드 또한 KDAC 나트륨 낙 산 염 산소 소비에 미치는 영향을 연구에 적합 수 있습니다. 우리는 바와 같이 리 deacetlyase 억제제 (HDACs/KDACs) OCR 변경 될. 기본적으로, 이러한 억제제의 목표는 (이 억제제 영향을 미치지 않습니다 클래스 III deacetylases는 Sirtuins) 미토 콘 드리 아에서 지역화 되지 일반적으로24, 같은 약물만 테스트할 수에 적어도 조직 수준. 실제로, 다양 한 약물 따라서 소화 시스템에 의해 가능한 처리/수정/비활성화를 우회, 뇌에 직접 주입 됩니다. 따라서, 우리의 기술 머리 세그먼트 어떻게 그런 약물 직접 영향으로 새로운 통찰력을 제공 합니다.
몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 프로토콜에 명시 된 대로 좋습니다 손에 접시를 준비 두 쌍 접시 아래 한 시간을 준비. 우리의 경험에서 OCR 측정의 보안과 품질 적시에 준비 하는 때 더 있습니다. 너무 오래 복용 하면 안정적인 OCR의 짧은 기간 뿐만 아니라 낮은 OCR 소모 우물의 발생 증가 하고있다. 둘째, 품질 검사를 실시 하 고 다양 한 샘플 사이 실험 조건 (pH, 산소 수준) 비슷한 인지 확인이 중요 하다. 마지막으로, 중요 한 단계는 샘플을 분석 하는 올바른 알고리즘을 선택 하 고 있다. 우리는 바와 같이 기본 AKOS 알고리즘 높은13에서 산소를 소비 하는 샘플에서 오해 하 고 때로는 반대 계산 나왔고. 우리는 그러므로 산소 수준에 대 한 원시 데이터를 검사 하 고 비교 결과 OCR의 중요성을 강조.
현재,이 기술은 몇 가지 제한이 있습니다. 실내 온도에, 기계는 최대 31 ° C (이것은 최소한의 측정 온도 실내 온도에 기계는 하는 동안)가 열는 비행 머리25에 대 한 스트레스 상태를 나타내는 수 있습니다. 그러나 이것 25 ° C에서 측정 하면 콜드 룸에 기계를 배치 하 여 극복 될 수 있다 따라서 비행 머리에 가능한 열 스트레스 없이. 최근 보고서는 11 ° C에서, 25 ° C21에 파리의 OCR 녹음 수 있게 컴퓨터를 배치 설명 했다. 그럼에도 불구 하 고, 비행 머리 분리 실 온에서 수행 되어야 합니다. 또한, 온도 변동 제어 pH 변화에 도전 하 게 하 고 따라서 것이 좋습니다 비슷한 실험 설정을 사용 하 여 OCR에 생리 적 조건/약물의 영향을 테스트 하. 또한, 비-미토 콘 드 리아-독립 메커니즘에 의해 산소 소비량의 기여 아직 되지 않았습니다 설립된26. 비행 머리에 효율적인 다양 한 호흡 억제제를 사용 하 여 그것은 같은 미토 콘 드 리아 비 산소 소비 속도 설정 하는 것입니다.
그것은 주목할 만한 다양 한 포유류 외관 변경 에너지 대사에 의해 특징입니다. 그들 가운데는 Alzheimer의 질병 또는 대사 중 대사 감소를 특징으로하는 질병 rewiring 암 등. 흥미롭게도, Alzheimer의 질병과 암 치료27KDAC 억제제 사용 됩니다. 어떤 KDAC 여 억제제 치료 측면을 달성 하는 정확한 메커니즘 불분명 한 동안, 우리의 기술에서 데이터 같은 억제제 신진 대사를 조절 수 있습니다 새로운 개념을 지원 합니다.
요약 하자면,이 메서드는 귀중 한 비보에 요금 전체 산소 소비량을 측정 하 고 더 정확 하 게 고립 된 미토 콘 드리 아 프로토콜12간과 수 있습니다 일반 대사에 약물 효과 표시 합니다. 예를 들어 이전 기술, 보다는 오히려이 방법에서 얻은 결과 KDAC 치료 시 나이 관련 대사 경직성에 대 한 새로운 통찰력을 연루 있다. 추가 작업은 최적화 하는 데 필요한에 대 한 실험 조건 비행 머리, 우리의 기술과 적합 한 분석의 조합을 조직 전체 생활의 맥락에서 미토 콘 드리 아 활동의 추가 설명으로 이어질 수 있습니다.

레 귤 레이트 된 대사 활동은 세포의 생존 및 조직의 건강 한 기능에 대 한 필수적입니다. 규제 완화 신진 대사 활동을 광범위 하 게 발병과 다양 한 질병1의 진행에 연결 될 표시 되었습니다. 예를 들어, 낮은 신진 대사 활동 이전 알츠하이머병 같은 신경 퇴행 성 질환에 설명 했다, 나이 관련 된 메모리 장애2,3. 또한, 미토 콘 드 리아 기능 장애 원인이 노화 과정4,5에서 포함 되기 위하여 믿어진다. 다른 한편으로, 더 높은 미토 콘 드리 아 및 신진 대사 속도 암 세포6, 미토 콘 드 리아 억제제의 사용 tumorigenesis7을 감소 설명 했다.
신진 대사 활동에의 한 판독은 미토 콘 드리 아의 산소 소비 속도 (OCR)입니다. 흥미롭게도,이 유형의 판독은 주로 고립 된 미토 콘 드리 아에서 얻은 것 또는 셀, 따라서 문학에서 설명 된 것의 대부분은 주로 생리 적 상태를 유사 하지 않는 해독 기반. 그러나,이 기술의 몇 가지 단점이 있다. 첫째, 미토 콘 드 리아 격리 프로토콜의 무결성8, 이전 조직9젊은 대 에서 고립 된 미토 콘 드리 아를 비교할 때 관련 유물을 될 수 있는 손상 잠재적으로 수 있습니다. 또한, 격리 과정 오래 이며 미토 콘 드 리아 기능9,,1011조절 관련 단백질 posttranslational 수정의 손실이 발생할 수 있습니다. 또한, 그것은 고립 된 미토 콘 드리 아 일관 되 게 전체 조직 신진 대사 속도12,13대표 하지 않는다 표시 되었습니다. 이러한 세포 생물학적 복잡성으로 볼 수, '전체는 부분의 합 보다 더 큰', 즉, 미토 콘 드리 아 격리 하는 때 그들의 신진 대사 속도 비해 복잡 한 셀 안에 다른 신진 대사 속도 표시할 수 있습니다.
세포는 고립 된 미토 콘 드리 아 보다 더 나은 OCR 판독을 제공할 수 있습니다, 전체 조직의 맥락에서 셀을 통신 손실 수 있습니다. 예를 들어, 두뇌에 있는 신경 세포의 대사 활동 높은 이웃 glial 세포14의 신진 대사 활동에 따라 달라 집니다. 따라서, 전체 조직 또는 전체 유기 체에 OCR을 조사 하기 위해 새로운 기술을 구축 발병과 다양 한 질환의 진행에 대 한 더 많은 통찰력 증명할 수 있습니다.
최근, 새로운 기술 이러한 문제를 해결 하 고 전체 조직, 세그먼트, 또는 살아있는 유기 체에서 OCR의 측정을 가능 하 게 나왔다. 예를 들어 최근 작품 respirometer15permeabilized 섬유 접근을 사용 하 여 딱정벌레 비행 근육에서 산소 측정을 보도 했다. 마이크로-respirometry에 대 한 새로운 기계 췌 장의 작은 섬16,17의 OCR의 측정을 허용 한다. 따라서,이 기술을 전체 웜18 와 얼룩말 물고기19에서 OCR의 측정을 통해 보고 되었습니다. 그러나, 소화 방 벽의 존재는 OCR 변경의 맥락에서 다양 한 약물 테스트에 대 한 도전을 포즈 수 있습니다. 흥미롭게도, 네빌과 동료에 의해 최근 보고서 잘 플레이트20,21단일 초파리 유 충 뇌를 측정 하기 위한 새로운 기법으로 나타났습니다.
이 연구에서 전체 생활 및 비-모바일 초파리22에서 모든 OCR의 측정을 사용 하는 비슷한 설정을 사용 했습니다. 이 기술은 또한 소화 시스템 장벽13,22를 통과 하지 않고 전체 세그먼트에서 신진 대사 활동에 다양 한 약물의 영향을 측정에 장점도 제공 합니다. 예, 그것은 이전을 직접 분사 lysine deacetylase 억제 물 (KDACi)의 약 믿고 향상 된 기억 형성23귀착되는 두뇌에 epigenetic 메커니즘을 변경 시연 했다. 그러나, 우리의 소설 기법을 사용해 서, 우리는 그 KDAC 억제 결과 OCR의 급속 한 증가 신경 활동에 자체적으로 기여 요인이 될 수 있습니다 발견 했다. 우리의 프로토콜 전체 머리의 맥락에서 OCR에 다양 한 약물, 유전자 조작, 또는 생리 적 상태 (질병, 노화)의 영향을 평가 하는 간단 하 고 새로운 방법을 제공 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:763px;" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8644</td>
			<td style="width:335px;">D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XF assay Medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">817500</td>
			<td>Dissolved in XF assay buffer</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Seahorse XF24/e24 analyzer</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XF24/e24 Extracellular Assay Kit</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">100850-001</td>
			<td>Cartridge</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XF24/e24 Islet Capture Microplates</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">101122-100</td>
			<td>Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Seahorse Capture Screen Insert Tool</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td>101135-10</td>
			<td>Insertor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:93px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">821,472</td>
			<td>Petri dish 92 x 16 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring and interpreting oxygen consumption rates in whole fly head segments

규제 신진 대사 활동은 살아있는 세포의 정상 기능을 위해 필수적입니다. 실제로, 변경 된 대사 활동 원인이 암, 당뇨병, neurodegeneration, 및 몇 가지 이름을 노화의 진행과 연결 된다. 예를 들어, 미토 콘 드리 아 활동, 세포의 신진 대사 강국에에서 변화 등 많은 질병에 특징 되어 있다. 일반적으로, 미토 콘 드리 아의 산소 소비 속도 미토 콘 드리 아 활동의 신뢰할 수 있는 판독 여겨졌다 고 측정 이러한 연구에서 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 셀에 근거 했다. 그러나, 그러한 조건 전체 조직의 복잡성을 대표 하지 않을 수 있습니다. 최근에, 우리는 완전히 고립 된 비행 머리에서 산소 소비 속도의 동적 측정을 가능 하 게 새로운 방법을 개발 했습니다. 이 메서드를 이용 하 여 우리 젊은 대 세 파리에서 전체 머리 세그먼트의 낮은 산소 소비 속도 기록 했습니다. 둘째, 우리 lysine deacetylase 억제 물 급속 하 게 전체 머리에 산소 소비를 변경할 다는 것을 발견 했다. 우리의 새로운 기술 수 있습니다 따라서 신진 대사 속도 영향을 미칠 수 있는 다양 한 약물의 잠복 새로운 속성에 도움이 됩니다. 또한, 우리의 방법은 생리 적 상태를 더 밀접 하 게 유사한 실험적인 체제에서 변화 행동의 더 나은 이해를 줄 수 있습니다.

고품질 OCR 측정을 기록 하는 기능 (그림 1) 그물 중간 머리 중심에 의존 합니다. 이것은 센서가 크면 최신 XFe24 시스템에 비해 다소 작은 산소 센서 자리 XF24 컴퓨터에 대 한 중요 하다. 이전 표시, 중심 머리 젊은 파리1320 연속 측정에 대 한 꾸준한 OCR을 표시합니다.
정확한 분석을 적용 하는 기계를 사용 하 여 하나의 중요 한 측면이입니다. 실험 기간 동안 산소 수준을 확인 하는 것이 좋습니다. 각 2 분 측정 10 하위 측정 (틱)로 세분화 됩니다. 16 건강 한 머리와 잘 보통 140-170 (mmHg) 첫 번째 틱의 산소 부분 압력 (포2)를 표시합니다. 첫 번째 예제에서 우리는 젊은 중 년 비행 헤드 (그림 2A 와 2B) 대 비교. 산소 수준 드롭 빨리 중간 머리에, 관찰 된 차이 적습니다 (그림 2A). 또한, 산소 레벨의 범위 조건, 마지막 틱 동안 120 첫 번째 tick 동안 165 사이 비슷합니다. 이러한 경우에서는 AKOS 알고리즘을 사용 하 여 자동으로 OCR (pmol/분)2, 안정적으로 젊은 대 중 년 헤드 (그림 2B) 사이의 산소 수준 하락을 반영을 생성 하는 것이 좋습니다입니다. 메모의 기계에 의해 분석 프로그램은 자동으로 AKOS 알고리즘을 선택합니다.
그러나, 오해,으로 우리의 관측을 바탕으로, 줄 수 AKOS 알고리즘을 사용 하 여 자동으로 하지 않을 경우 반대 정확한 OCR에 대 한 결과. 이러한 유물 anoxia13,22를 도달 하는 높은 소비 샘플의 조건에서 생성할 수 있습니다. 예를 들어 나트륨 낙 산 염 (SB), KDAC 억제제의 추가 뚜렷이 산소 수준 (그림 3A)의 역학을 변경합니다. 반면 차량 컨트롤 첫 번째 및 마지막 틱 동안 산소의 꾸준한 레벨 표시, SB 추가 산소 레벨의 상당한 고 과도 드롭이 틱 (그림 3A) 발생 합니다. SB 자체로 팬 들은 아무 머리 (데이터 표시 되지 않음) 추가 배경 스 산소 레벨의 정보를 변경 하지 않습니다. 데이터는 SB 산소 소비를 증가 하는 개념을 지원 합니다. 첫 번째 눈금의 컬렉션 (첫 번째 눈금 측정 단계에서 기록 될 때까지 12 초) 지연으로 첫 번째 데이터 요소는 이미 낮은에 SB 대우 웰 스. 따라서, 산소 소비가 HDAC 억제제의 추가 다음의 초기 변화를 포착 하기가 어렵습니다. 또한, 마지막 틱 컬렉션에 표시 된 대로 SB 치료 샘플에서 산소 수준은 이미 낮은 수준 (anoxia)으로 감소 된다. Anoxia에 머리는 그들의 산소 소비 마지막 틱 (그림 3A) 천천히. AKOS 계산 계정에 모든 틱 하는 무산 소 상태를 무시 하기 때문에 그것은 잘못 된 OCR을 생성 합니다. 실제로, 비 정규화 된 AKOS 기반 OCR 수준 표시 작은 변경 포트는 (Veh/SB) (그림 3B)의 주사 (점선).
산소 수준 변경 (그림 3A)를 지원 하지 않는 포트 A의 주입 전후는 AKOS에 따라 사전 주입 측정에 OCR 수치를 정상화 OCR의 매우 비슷한 수준을 보여준다. 이러한 상황에서 고정 된 알고리즘을 더 밀접 하 게 모델/유사 OCR 및 산소 수준 변경 것이 좋습니다 (그림 3C). 따라서, 고정된 알고리즘을 기반으로 측정 계시 한다 증가 OCR SB 치료 (그림 3C)에 따라 정규화 됩니다.
새로운 기계와 단점은 고정된 알고리즘의 부재 이다. 따라서, 높은 샘플/치료 사용을 사용 하는 실험에서 수동으로 OCR 측정을 계산 하는 것이 좋습니다 하 고 처음 시간 당 각 측정에서 3-5 틱 레벨 산소에서 감소를 계산 키를 누릅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig1.jpg"> 그림 1 . 남성 파리의 16 주 된 하나 머리를 포함 하는 잘의 예. 머리 그물 아래 중심 하 고 언론에 떠 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig2.jpg"> 그림 2 . OCR 측정 비교 1-주 오래 된 비행 거리 머리 (영)의 대표적인 예 고 4 주 오래 된 비행 거리 머리 (중세). (A) 산소 수준은 세 가지 별도 측정;에 대 한 표시 됩니다. 각 2 분 측정 10 하위 측정 (틱)으로 세분화 됩니다. ((A)의 B) 정량화. 첫번째 그리고 마지막 진드기의 수준 비슷합니다, 중간 나이 샘플의 레벨은 약간 낮은. 산소 수준 저하의 기울기의 정량화는 OCR 레벨을 생성 하는 데 사용 됩니다. 앞에서 설명한22로 중간 세 파리의 OCR은 10%-15% 젊은 파리 보다 더 높은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig3.jpg"> 그림 3 . 나트륨 낙 산 염 (SB) 젊은 비행 머리에 의해 OCR의 변경의 예. (A) 산소 레벨 15 mM SB의 추가 따라 7 측정에서 기록. 포트 a.에서 약 (또는 차량)의 주입을 표시 하는 점선 노트의 틱 1과 10의 산소 수준을 제어 그룹 (파란색)에서 안정적으로 유지 하는 동안 이러한 진드기 중 산소의 수준은 정도 (6 측정 다음 주사) 치료 SB 샘플 (오렌지)에 감소. 또한, 산소 수준에 감소는 SB 취급 샘플의 마지막 틱 동안 크게 감소 된다. N = 3 그룹 (B) [왼쪽된] 비 정규화 OCR 수준 당 AKOS 알고리즘에서 계산. 계산 올바르게 표시 하지 OCR의 SB 포트 포트 A. (C) [왼쪽] '고정' 알고리즘 계산 (A) 비 정규화 된 OCR 보여주는 주사 전에 측정을 OCR의 대답 [오른쪽] 정규화의 주입 전후 . 여기, OCR 밀접 하 게 SB 치료; 시 머리의 산소 사용의 일시적 증가 나타냅니다. [오른쪽] A. 오류 바 포트의 주입에 앞서 측정 하는 OCR의 모든 그래프에서 S.E.M.를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

신진 대사 속도 있는 변경은 측정 하는 것은 다양 한 질병과 노화의 진행을 이해의 중심입니다. 여기, 우리는 더 밀접 하 게 유사한 생리 적인 상태와 미토 콘 드리 아 활동을 수정 하는 새로운 약물 노출에 도움이 있습니다 전체 머리 산소 소비를 측정 하는 새로운 기법을 제시.

측정 및 해석의 전체 산소 소비 속도 비행 머리 세그먼트

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

이 방법은 신진 대사 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다, 노화 과정에서 신진 대사 활동이 어떻게 변경되는가. 이 기술의 주요 장점은 고전적인 미토콘드리아 격리에 비해 자연 및 생리 적 상태와 밀접하게 유사한 데이터를 가지고있는 그대로 신체 세그먼트의 사용입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원 생인 Anuroop과 Annika가 될 것입니다.프로토콜을 시작하려면 실험을 시작하기 1시간 전에 기계를 켜서 원하는 온도에 도달하고 안정적으로 유지할 수 있는 충분한 시간이 되도록 합니다. 그런 다음, 소프트웨어 설정에서, 관리 모드에서, 카트리지 교정의 길이와 원하는 온도를 선택합니다. 그런 다음 다음 프로토콜을 입력합니다:실험 설계에 따라 선택한 측정 단계 후에 포트 A에서 D로 사출 단계를 추가합니다.기저 OCR의 품질과 측정을 확인하려면, 포트 A.Prelibrate를 통해 첫 번째 약물의 주입을 설정하기 전에 적어도 세 측정 주기에 대한 프로토콜을 조정, 또는 테스트 하기 전에 적어도 4 시간, 각 우물에 교정의 1.0 밀리리터를 추가하여, 플레이트의 상단에 센서 카트리지를 배치. 증발을 방지하기 위해 24시간 이상 수분을 공급할 예정인 경우 파라필름으로 카트리지를 덮습니다. 하룻밤 사이에 CO2없이 섭씨 37도에 카트리지를 보관하십시오.다음으로, 실험약물이 신선한 배지에 철저히 용해되고 2.5%의 포도당을 더한지 확인한다. 원하는 온도에서 차량의 pH에 대한 약물 용액의 pH를 측정하고 조정합니다. 피펫 에 약물 용액 할당 주입 포트.그런 다음 카트리지를 컴퓨터에 로드하고 교정을 시작합니다. 1개의 정상 HCl로 원하는 pH에 신선하게 준비된 매체 플러스 2.5%의 포도당을 조정합니다. 다음으로, 얼음 상자를 준비하고 얼음에 금속 판을 놓습니다.아일렛 플레이트 패키지를 엽니다. 16mm 페트리 접시로 미디어에 그물을 담그다. 삽입기로 하나의 그물을 수집하고 삽입자가 현미경 옆에 서있다.삽입기에 연결된 그물에 작은 미디어 방울을 추가합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 금속 판에 놓아 파리를 마취시합니다. 집게를 사용하여, 비행의 복부를 잡고 현미경아래 페트리 접시에 미디어에 몰입.두 번째 집게 를 사용하여 플라이의 머리를 부드럽게 제거합니다. 삽입기에 부착된 그물 의 중간에 머리를 놓고 머리가 미디어에 침지되는지 확인합니다. 머리를 중심으로 하여 머리를 잃지 않도록 하기 전에 불필요한 유체를 제거하여 우물에 놓습니다.그물에 16 개의 머리가있을 때, 그들을 중심으로. 삽입기를 사용하여 그물을 우물에 놓습니다. 머리가 그물 아래에 갇혀 있는지 확인하고 천천히 700 마이크로 리터의 미디어 플러스 2.5 %의 포도당을 추가하십시오.배경에 사용되는 빈 우물에는 버퍼700 마이크로리터와 2.5 %의 포도당이있는 그물이 포함되어 있는지 확인하십시오. 현미경을 통해 그물 아래 기포에 대 한 우물을 확인 합니다. 파이펫은 1밀리미터 파이펫을 사용하여 거품을 제거합니다.신뢰할 수 있는 OCR 판독을 위해 머리를 중심으로 유지합니다. 그런 다음 접시를 기계에 추가하고 측정을 시작합니다. 프로토콜의 끝에서 카트리지를 제거합니다.포트 충전재에 남은 것이 보이지 않는지 시각적으로 확인합니다. 다음으로, 머리가 단백질 추출에 사용되지 않는 경우 카트리지와 접시를 버리십시오. 분석 전에 비정상적인 우물을 감지하기 위해 산소와 pH 수준을 살펴보십시오.또한 산소 수준에 따라 적절한 산소 소비 속도 계산을 선택하는 것이 중요합니다. 프로토콜을 수행하자마자 중년 머리의 산소 수준이 젊은 비행 헤드보다 더 빨리 떨어졌다는 것이 관찰되었습니다. 산소 레벨의 범위가 조건 간에 유사할 때, AKOS 알고리즘을 사용하여 산소 소비 속도를 자동으로 생성하는 것이 좋습니다, 또는 OCR, 이는 안정적으로 젊은 대 중년 머리 사이의 측정 중에 산소 수준 변화를 미러.나트륨 부티레이트 또는 SB, KDAC 억제제의 첨가는 산소 수준의 역학을 일시적으로 변화시적으로 변화시다. 차량 컨트롤은 첫 번째 와 마지막 진드기 동안 산소의 꾸준한 수준을 표시하는 반면, SB 추가는 이러한 진드기에서 산소 수준의 상당한 과도 한 하락을 야기한다. AKOS 계산은 모든 진드기를 고려하고 무산소 상태를 무시하기 때문에 포트 A.의 주입시 거의 변화를 보이지 않는 비정규화된 AKOS 기반 OCR 수준에서 관찰된 것과 같이 오해의 소지가 있는 OCR을 생성합니다.OCR 및 산소 수준 변화와 보다 밀접하게 모델되고 유사한 고정 알고리즘은 SB 치료에 따라 OCR이 증가된 것으로 나타났습니다.이 절차를 시도할 때, 한 접시를 준비하는 데 상대적으로 짧은 시간을 보장하기 위해 두 사람과 함께 작업하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 웨스턴 블롯 및 질량 분석과 같은 다른 생화학 적 방법은 분자 메커니즘과 관련된 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다, 예를 들어, 그 중간 대사 변경.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

연구

생화학

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

식물에 철 분 함량을 측정 하는 색도계 방법

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

안정적인 탄소 및 산소 동위 원소 분석을 위한 샘플링 및 치아에 나 멜의 전처리 탄산염

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

혐 기성 단백질 정화 및 DesB Dioxygenase 활동을 연구 하 고 억제를 위한 산소 전극을 통해 운동 분석

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

홀스타인 젖소에서 미토 콘 드리 아 호흡 추정 간 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 론 측정

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

뉴클레아제 없는 산소 제거제 프로토카테의 발현 및 정제 3,4-디옥시게나아제

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...