Name: measuring and interpreting oxygen consumption rates in whole fly head segments
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments at JoVE.com

Agradecemos a Andreas Ladurner, Carla Margulis e suas equipes para amplo suporte experimental. Agradecemos a Caitlin Ondracek por seus comentários sobre o manuscrito. Gostaríamos de agradecer a Sofia Vikstrom para ajudar-nos em estabelecer as fases iniciais desta técnica. Agradecemos também o seco pode para sua ajuda técnica. LB é financiado pelo Ministério Federal alemão de educação e pesquisa (concessão de Infrafrontier 01KX1012). SP foi financiado por uma bolsa pós-doutorado AXA Research Fund e o NSFC (número de concessão 81870900). AVV é financiada pela QBM.

1. instrumento preparação
Nota: Para este experimento, usamos um dispositivo XF24 de cavalo-marinho com "placas de ilhéu". A operação da técnica usa ciclos diferentes de mistura, esperando e medições, bem como a possibilidade de adicionar substâncias para o compartimento de medição.
<ol><li>Liga a máquina bem antes do início do experimento, para que haja tempo suficiente para chegar à temperatura desejada e permanecem estáveis.</li>
	<li>Na configuração do software (modo de administração), escolher o comprimento da calibração de cartucho (aqui, 20 min foi escolhido) e a temperatura desejada. Nota: Enquanto mitocôndrias ou medições de tecidos de mamíferos são normalmente transportadas para fora a 37 ° C, , mosca cabeça temperatura ambiente é 25 ° C mas são publicados os resultados das medições a 31 ° C. Usamos o 31 ° C, pois esta é a configuração de temperatura mais baixa para o dispositivo à temperatura ambiente. Para alcançar temperaturas de 25 ° C ou inferior, coloque a máquina em um quarto mais frio ou no 11 ° C, como recentemente publicado21.</li>
	<li>No software, use o seguinte protocolo: 3 min – espera 2 min – 2 min medição de mistura. Dependendo do design experimental, adicione as etapas de injeção de portos A-D após uma etapa de medição escolhido.<ol>
<li>Para verificação da qualidade e determinação de OCR basal, espere pelo menos três ciclos de medição antes de injetar a primeira droga através do porto. Para um cronograma detalhado do protocolo, por favor consulte referência Becker et al . 13 .
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cartucho preparação
<ol><li>Pre-calibre o cartucho de um dia (ou pelo menos 4 h) antes de testar. Adicionar 1,0 mL de Calibrant (pH 7,4) a cada poço e coloque o cartucho de sensor na parte superior da placa e a loja a 37 ° C sem CO2 para a noite ou até de 72 h. prevenir a evaporação de cartucho com parafilm se ele está sendo hidratado por mais de 24 h.</li>
	<li>Certifique-se de que as drogas experimentais são bem dissolvidas no meio (meio fresco + 2,5% de glicose) antes do início do experimento.</li>
	<li>Medir e ajustar o pH da solução de droga ao pH do veículo na temperatura desejada para evitar qualquer diferença de pH durante a injeção de drogas.</li>
	<li>A solução de drogas para o seu porto de injeção alocado de pipeta. Por exemplo, use o 77 μL para porta A conseguir um 01:10 diluição em uma solução de 770 μL e posteriormente 85 μL para porta B.</li>
	<li>Carregar o cartucho na máquina e começar a calibração.</li>
</ol>3. placa preparação
Nota: É altamente recomendável que duas pessoas preparem o prato simultaneamente. A duração da preparação de um prato por duas pessoas pode exigir ~ 45-60 minutos.
<ol><li>Ajustar o preparadas media + 2,5% de glicose para o pH desejado com 1 N HCl. Certifique-se que o pH não é afetado por mudanças na temperatura.</li>
	<li>Preparar uma caixa de gelo e coloque uma placa de metal sobre o gelo.</li>
	<li>Abra o pacote de placa (a placa de 24 poços) ilhéu e mergulhe as redes em uma placa de Petri (92 x 16 mm) com a mídia.</li>
	<li>Recolher um líquido com o dispositivo de inserção (um pequeno instrumento que coloca na net firmemente no poço) e ter o Insertor de pé ao lado do microscópio. Adicione uma pequena gota de mídia para net anexada para o dispositivo de inserção.</li>
	<li>Anestesia as moscas (uma semana ou 4 semanas de idade machos Cantão foram usados aqui), colocando as moscas na placa de metal gelada.</li>
	<li>Usando a pinça, pegue o abdômen de uma mosca e mergulhá-lo na mídia em um prato de Petri sob o microscópio.</li>
	<li>Usando um segundo par de pinças, retire com cuidado a cabeça de uma mosca. Coloque-o no meio de rede anexada para o dispositivo de inserção e verificar que a cabeça está imerso na mídia.</li>
	<li>Centro as cabeças quando há 16 na net. Remova o fluido supérfluo antes de centrar as cabeças para evitar a perda de cabeças, colocando-os no poço. Nota: 16 cabeças moscas foram usadas como este número deu suficientes e estáveis de dados dentro de um prazo razoável de preparação da placa durante o estabelecimento do método.</li>
	<li>Usando o dispositivo de inserção, coloque o líquido no poço. Certifique-se de que as cabeças são presos sob a rede. Lentamente adicione 700 μL de mídia + 2,5% de glicose (Figura 1). Repita o processo para cada um dos poços. Nota: 20 poços de voam de cabeça amostras e recomenda-se 4 poços vazios para calibração de fundo por placa. Certifique-se que os poços vazios também contêm uma rede com 700 μL do tampão + 2,5% de glicose.</li>
	<li>Verifique os poços para as bolhas de ar sob as redes através do microscópio. Pipeta suavemente, subir e descer usando uma pipeta de 1 mL para remover quaisquer bolhas. Manter a cabeça centrada para uma confiável OCR leitura.</li>
	<li>Adicione a placa para a máquina e iniciar a medição.</li>
</ol>4. análise das medições OCR
<ol><li>No final do protocolo, remova o cartucho.</li>
	<li>Como uma verificação de qualidade, observe algumas sobras visíveis em recheios o porto. Descartar o cartucho e placa (opção 1) se as cabeças não devem ser utilizados para a extração de proteínas, por exemplo, (consulte a opção 2).</li>
	<li>Extrair os arquivos de planilha e verificação da qualidade cada um bem para os níveis de oxigênio e pH. Certifique-se que os poços de fundo não mostram nenhum OCR e que os níveis de oxigénio são estáveis.<ol>
<li>Use um algoritmo para análise de dados, alguns dos quais podem ser escolhidos no respectivo software. Uso o algoritmo AKOS para OCR valores2 se o intervalo de oxigênio níveis durante a medição inteira, entre o primeiro e o último carrapato (= sub medição) são semelhantes entre duas amostras biológicas e os níveis de oxigênio dos últimos tiques não inferiores a 95 ( mmHg) (OCR das cabeças é marcadamente inferior a este nível de oxigênio), (Figura 2).</li>
		<li>Algumas condições fará com que a amostra gerar um OCR rápida e podem apresentar níveis mais baixos de oxigênio durante o 1 carrapato dest e/ou o último instante (anóxia) (Figura 3A). Em tal cenário, use um método alternativo de medição tais como o algoritmo fixo. Em anóxia, o OCR é muito reduzido devido aos baixos níveis de oxigênio na solução. Como tal, o algoritmo AKOS produz leituras enganosas. Nota: A máquina mais recente carece o algoritmo fixo. Portanto, é preferido para extrair os níveis de oxigênio total e plotar a taxa por hora para o primeiro carrapatos de 3-5 (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. (opção 2) análise bioquímica do segmento de cabeça
<ol><li>Para medir a bioquímica (metabolitos, proteoma, etc) Propriedades de um segmento da cabeça, ajustar o tempo de execução para a exigência; no entanto, é possível anular o protocolo a qualquer momento e retire a placa.</li>
	<li>Uma vez que a placa é removida, use fórceps não-afiadas para fazer um buraco na net e removê-lo desse modo liberando as cabeças para flutuar.</li>
	<li>Usando uma pipeta de 1 mL com um corte de ponta e transferir as cabeças para um frasco.</li>
	<li>Rapidamente descartar o buffer e snap-congelar as cabeças em nitrogênio líquido. Armazene as cabeças a-80 ° C para análise futura.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial diseases in man and mouse. 283 (5407), 1482-1488 (1999).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Cunnane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+fuel+metabolism,+aging,+and+Alzheimer's+disease.">Brain fuel metabolism, aging, and Alzheimer's disease.</a> Nutrition. 27 (1), 3-20 (2011).</li><li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li><li>Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+energetics+and+therapeutics.">Mitochondrial energetics and therapeutics.</a> Annual review of pathology. 5, 297-348 (2010).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mitochondrial+dysfunction+as+a+strategy+for+targeting+tumour+cells+in+metabolically+compromised+microenvironments.">Induction of mitochondrial dysfunction as a strategy for targeting tumour cells in metabolically compromised microenvironments.</a> Nature communications. 5, 3295 (2014).</li><li>Wheaton, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+inhibits+mitochondrial+complex+I+of+cancer+cells+to+reduce+tumorigenesis.">Metformin inhibits mitochondrial complex I of cancer cells to reduce tumorigenesis.</a> eLife. 3, e02242 (2014).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS one. 6 (3), e18317 (2011).</li><li>Baker, D. J., Peleg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+Modeling+of+Mitochondrial+Metabolism+Dysregulation+during+Aging.">Biphasic Modeling of Mitochondrial Metabolism Dysregulation during Aging.</a> Trends in biochemical sciences. 42 (9), 702-711 (2017).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation. 327 (5968), 1000-1004 (2010).</li><li>Baeza, J., Smallegan, M. J., Denu, J. 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(138), (2018).</li><li>Peleg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+extension+by+targeting+a+link+between+metabolism+and+histone+acetylation+in+Drosophila.">Life span extension by targeting a link between metabolism and histone acetylation in Drosophila.</a> EMBO reports. 17 (3), 455-469 (2016).</li><li>Peleg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice. 328 (5979), 753-756 (2010).</li><li>Drazic, A., Myklebust, L. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTP1B+controls+non-mitochondrial+oxygen+consumption+by+regulating+RNF213+to+promote+tumour+survival+during+hypoxia.">PTP1B controls non-mitochondrial oxygen consumption by regulating RNF213 to promote tumour survival during hypoxia.</a> Nature cell biology. 18 (7), 803-813 (2016).</li><li>Falkenberg, K. J., Johnstone, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+and+their+inhibitors+in+cancer,+neurological+diseases+and+immune+disorders.">Histone deacetylases and their inhibitors in cancer, neurological diseases and immune disorders.</a> Nature reviews. Drug discovery. 13 (9), 673-691 (2014).</li></ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Nossa nova técnica oferece uma nova abordagem para estudar alterações metabólicas no envelhecimento e doença no contexto de toda mosca segmentos cabeça22. O método também pode ser adequado para estudar o impacto do butirato de sódio KDAC sobre o consumo de oxigênio. Como temos demonstrado, inibidores de deacetlyase de lisina (HDACs/KDACs) resultam em alterações de OCR. Essencialmente, como alvos de tais inibidores normalmente não são localizados na mitocôndria (estes inibidores não impactam a deacetilases de classe III, o Sirtuins)24, tais drogas apenas poderiam ser testadas em pelo menos nível de tecido. De fato, várias drogas são injetadas diretamente para o cérebro, ignorando assim possível processamento/modificação/inactivação pelo sistema digestivo. Como tal, nossa técnica oferece novos insights sobre como tais drogas diretamente impacto o segmento da cabeça.
Existem várias etapas críticas. Primeiro, tal como consta do protocolo, é altamente recomendável preparar um prato menos de uma hora, com dois pares de mãos preparando o prato. De nossa experiência, a qualidade e a estabilidade das medições OCR são melhores quando preparados em tempo hábil. Quando se toma muito tempo, a ocorrência de poços de consumo baixos OCR está a aumentar, além de mais curta duração de OCR estável. Em segundo lugar, é importante realizar uma verificação de qualidade e garantir que as condições experimentais entre várias amostras são semelhante (pH, os níveis de oxigênio). Finalmente, um passo fundamental é escolher o algoritmo correto para analisar as amostras. Como temos demonstrado, o algoritmo padrão de AKOS rendeu um cálculo enganoso e por vezes oposto em amostras que consumiu o oxigênio em altas taxas de13. Portanto, salientamos a importância de verificar os dados brutos para os níveis de oxigénio e comparar o OCR resultante.
Atualmente, existem várias limitações com esta técnica. À temperatura ambiente, a máquina aquece até 31 ° C (esta é a temperatura mínima de medição enquanto a máquina está à temperatura ambiente), que pode representar um estado de estresse para a mosca cabeças25. Isso no entanto pode ser superado, colocando a máquina em uma sala fria, o que permitirá medições a 25 ° C e, portanto, sem um stress de calor possível para as cabeças de voar. Relatório recente demonstrou a colocação da máquina a 11 ° C, possibilitando assim a gravação OCR de moscas em 25 ° C21. No entanto, a separação de cabeça voar deve ser realizada à temperatura ambiente. Além disso, as flutuações de temperatura torná-lo difícil de controlar alterações de pH e, portanto, é altamente recomendável para testar o impacto das condições fisiológicas/drogas na OCR usando configurações experimentais semelhantes. Além disso, a contribuição do consumo de oxigênio, por mecanismos não mitocondriais-independente ainda não foi estabelecida,26. Usando vários inibidores respiratórios que são eficientes na cabeça de mosca, seria possível estabelecer tais taxas de consumo de oxigênio não-mitocondrial.
Vale ressaltar que várias doenças de mamíferos são caracterizadas por alterações no metabolismo energético. Entre eles estão doenças que caracterizam-se por qualquer redução metabólica, tais como a doença de Alzheimer ou metabólica religação como o câncer. Curiosamente, os inibidores KDAC são utilizados para tanto a doença de Alzheimer e câncer tratamento27. Enquanto os mecanismos precisos pelos qual KDAC inibidores estão conseguindo o aspecto terapêutico permanecem pouco claras, os dados de nossa técnica oferece suporte a noção de romance que tais inibidores podem modular o metabolismo.
Em resumo, este método é valioso para medição do consumo global de oxigênio taxas na vivo e mais precisão exibe efeitos de drogas sobre o metabolismo geral, que podem ser ignorados em mitocôndrias isoladas de protocolos12. Por exemplo, resultados obtidos com este método, ao invés de técnicas anteriores, têm implicado novas insights para associada a idade metabólica inflexibilidade tratamento de KDAC. Enquanto trabalho adicional é necessário para otimizar as condições experimentais para voam de cabeças, a combinação de nossa técnica e a análise adequada pode levar a elucidação adicional da atividade mitocondrial no contexto dos tecidos vivos de todo.

Regulamentada a atividade metabólica é essencial para a sobrevivência das células e função saudável de um tecido. Atividade metabólica desregulamentada extensivamente demonstrou estar ligada ao aparecimento e progressão de várias doenças1. Por exemplo, a baixa atividade metabólica anteriormente foi descrita em doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e deficiência de memória associada a idade2,3. Além disso, a disfunção mitocondrial é acreditada para ser causalmente envolvidos no envelhecimento processo4,5. Por outro lado, maiores taxas metabólicas e mitocondriais foram descritas no câncer células6, onde o uso de inibidores mitocondriais reduzido tumorigênese7.
Uma leitura de atividade metabólica é a taxa de consumo de oxigênio (OCR) da mitocôndria. Curiosamente, este tipo de leitura é obtido principalmente mitocôndrias isoladas ou células, assim, a maioria do que é descrito na literatura baseia-se principalmente uma leitura que não se assemelham o estado fisiológico. No entanto, existem várias desvantagens para esta técnica. Em primeiro lugar, o protocolo de isolamento mitocondrial pode potencialmente prejudicar sua integridade8, que pode ser um artefato relevante quando se comparam as mitocôndrias isoladas de jovens contra os tecidos mais velhos9. Além disso, o processo de isolamento é longo e pode resultar em perda de modificações posttranslational proteína pertinente, que regulam a função mitocondrial9,10,11. Além disso, verificou-se que mitocôndrias isoladas não representam consistentemente todo tecido taxas metabólicas12,13. Tal complexidade biológica celular poderia ser vista como, 'o todo é maior que a soma das suas partes', ou seja, as mitocôndrias podem exibir diferentes taxas metabólicas dentro de uma célula complexa, em comparação com sua taxa metabólica quando isolado.
Enquanto as células podem oferecer uma melhor leitura de OCR que mitocôndrias isoladas, célula a célula comunicação no contexto de um tecido inteiro pode ser perdida. Por exemplo, no cérebro, a atividade metabólica dos neurônios é altamente dependente da atividade metabólica dos vizinhos células gliais14. Como tal, estabelecer novas técnicas para investigar o OCR no tecido inteiro ou todo organismos pode provar mais perspicaz para o início e a progressão de várias doenças.
Recentemente, novas técnicas surgiram para solucionar esses problemas e permitir a medição de OCR de todo tecido, segmento ou organismos vivos. Por exemplo, um trabalho recente relatou a medição de oxigênio de um músculo de voo do besouro, usando uma abordagem de fibra permeabilized com respirometer15. Novas máquinas para microrespirometria permitem a medição de OCR de ilhotas pancreáticas16,17. Consequentemente, foi relatado que esta tecnologia permite a medição de OCR de toda vermes18 e peixe-Zebra19. No entanto, a presença da barreira digestiva pode representar um desafio para testar várias drogas no contexto de alterações de OCR. Curiosamente, relatórios recentes por Neville e colegas mostraram uma nova técnica para medir o cérebro de larva drosófila único com o prato bem20,21.
Neste estudo, usamos uma instalação similar para permitir a medição de OCR toda por toda vida e não-móveis da drosófila22. Esta técnica também oferece uma vantagem secundária em medir o impacto das diversas drogas na atividade metabólica em um segmento inteiro, sem ter que atravessar a barreira de sistema digestivo13,22. Por exemplo, foi previamente demonstrado que injeção direta de inibidor de deacetilase de lisina (KDACi), acreditava que uma droga para alterar o mecanismo epigenético no cérebro, que resultou em uma melhoria memórias formação23. No entanto, usando a nossa nova técnica, descobrimos que a inibição KDAC resultou em um aumento rápido de OCR, que pode ser um fator contribuinte por si só na atividade neuronal. Nosso protocolo fornece um método simples e inovador para avaliar o impacto de várias drogas, manipulação genética ou Estados fisiológicos (doença, envelhecimento) em OCR no contexto de uma cabeça inteira.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:763px;" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8644</td>
			<td style="width:335px;">D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XF assay Medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:93px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">817500</td>
			<td>Dissolved in XF assay buffer</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Seahorse XF24/e24 analyzer</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XF24/e24 Extracellular Assay Kit</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">100850-001</td>
			<td>Cartridge</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XF24/e24 Islet Capture Microplates</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">101122-100</td>
			<td>Plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Seahorse Capture Screen Insert Tool</td>
			<td style="width:93px;">Agilent</td>
			<td>101135-10</td>
			<td>Insertor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:93px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">821,472</td>
			<td>Petri dish 92 x 16 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring and interpreting oxygen consumption rates in whole fly head segments

Regulamentada a atividade metabólica é essencial para o funcionamento normal das células vivas. Na verdade, a atividade metabólica alterada causalmente está ligada com a progressão do câncer, diabetes, neurodegeneração e envelhecimento, para citar alguns. Por exemplo, alterações na atividade mitocondrial, potência metabólica da célula, foram caracterizadas em muitas dessas doenças. Geralmente, as taxas de consumo de oxigênio da mitocôndria foram consideradas uma leitura confiável de atividade mitocondrial e medições em alguns desses estudos foram baseadas em mitocôndrias isoladas ou células. No entanto, tais condições não podem representar a complexidade de um tecido inteiro. Recentemente, temos desenvolvido um novo método que permite a medição dinâmica de taxas de consumo de oxigênio de chefes de voar toda isolada. Utilizando este método, gravamos menores taxas de consumo de oxigênio do segmento toda cabeça em jovens contra envelhecido moscas. Em segundo lugar, descobrimos que os inibidores de lisina deacetilase alteram rapidamente o consumo de oxigênio em toda a cabeça. Nossa nova técnica, portanto, pode ajudar na descobrindo novas propriedades de diversas drogas, que podem afetar o ritmo metabólico. Além disso, nosso método pode dar uma melhor compreensão do comportamento metabólico em uma instalação experimental que se assemelha mais a Estados fisiológicos.

A capacidade de gravar alta qualidade medição OCR baseia-se na centralização da cabeça no meio da rede (Figura 1). Isto é importante para a máquina de XF24, que tem um sensor de oxigênio bastante pequeno local em comparação com a mais recente máquina de XFe24 em que o sensor é maior. Como já mostrado, centrando as cabeças exibem um OCR constante pelo menos 20 medições consecutivas em moscas jovens13.
Um aspecto crítico do uso das máquinas é aplicar a análise correta. Recomenda-se verificar os níveis de oxigênio durante os experimentos. Cada medição 2 min é subdividida em 10 medidas sub (carrapatos). Um poço com 16 cabeças saudáveis geralmente exibe uma pressão parcial de oxigênio (pO2) de 140-170 (mmHg) para o primeiro carrapato. No primeiro exemplo, comparamos os jovens vs cabeças moscas da meia-idade (Figura 2A e 2B). Enquanto os níveis de oxigênio cair mais rápido na cabeça de meia-idade, a diferença observada é pequena (Figura 2A). Além disso, o alcance dos níveis de oxigênio é semelhante entre as condições, com 165 durante o primeiro carrapato para 120 durante o último carrapato. Nesse caso, é preferível usar o algoritmo AKOS para gerar automaticamente o OCR (pmol/min)2, que confiantemente espelha a queda de nível de oxigênio entre jovens contra chefes da meia-idade (Figura 2B). Digno de nota, o programa de análise pela máquina automaticamente escolhe o algoritmo AKOS.
No entanto, com base em nossas observações, automaticamente, usando o algoritmo AKOS pode dar enganosa, se não oposto resulta para o OCR correto. Tais artefatos podem ser gerados em condições de uma amostra altamente consumindo que chega a anóxia13,22. Por exemplo, a adição de butirato de sódio (SB), um inibidor KDAC, transitoriamente muda a dinâmica dos níveis de oxigênio (Figura 3A). Considerando que os controles do veículo exibem níveis estáveis de oxigênio durante os primeiros e o últimos carrapatos, adição de SB provoca uma queda considerável e transitória dos níveis de oxigênio nesses carrapatos (Figura 3A). SB por si só não altera os níveis de oxigênio em poços de fundo, onde não há cabeças são adicionadas (dados não mostrados). Os dados suporta a noção que o SB aumenta o consumo de oxigênio. Como a coleção de primeira escala é adiada (12 segundos até que a primeira escala é gravada na fase de medição) o primeiro ponto de dados já está menor em poços de SB Tratado. Portanto, é difícil capturar as alterações iniciais no consumo de oxigênio após a adição deste inibidor HDAC. Além disso, os níveis de oxigênio nas amostras SB Tratado são reduzidos ao já baixa (anóxia) conforme indicado pela coleção de tiques ontem. A anóxia, as cabeças de abrandar seu consumo de oxigênio nos últimos carrapatos (Figura 3A). Porque o cálculo AKOS leva em conta todos os carrapatos e ignora um estado anóxico, ele gera um OCR enganosa. Com efeito, o AKOS normalizado baseado mostrar níveis de OCR pequena mudança da injeção (linha tracejada) de Porto um (Veh/SB) (Figura 3B).
Normalizar os níveis de OCR para a medição de pre-injeção baseada a AKOS revela níveis muito semelhantes de OCR antes e após a injeção do Porto A, que não suporta as mudanças de nível de oxigênio (Figura 3A). Nestas circunstâncias, o algoritmo fixo, o que mais modelos/assemelha-se as alterações de nível de OCR e oxigênio é recomendado (Figura 3). Consequentemente, o algoritmo fixo com base normalizada revela medição um OCR aumento prévio tratamento SB (Figura 3).
Uma desvantagem com a nova máquina é a ausência do algoritmo fixo. Portanto, em experimentos onde altamente consumir amostra/tratamento é usado, é recomendável para calcular as medidas de OCR manualmente, e calculando a diminuição de oxigênio nível por vez para o primeiro carrapatos de 3-5 em cada medição.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig1.jpg"> Figura 1 . Um exemplo de um poço contendo 16 cabeças uma semana de idade de moscas masculinas. As cabeças são centrado abaixo uma rede e flutuante na mídia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig2.jpg"> Figura 2 . Um exemplo representativo de comparação de medição OCR entre cabeças de voar uma semana de idade (jovens) e quatro - semana velhas cabeças de mosca (meia-idade). (A) os níveis de oxigênio são mostrados para três medidas separadas; cada medição 2 min é subdividida em dez medições sub (carrapatos). (B) uma quantificação do (A). Os níveis de primeiros e últimos tiques são semelhantes, embora os níveis da amostra de meia-idade são ligeiramente mais baixos. Uma quantificação da inclinação da diminuição nos níveis de oxigênio é usada para gerar os níveis de OCR. Como descrito anteriormente,22, o OCR de moscas envelhecidos médios é 10-15% mais elevado do que moscas jovens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58601/58601fig3.jpg"> Figura 3 . Um exemplo da alteração do OCR de butirato de sódio (SB) nas jovens cabeças moscas. (A) oxigênio níveis registrados de sete medidas após a adição de 15 mM SB. A linha tracejada marca a injeção da droga (ou veículo) de Porto. Da nota, enquanto os níveis de oxigénio de pulsos 1 e 10 permanecem estáveis no grupo controle (azul), os níveis de oxigênio durante esses carrapatos são transitoriamente (seis medições após a injeção) reduziram nas amostras tratada de SB (laranja). Além disso, a diminuição dos níveis de oxigénio é reduzida durante os últimos carrapatos de amostras SB Tratado. N = 3 por grupo (B) [esquerda] Non-normalizado OCR níveis calculados a partir do algoritmo AKOS. O cálculo mostra incorretamente níveis semelhantes de OCR antes e após a injeção do SB pelo porto a. [direita] normalização dos OCR para a medição antes da injeção do porto A. C [Left] cálculo algoritmo 'Fixo' do (A) mostrando o OCR normalizado . Aqui, o OCR estreitamente representa o aumento transiente no uso de oxigênio das cabeças de tratamento de SB; [Direita] Normalização dos OCR para a medição antes da injeção de Porto r. erro barras indicam no MEV mostrou em todos os gráficos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58601/58601fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Alterações nas taxas metabólicas de medição é fundamental para compreender a progressão de várias doenças e envelhecimento. Aqui, apresentamos uma nova técnica para medir o consumo de oxigênio de toda a cabeça que mais de perto se assemelha o estado fisiológico e pode ajudar a revelar novos medicamentos que modificam a atividade mitocondrial.

Medindo e interpretando a taxas de consumo de oxigênio em toda a cabeça segmentos de voar

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do metabolismo, como, como a atividade metabólica é alterada durante o processo de envelhecimento. A principal vantagem dessa técnica é o uso de um segmento corporal intacto que possui dados que se assemelham muito ao estado natural e fisiológico em comparação com o isolamento mitocondrial clássico. Demonstrando o procedimento serão Anuroop e Annika, uma estudante de pós-graduação no meu laboratório.Para iniciar o protocolo, ligue a máquina uma hora antes de iniciar o experimento para que haja tempo adequado para atingir a temperatura desejada e permanecer estável. Em seguida, na configuração do software, sob o modo de administração, escolha o comprimento da calibração do cartucho e a temperatura desejada. Em seguida, digite o seguinte protocolo:Dependendo do design experimental, adicione passos de injeção das portas A a D após uma etapa de medição escolhida.Para verificar a qualidade e a determinação do OCR basal, ajuste o protocolo para pelo menos três ciclos de medição antes de definir a injeção da primeira droga via porta A.Pré-calibrar o cartucho um dia, ou pelo menos quatro horas antes do teste, adicionando 1,0 mililitros de calibrante a cada poço, e coloque o cartucho do sensor na parte superior da placa. Cubra o cartucho com Parafilm se for programado para hidratar por mais de 24 horas para evitar a evaporação. Armazene o cartucho a 37 graus Celsius sem CO2, durante a noite.Em seguida, certifique-se de que as drogas experimentais sejam completamente dissolvidas em meio fresco, além de 2,5% de glicose. Meça e ajuste o pH da solução de droga para o pH do veículo na temperatura desejada. Pipeta a solução de droga em sua porta de injeção alocada.Em seguida, carregue o cartucho na máquina e comece a calibrar. Ajuste a mídia recém-preparada mais 2,5% de glicose ao pH desejado com um HCl normal. Em seguida, prepare uma caixa de gelo e coloque uma placa de metal no gelo.Abra o pacote da placa de ilhó. Mergulhe as redes na mídia por placa de Petri de 16 milímetros. Colete uma rede com o inserdor e tenha o inserção em pé ao lado do microscópio.Adicione uma pequena gota de mídia à rede anexada ao insertor. Em seguida, anestesiar as moscas colocando-as em uma placa de metal gelada. Usando fórceps, pegue o abdômen de uma mosca e mergulhe-o na mídia em uma placa de Petri sob o microscópio.Usando um segundo par de fórceps, remova suavemente a cabeça da mosca. Coloque a cabeça no meio da rede presa ao inserção e verifique se a cabeça está imersa na mídia. Remova o fluido supérfluo antes de centralizar as cabeças para evitar perder cabeças enquanto as coloca no poço.Quando houver 16 cabeças na rede, central as centralizar. Usando o inserção, coloque a rede no poço. Certifique-se de que as cabeças estão presas sob a rede e adicione lentamente 700 microliters de mídia mais 2,5% de glicose.Certifique-se de que os poços vazios, que são usados para fundo, também contêm uma rede com 700 microliters do buffer mais 2,5% de glicose. Verifique se há bolhas de ar sob as redes através do microscópio. Pipeta suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta de um milímetro para remover quaisquer bolhas.Mantenha as cabeças centradas para uma leitura OCR confiável. Em seguida, adicione a placa à máquina e inicie a medição. No final do protocolo, remova o cartucho.Confirme visualmente que não há sobras visíveis nas obturações da porta. Em seguida, descarte o cartucho e a placa se as cabeças não forem usadas para extração de proteínas. Lembre-se de olhar para o oxigênio e os níveis de pH, a fim de detectar quaisquer poços anormais antes da análise.Além disso, é importante escolher o cálculo adequado da taxa de consumo de oxigênio, com base nos níveis de oxigênio. Ao realizar o protocolo, observou-se que os níveis de oxigênio das cabeças de meia-idade caíram mais rápido do que as jovens cabeças de mosca. Quando a faixa dos níveis de oxigênio é semelhante entre as condições, é melhor usar o algoritmo AKOS para gerar automaticamente a taxa de consumo de oxigênio, ou OCR, que espelha de forma confiável as mudanças de nível de oxigênio durante uma medição entre cabeças jovens versus de meia-idade.A adição de butirato de sódio, ou SB, um inibidor de KDAC, muda transitoriamente a dinâmica dos níveis de oxigênio. Considerando que os controles do veículo apresentam níveis constantes de oxigênio durante o primeiro e último carrapato, a adição de SB causa uma queda considerável e transitória dos níveis de oxigênio nesses carrapatos. Como o cálculo da AKOS considera todos os carrapatos e ignora um estado anoxico, ele gera um OCR enganoso, como observado nos níveis de OCR não normalizados baseados em AKOS, que mostram pouca mudança após a injeção da porta A.O algoritmo fixo, que modela mais de perto e se assemelha às alterações de nível de OCR e oxigênio, revela um aumento do OCR sobre o tratamento sb.Ao tentar este procedimento, é importante trabalhar com duas pessoas juntas, a fim de garantir um tempo relativamente curto para preparar uma única placa. Após esse procedimento, outros métodos bioquímicos, como o Western Blot e a espectrometria de massa, podem ser realizados para responder a questões relacionadas a mecanismos moleculares, por exemplo, aqueles que moderam alterações metabólicas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Bioquímica

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras Permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Amostragem e tratamento prévio de esmalte do dente carbonato de carbono estável e análise de isótopos de oxigênio

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purificação de proteínas anaeróbica e análise cinética através do eletrodo de oxigênio para estudar a inibição e atividade dioxigenase DesB

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Expressão e purificação do protocatechuato de oxigênio sem nuclease 3,4-Dioxigenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Detecção de Espécies totais de oxigênio reativo em células aderentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Medição das Taxas de Rotatividade de Proteínas em Células Cultivadas Senescentes e Não-Divisórias com Rotulagem Metabólica e Espectrometria de Massa

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...