Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

يشكر المؤلفون شو داييينج لها المساعدة التقنية والتعليقات على المخطوطة. ويدعم هذه الدراسة المنح المقدمة من "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (المشروع رقم 41476147) و "مجلس منح البحوث" "منطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة"، الصين (المشروع رقم 689813 و 16103414).

1-عينة من الإعداد والتثبيت
<ol><li>تطعيم 1 مل من أكسينيك MED4 بروتشلوروكوككوس إلى 5 مل من Pro99 المستندة إلى مياه البحر المتوسط12. تنمو الثقافات بروتشلوروكوككوس في 23 درجة مئوية تحت الضوء مع كثافة 35 µmol الفوتونات/م2س. وبعد خمسة أيام، وجمع 1 مل ثقافة في أنبوب 1.5 مل. ملاحظة: ?...

<ol>
	<li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier:+Super-resolution+imaging+of+cells.">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Wave+of+Cellular+Imaging.">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).</li><li>Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Komis, G., &#352;amajov&#225;, O., Ove&#269;ka, M., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+in+Plant+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li><li>Schubert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+-+Applications+in+Plant+Cell+Research.">Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Superresolution+Imaging+of+the+FtsZ+Ring+during+Cell+Division+of+the+Cyanobacterium+Prochlorococcus.">Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus.</a> mbio. 8 (6), e00657 (2017).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division:+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E.+coli+cell+fission.">Advances in understanding E. coli cell fission.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).</li><li>Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+different+nitrogen+sources+by+the+marine+cyanobacteria+Prochlorococcus+and+Synechococcus.">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li><li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope.">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).</li><li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuickPALM:+3D+real-time+photoactivation+nanoscopy+image+processing+in+ImageJ.">QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ.</a> Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+photosynthesis+in+the+oceans:+The+origins+and+significance+of+divergent+light-harvesting+strategies.">Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies.</a> Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).</li><li>Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus:+The+structure+and+function+of+collective+diversity.">Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).</li><li>Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus+and+Synechococcus+-+a+Comparative-Study+of+Their+Optical-Properties+in+Relation+To+Their+Size+and+Pigmentation.">Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation.</a> Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).</li><li>Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+3D+super-resolution+microscopy+reveals+Caulobacter+crescentusin+vivo+Z-ring+organization.">High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).</li><li>Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+multiple+biomarkers+in+captured+rare+cells+by+sequential+immunostaining+and+photobleaching.">Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching.</a> Methods. 64 (2), 108-113 (2013).</li><li>Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+photobleaching+necessary+for+Raman+imaging+of+bone+tissue+using+a+green+laser?.">Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).</li><li>Haxo, F. T., Blinks, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+Action+Spectra+of+Marine+Algae.">Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae.</a> The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).</li><li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin:+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria.">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li></ol>

نحن الموصوفة في هذا البروتوكول، على إجراء خفض كبير في أوتوفلوريسسينسي سيانوباكتيريوم بروتشلوروكوككوس (الشكل 3)، وبعد ذلك، إيمونوستين البروتينات في الخلايا، مما مكننا من الاستفادة من العاصفة دراسة فتسز ثلاثي الأبعاد خاتم مورفولوجيس في بروتشلوروكوككوس (<strong class="...

ميكروسكوبيس القرار فائقة يمكن كسر الحد حيود الضوء وتوفير الصور ضمن قرارات حيود الفرعية (< 200 nm). قد استخدمت على نطاق واسع في العديد من الكائنات الحية لدراسة البروتين التعريب والهياكل سوبسيلولار. الرئيسية فائقة القرار تشمل أساليب الفحص المجهري منظم إضاءة مجهرية (SIM)، وحفز الانبعاثات استنفاد مجهرية (STED) والعاصفة فوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل). الآليات والتطبيقات هذه القرار فائقة المجاهر وقد استعرضت في أماكن أخرى1،2.
العاصفة يمكن التوصل إلى قرار يصل إلى 10 نانومتر بالفصل المكاني3،4. للعاصفة، يتم تنشيط جزيء واحد فقط داخل منطقة حيود محدودة ("في") ويتم الاحتفاظ بباقي الجزيئات المعطل ("إيقاف"). بتراكم للتبديل السريع على--والخروج من الجزيئات واحدة، يمكن أن تكون صورة "حيود غير محدود" ولدت3. ومن ناحية أخرى، قابلة للتطبيق في العاصفة، والسماح بترقية سهلة من الفحص المجهري الفلورية العادية للفحص المجهري عالية الدقة5،6أنواع كثيرة من الأصباغ العضوية والبروتينات الفلورية.
العاصفة لم تطبق على نطاق واسع في الخلايا التمثيل الضوئي، مثل البكتيريا، الطحالب، والخلايا النباتية مع المعايشة7،8، وهو يرجع ذلك إلى حقيقة أن العاصفة يتطلب كثافة الليزر عالية إلى فوتوسويتشينج بالسيارة. الليزر عالية الكثافة ظالم يثير الخلفية أوتوفلوريسسينسي قوية في خلايا التمثيل الضوئي ويتداخل مع التعريب جزيء واحد في تصوير العاصفة. من أجل استخدام العاصفة إلى التحقيق فيها الهياكل سوبسيلولار أو تفاعلات البروتين في خلايا التمثيل الضوئي، قمنا بتطوير بروتوكول فوتوبليتشينج لإخماد إشارات أوتوفلوريسسينسي الخلفية9. في إجراءات روتينية المصبوغة إيمونوفلوريسسينت، تتعرض العينات للضوء الأبيض كثافة عالية خلال الخطوة الحظر، مما يقلل من أوتوفلوريسسينسي الخلايا التمثيل الضوئي لتلبية المتطلبات للعاصفة. وهكذا، هذا البروتوكول يجعلها ممكنة التحقيق في الكائنات الحية المصطبغة بالعاصفة.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول استخدام العاصفة بصورة منظمة عصابة فتسز في بيكوسيانوباكتيريوم أحادي الخلية بروتشلوروكوككوس. FtsZ هو بروتين cytoskeletal مصانة عالية مثل tubulin الذي بوليميريزيس لتشكيل هيكل الدائري (الطوق Z) حول محيط الخلية10 وهو ضروري ل انقسام الخلية11. الحفاظ على بروتشلوروكوككوس الخلايا فوتوبليتشيد الأولى للحد من الخلفية أوتوفلوريسسينت وإيمونوستينيد مع جسم FtsZ مكافحة الأولية، وثم جسم مفتش (H + L) المضادة أرنب ثانوية مترافق مع فلوروفوري (مثلاً ، أليكسا فلور 750). في نهاية المطاف، يتم استخدام العاصفة لمراقبة المنظمات خاتم فتسز مفصلة في بروتشلوروكوككوس خلال مراحل مختلفة من دورة الخلية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

مجهرية فائقة القرار قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة التفاعلات بين البروتينات وهياكل سوبسيلولار في العديد من الكائنات الحية. في الكائنات الحية التمثيل الضوئي، بيد القرار الأفقي لتصوير فائقة القرار هو فقط 100 ~ شمال البحر الأبيض المتوسط. انخفاض القرار يرجع أساسا إلى خلفية أوتوفلوريسسينسي عالية من التمثيل الضوئي الخلايا الناجمة عن أشعة الليزر عالية الكثافة المطلوبة لتصوير فائقة القرار، مثل إعادة الإعمار البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة). هنا، يمكننا وصف ساعد فوتوبليتشينج عاصفة أسلوب الذي تم تطويره مؤخرا للتصوير بيكوسيانوباكتيريوم البحرية بروتشلوروكوككوس. بعد فوتوبليتشينج، أوتوفلوريسسينسي من بروتشلوروكوككوس يتم تقليل فعالية حتى يمكن تنفيذ تلك العاصفة بدقة أفقية ~ 10 نانومتر. باستخدام هذا الأسلوب، ونحن اكتساب المنظمة في فيفو ثلاثية الأبعاد (3-D) من البروتين فتسز وتميز أربعة مورفولوجيس عصابة فتسز مختلفة خلال دورة الخلية بروتشلوروكوككوس. ويمكن اعتماد الأسلوب يصف لنا هنا لتصوير القرار فائقة للكائنات الحية الأخرى التمثيل الضوئي.

العاصفة يحقق تصوير فائقة القرار بتفعيل الفردية فوتوسويتشابل فلوروفوريس ستوتشاستيكالي. يتم تسجيل الموقع من كل فلوروفوري والتي شيدت صورة فائقة الدقة ثم استناداً إلى هذه المواقع4. ولذلك، المهم دقة موقع فلوروفوري لإعادة بناء صورة فائقة القرار. أطياف الامتصاص ?...

Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

هنا يمكننا وصف أسلوب فوتوبليتشينج للحد من أوتوفلوريسسينسي من البكتيريا الزرقاء. بعد فوتوبليتشينج، يستخدم الميكروسكوب التعمير البصرية العشوائية للحصول على صور ثلاثية الأبعاد فائقة القرار من الحلبة فتسز سيانوباكتيريال.

فوتوبليتشينج يمكن تصوير القرار فائقة من الحلبة فتسز في سيانوباكتيريوم بروتشلوروكوككوس

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول توطين البروتين وديناميات الكائنات الضوئية. من خلال الجمع بين طريقة الضوبلاخ مع المجهر فائقة الدقة ، ونحن قادرون على الكشف عن ديناميات البروتين من الكائنات الضوئية في تفاصيل ملحوظة. هذه الطريقة لا توفر فقط نظرة ثاقبة في ديناميات البروتين من Prochlorococcus.ويمكن أيضا أن تطبق على العديد من الكائنات الحية الأخرى التي تحتوي على الراديو dop - ينغ وbacteriochlorophyll. إثبات هذا الإجراء سيكون يانشين ليو، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. للبدء، إضافة خمسة ملليلترات من مياه البحر القائمة Pro99 المتوسطة إلى قارورة الثقافة وتطعيمه مع ملليلتر واحد من Prochlorococcus MED4.تنمو Prochlorococcus في 23 درجة مئوية تحت ضوء مع كثافة 35 فوتونات ميكرومول لكل متر مربع. بعد خمسة أيام، وجمع ملليلتر واحد من الثقافة في أنبوب 1.5 ملليلتر. إضافة 100 ميكرولترات من الفورمالديهايد الطازجة أعدت إلى أنبوب لإصلاح الثقافة.احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم، تدور أسفل العينة في 13، 500 مرات G لمدة دقيقة واحدة. إزالة فائقة وإعادة ضغط الخلايا في 100 ميكرولترات من Pro99 المتوسطة.تخزين العينة في أربع درجات مئوية في الظلام حتى جاهزة لأداء المثبطات المناعية. أولا، دوامة قارورة حبات البوليسترين. باستخدام 50٪ الإيثانول، وإعداد واحد إلى 20، 000 تخفيف كملاط العمل.بدوره على الساخن وتعيين درجة الحرارة إلى 120 درجة مئوية. بعد ذلك، ضع الأغطية على لوحة ساخنة. تحميل 100 ميكرولترات من الطين العمل على كل غطاء واحتضان الأغطية على اللوح الساخن لمدة 10 دقائق.ثم نقل بعناية الأغطية إلى أطباق بيتري خرز الجانب للتخزين في درجة حرارة الغرفة. عندما تكون على استعداد لمعطف الأغطية، واسترداد واحد، والتأكد من أنه هو الجانب الخرز. إضافة 100 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر بولي-L-ليسين حل إلى مركز الغطاء والسماح لها الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.بعد ذلك، استخدمي ماصة لتسبيب أي بولي-إل-ليسين غير مرتبط ونقله إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. تخزين هذا بولي-L-ليسين في أربع درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. شطف الأغطية مع 10 ملليلتر من الماء المصفى جدا في طبق بيتري 60 ملليمتر ثم يجف لفترة وجيزة مع منشفة ورقية.نقل الأغطية المغلفة إلى طبق بيتري جديد مع بارا فيلم في الجزء السفلي، والتي سيتم استخدامها كطبق تلطيخ. تحميل 100 ميكرولترات من عينة ثابتة على غطاء والسماح لها الجلوس لمدة 30 دقيقة للسماح مرفق الخلية. بعد ذلك، استخدم منشفة ورقية لاستيعاب الحل المتبقي ثم نقل الغطاء إلى بئر في طبق من 12 بئر للغسيل.إضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت PBS إلى البئر لغسل الغطاء. ثم إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد لغسل غطاء مرة ثانية. استخدام ماصة لإزالة برنامج تلفزيوني واستبداله بميليلتر واحد من عازلة permeabilization أعدت حديثا.احتضان طبق الغسيل في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بإزالة المخزن المؤقت permeabilization. بدء عملية الغسيل عن طريق إضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت PBS الطازجة.وضع طبق الغسيل على شاكر لتهيج بلطف الطبق لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة برنامج تلفزيوني وكرر عملية الغسيل ثلاث مرات. نقل الأغطية المغسولة إلى طبق تلطيخ.إضافة 50 ميكرولترات من العازلة حظر في الجزء العلوي من غطاء. ضع طبق التلطيخ بأكمله على الجليد ثم حركه تحت مصدر الضوء زينون للإضاءة الضوئية لمدة 60 دقيقة على الأقل. بعد الحجب الضوئي والحجب، استخدم حافة منشفة ورقية لإزالة المخزن المؤقت للحظر.أولاً، تمييع ميكرولتر واحد من الأجسام المضادة FtsZ إلى 99 ميكرولترات من عازلة الحجب. ضع 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية المخففة على غطاء الغطاء وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. نقل غطاء إلى بئر من طبق الغسيل.لبدء الغسيل، أضف ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. ثم نقل طبق الغسيل إلى شاكر ويهز بلطف لمدة خمس دقائق. إزالة برنامج تلفزيوني وتكرار عملية الغسيل بأكملها ثلاث مرات.بعد ذلك، نقل الغطاء إلى طبق تلطيخ. ضع 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المخففة على الغطاء واحتضانه في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. نقل غطاء الأغطية مرة أخرى إلى طبق الغسيل.لبدء الغسيل، أضف ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. لف طبق الغسيل في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء. نقل لوحة إلى شاكر وتهز بلطف لمدة خمس دقائق.إزالة برنامج تلفزيوني وتكرار عملية الغسيل بأكملها ثلاث مرات. مباشرة قبل التصوير STORM، إعداد ملليلتر واحد من مخزن التصوير المؤقت كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتحميل الغطاء في غرفة التحميل.أضف عازل التصوير المعد حديثًا، مع كونه لطيفًا لتجنب غسل الخلايا البكتيرية الزرقاء. بعد ذلك، ضع غطاء مستطيل على أعلى المخزن المؤقت للتصوير لمنعه من التفاعل مع الأكسجين في الهواء. قم بتشغيل الكاميرا وإضاءة LED والليزر، وافتح برنامج STORM.إضافة نصف قطرة من زيت الغمر على أعلى العدسة. تحميل الغرفة ، والتأكد من أن العدسة الهدف هو جعل الاتصال مع coverslip. وتفحص الإشارة مع ليزر 750 نانومتر.تحديد منطقة عينة تحتوي على كل من الخلايا وعلامات fiducial. ثم بدء تشغيل البرنامج لتصحيح العينة الانجراف. الحصول على صورة واحدة عريضة المستويات كمرجع ، مع زيادة ضرب الإلكترون الكاميرا في 300 ووقت التعرض من 30 مللي ثانية.زيادة 750 نانومتر ثيرتريشن شدة الليزر إلى ما يقرب من 4.5 كيلوواط لكل سنتيمتر مربع. بمجرد انتقال الفلوروفور إلى نمط وامض متفرق ، احصل على صورة واحدة فائقة الدقة من خلال جمع 10000 إطار في 33 هرتز. ثم إعادة بناء الصور فائقة الدقة من البيانات الخام كما هو موضح في بروتوكول النص.في هذه الدراسة، يتم استخدام STORM لتحقيق التصوير فائق الدقة من خلال تفعيل الفلوروبهورس الفردية القابلة للتبديل بشكل عشوائي. يتم تسجيل موقع كل فلوريوفور، ثم يتم بناء صورة فائقة الدقة بناء على هذه المواقع. في حين أن أطياف الامتصاص من بروكوروككوس قمم في 447 و 680 نانومتر والحد الأدنى من الامتصاص فوق 700 نانومتر، لا تزال خلايا Prochlorococcus MED4 تنبعث منها ارتفاع الفلوروس عندما تتعرض لأشعة الليزر 750 نانومتر عالية للغاية، وهو أمر مطلوب لتصوير العاصفة.بعد استخدام طريقة التحسس الضوئي الموضحة هنا لمدة 30 دقيقة ، وينظر إلى الخلايا 'autofluorescence إلى الانخفاض ، على الرغم من أن العديد من الخلايا مع autofluorescence لا تزال تكتشف. استطالة photobleaching إلى 60 دقيقة النتائج في معظم الخلايا فقدان autofluorescence. هذه النتائج تشير إلى أن طريقة photobleaching المتقدمة قادرة على الحد بشكل كبير من الفلوروس من الكائنات الضوئية.بعد الضوبلاخ، يتم استخدام STORM لتصور بروتين انقسام الخلايا، FtsZ، في الخلايا. باستخدام STORM ، يتم الكشف عن مورفولوجيا مفصلة من حلقة FtsZ. من خلال تدوير صور STORM ثلاثية الأبعاد ، تم تحديد أربعة أنواع مختلفة من المورفولوغات ، والعناقيد ، وحلقة غير مكتملة ، وحلقة كاملة ، وحلقات مزدوجة.من المهم أن نتذكر أن شدة الضوء ومدة photobleach قد تختلف بالنسبة للكائنات الحية المختلفة. بعد تطورها ، تمهد هذه الطريقة الطريق للباحثين الذين يرغبون في دراسة تنظيم البروتين والوظيفة المحتملة في الخلايا الضوئية بالتفصيل.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

في الوقت الحقيقي تصوير لايف تي خلية اشارة تشكيل مجمع

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

رصد هجرة الخلايا الجذعية باستخدام<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H التصوير بالرنين المغناطيسي

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

فائقة الدقة التصوير من الخلايا القاتلة الطبيعية المناعية المشبك على دعم الزجاج مستو الدهن طبقة ثنائية

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

التصوير CD4 T خلية الخلالية الهجرة في الأدمة الملتهبة

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

عالية متعددة، والتصوير فائقة الدقة من الخلايا T باستخدام مادستورم

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

تقييم استجابات المضيف الممرض ونجاعة اللقاح في الفئران

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...