Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Forfatterne takke Daiying Xu for hendes teknisk bistand og kommentarer til manuskriptet. Denne undersøgelse er støttet af tilskud fra den National Natural Science Foundation of China (projektnummer 41476147) og forskningsråd i tilskud af Hong Kong Special Administrative Region, Kina (projektnumre 689813 og 16103414).

1. prøve forberedelse og fiksering
<ol><li>Podes 1 mL af axenic Prochlorococcus MED4 til 5 mL havvand-baserede Pro99 medium12. Vokse Prochlorococcus kulturer ved 23 ° C under lys med en intensitet på 35 µmol fotoner/m2s. fem dage senere, indsamle 1 mL af kultur i en 1,5 mL tube. Bemærk: Fem dage efter podning, Prochlorococcus MED4 vil nå den sene log fase, med ca 108 celler/mL, som er relevant for STORM billeddannelse.</li>
	<li>Tilsætte...

<ol>
	<li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier:+Super-resolution+imaging+of+cells.">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Wave+of+Cellular+Imaging.">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).</li><li>Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Komis, G., &#352;amajov&#225;, O., Ove&#269;ka, M., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+in+Plant+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li><li>Schubert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+-+Applications+in+Plant+Cell+Research.">Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Superresolution+Imaging+of+the+FtsZ+Ring+during+Cell+Division+of+the+Cyanobacterium+Prochlorococcus.">Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus.</a> mbio. 8 (6), e00657 (2017).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division:+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E.+coli+cell+fission.">Advances in understanding E. coli cell fission.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).</li><li>Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+different+nitrogen+sources+by+the+marine+cyanobacteria+Prochlorococcus+and+Synechococcus.">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li><li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope.">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).</li><li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuickPALM:+3D+real-time+photoactivation+nanoscopy+image+processing+in+ImageJ.">QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ.</a> Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+photosynthesis+in+the+oceans:+The+origins+and+significance+of+divergent+light-harvesting+strategies.">Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies.</a> Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).</li><li>Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus:+The+structure+and+function+of+collective+diversity.">Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).</li><li>Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus+and+Synechococcus+-+a+Comparative-Study+of+Their+Optical-Properties+in+Relation+To+Their+Size+and+Pigmentation.">Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation.</a> Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).</li><li>Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+3D+super-resolution+microscopy+reveals+Caulobacter+crescentusin+vivo+Z-ring+organization.">High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).</li><li>Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+multiple+biomarkers+in+captured+rare+cells+by+sequential+immunostaining+and+photobleaching.">Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching.</a> Methods. 64 (2), 108-113 (2013).</li><li>Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+photobleaching+necessary+for+Raman+imaging+of+bone+tissue+using+a+green+laser?.">Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).</li><li>Haxo, F. T., Blinks, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+Action+Spectra+of+Marine+Algae.">Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae.</a> The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).</li><li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin:+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria.">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li></ol>

I denne protokol, vi beskrev en procedure for at reducere autofluorescence af cyanobacterium Prochlorococcus (figur 3 c) og derefter, immunostain proteiner i cellerne, som gjorde det muligt for os at udnytte STORM til at studere den 3D-FtsZ ring morfologier i Prochlorococcus (figur 4). Denne protokol kan vedtages for super-opløsning imaging i andre fotosyntetiske organismer.
Tidligere undersøgelser på fotosyntetis...

Super-opløsning microscopies kan bryde diffraktion grænse lysets og give billeder inden for sub diffraktion resolutioner (< 200 nm). De har været meget udbredt i mange organismer til at studere proteiner lokalisering og subcellulært strukturer. Major super-resolution mikroskopi metoder omfatter strukturerede belysning mikroskopi (SIM), stimuleret emission udtynding mikroskopi (STED), STORM og photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM). De mekanismer og anvendelser af disse super-opløsning mikroskoper har været gennemgået andetsteds1,2.
STORM kan opnå en opløsning så høj som 10 nm af rumlig adskillelse3,4. For STORM, kun ét molekyle i en diffraktion-begrænset region er aktiveret ("om") og resten af molekylerne holdes inaktiverede ("off"). Af en ophobning af hurtig tænd og - ud af enkelt molekyler, kan en "diffraktion-ubegrænset" billede være genereret3. I mellemtiden, mange slags organiske farvestoffer og fluorescerende proteiner er gældende i STORM, giver mulighed for en nem opgradering fra regelmæssige Fluorescens mikroskopi til høj opløsning mikroskopi5,6.
STORM har ikke er almindeligt anvendt i fotosyntetiserende celler, såsom cyanobakterier, alger, og planteceller med grønkorn7,8, som skyldes, at STORM kræver høj laser intensitet til at drive photoswitching. Høj intensitet laser ugunstig ophidser stærk autofluorescence baggrund i fotosyntetiserende celler og forstyrrer den enkelt-molekyle lokalisering i STORM billedbehandling. For at bruge STORM til at undersøge subcellulært strukturer eller protein interaktioner i fotosyntetiserende celler, udviklede vi en photobleaching protokol for at slukke baggrund autofluorescence signaler9. I en rutinemæssig immunfluorescent farvning procedure udsættes prøver for hvidt lys med en høj intensitet under trinnet blokering, der sænker autofluorescence af fotosyntetiserende celler til at opfylde kravene til STORM. Således, denne protokol gør det muligt at undersøge pigmenteret organismer med STORM.
Her beskriver vi protokol for at bruge STORM for at billede FtsZ ring organisation i den encellede picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ er en stærkt bevarede tubulin-lignende cytoskeletal proteiner, der polymeriserer for at danne en ring struktur (Z-ring) omkring omkredsen af en celle10 og er vigtig for celledeling11. Bevaret Prochlorococcus celler er første photobleached til reduktion af autofluorescent baggrund og immunostained med en primær anti-FtsZ antistof, og derefter en sekundær anti-kanin IgG (H + L) antistof konjugeret med et fluorophore (f.eks. , Alexa Fluor 750). Til sidst, bruges STORM til at observere de detaljerede FtsZ ring organisationer i Prochlorococcus under forskellige cellecyklus faser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

Super-resolution mikroskopi har været meget anvendt til at undersøge protein interaktioner og subcellulært strukturer i mange organismer. I fotosyntetiske organismer, men den laterale opløsning på Super-resolution imaging er kun ~ 100 nm. Lav-opløsning er hovedsagelig på grund af den høje autofluorescence baggrund af fotosyntetiserende celler forårsaget af høj intensitet lasere, der er nødvendige for super-opløsning imaging, såsom stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM). Her, beskriver vi en photobleaching-assisteret STORM metode som blev udviklet for nylig til imaging den marine picocyanobacterium Prochlorococcus. Efter photobleaching, autofluorescence af Prochlorococcus reduceres effektivt, så denne STORM kan udføres med en lateral opløsning på ~ 10 nm. Brug denne metode, vi erhverve i vivo tre-dimensionel (3-D)-organisation af FtsZ proteinet og karakterisere fire forskellige FtsZ ring morfologier under celle cyklus af Prochlorococcus. Metoden vi beskrive her kan vedtages for super-opløsning billeddannelse af andre fotosyntetiske organismer.

STORM opnår super-resolution billeddannelse ved at aktivere individuelle photoswitchable fluorophores stochastically. Placeringen af hver fluorophore registreres og en super-opløsning billede er derefter bygget baseret på disse steder4. Derfor er præcisionen af fluorophore placering vigtige for super-opløsning billede genopbygning. Absorptionsspektra af Prochlorococcus peak på 447 nm og 680 nm,og Prochlorococcus har en minimal absorption ved...

Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Her beskriver vi en photobleaching metode til at reducere autofluorescence af cyanobakterier. Efter photobleaching anvendes stokastiske optisk genopbygning mikroskopi til at opnå tre-dimensionelle super-opløsning billeder af cyanobakteriel FtsZ ring.

Photobleaching giver mulighed for super-opløsning billeddannelse af FtsZ Ring i Cyanobacterium Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare vigtige spørgsmål om proteinlokalisering og dynamikken i fotosyntetiske organismer. Ved at kombinere fotobleaching-metoden med superopløsningsmikroskop er vi i stand til at detektere proteindynamikken i fotosyntetiske organismer i en bemærkelsesværdig detalje. Denne metode giver ikke kun indsigt i proteindynamikken i Prochlorococcus.Det kan også anvendes på mange andre organismer, der indeholder radio-re-dop-sing og bacteriochlorophyll. Demonstrere denne procedure vil være Yanxin Liu, en kandidat studerende fra mit laboratorium. Til at begynde, tilsættes fem milliliter havvand-baserede Pro99 medium til en kultur kolbe og inokulere det med en milliliter Prochlorococcus MED4.Dyrk Prochlorococcus ved 23 grader Celsius under et lys med en intensitet på 35 mikromol fotoner per kvadratmeter. Efter fem dage, indsamle en milliliter af kulturen i en 1,5 milliliter rør. Tilføj 100 mikroliter frisklavet formaldehyd til røret for at fastsætte kulturen.Inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 20 minutter. Drej derefter prøven ned ved 13, 500 gange G i et minut. Fjern supernatanten, og opsplit cellerne i 100 mikroliter af Pro99-mediet.Prøven opbevares ved fire grader Celsius i mørke, indtil den er klar til at udføre immunstaining. Først vortex hætteglasset af polystyren perler. Ved hjælp af 50% ethanol, forberede en en-til-20, 000 fortynding som en arbejdsgruppe gylle.Tænd for kogezonen og indstille temperaturen til 120 grader Celsius. Dernæst placere coverslips på kogepladen. Der indlæses 100 mikroliter af arbejdssalgerningen på hver dækslæb, og dækslerne på kogepladen inkuberes i 10 minutter.Derefter forsigtigt overføre coverslips til petriskåle perle-side op til opbevaring ved stuetemperatur. Når du er klar til at fralægge coverslips, hente en, og sørg for, at det er perle-side op. Tilsæt 100 mikroliter af en milligram pr. milliliter poly-L-lysinopløsning til midten af dækslæbet og lad den sidde ved stuetemperatur i 30 minutter.Derefter skal du bruge en pipette til omhyggeligt at aspirere enhver utilsluttet poly-L-lysin og overføre den til et 1,5 milliliterrør. Opbevar denne poly-L-lysin ved fire grader Celsius til senere brug. Skyl dækslet med 10 milliliter ultrafiltreret vand i en 60-millimeter petriskål, og tør den derefter kortvarigt med en køkkenrulle.Overfør den overtræbte dækslæb til en ny petriskål med Parafilm i bunden, som vil blive brugt som farvningskål. Læg 100 mikroliter af den faste prøve på dækslæbet, og lad den sidde i 30 minutter for at tillade celletilbehør. Brug derefter en køkkenrulle til at absorbere den resterende opløsning og derefter overføre dækslæd til en brønd i en 12-brønd plade til vask.Tilføj en milliliter PBS buffer til brønden for at vaske coverslip. Fjern derefter PBS og tilsæt en milliliter frisk PBS for at vaske dækslækkeren en gang til. Brug en pipette til at fjerne PBS og erstatte den med en milliliter frisklavet permeabiliseringsbuffer.Indskuvning vaskeskålen ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Fjern derefter permeabiliseringsbufferen. Begynd vaskeprocessen ved at tilføje en milliliter frisk PBS-buffer.Læg vaskeskålen på en shaker for forsigtigt at agitere skålen i fem minutter. Derefter fjernes PBS, og vaskeprocessen gentages tre gange. Overfør den vaskede dækslæd til farvningskålen.Tilføj 50 mikroliter af blokerende buffer på toppen af dækslæbet. Placer hele farvning parabol på is og derefter flytte den under xenon lyskilde til fotobleaching i mindst 60 minutter. Efter fotobleaching og blokering, skal du bruge kanten af en køkkenrulle til at fjerne blokering buffer.Fortyndes først en mikroliter anti-FtsZ antistof i 99 mikroliter af blokerende buffer. Placer 50 mikroliter af det fortyndede primære antistof på dækslæbet og inkuber det ved stuetemperatur i 30 minutter. Overfør dækslæd til en brønd af vaskeskålen.For at begynde vasken, tilsæt en milliliter PBS. Derefter overføres vaskeskålen til en shaker og ryst den forsigtigt i fem minutter. Fjern PBS og gentag hele vaskeprocessen tre gange.Dernæst overføres dækslæbet til farvningskålen. Placer 50 mikroliter af det fortyndede sekundære antistof på dækslæbet og inkuber det i mørke og ved stuetemperatur i 30 minutter. Overfør dækslæden tilbage til vaskeskålen.For at begynde vasken, tilsæt en milliliter PBS. Wrap vaskeskålen i aluminiumsfolie for at beskytte den mod lys. Overfør pladen til shakeren og ryst den forsigtigt i fem minutter.Fjern PBS og gentag hele vaskeprocessen tre gange. Umiddelbart før STORM-billeddannelsen skal du forberede en milliliter billedbuffer som beskrevet i tekstprotokollen. Læg dækslingen ind i læssekammeret.Tilsæt frisklavet billeddannelse buffer, være blid for at undgå at vaske de cyanobakterielle celler. Derefter skal du placere en rektangulær dækslæb oven på billedbufferen for at forhindre, at den reagerer med ilten i luften. Tænd kameraet, LED-lyset og laseren, og åbn STORM-softwaren.Tilføj en halv dråbe nedsænkning olie på toppen af linsen. Læg kammeret, og sørg for, at den objektive linse er at komme i kontakt med coverslip. Og undersøg signalet med en 750-nanometerlaser.Identificer et eksempelområde, der indeholder både celler og fiducialmarkører. Start derefter softwaren til prøve drifting korrektion. Anskå et bredt arkiverede billede som reference, med kameraet elektron multiplikationsforøgelse ved 300 og en eksponeringstid på 30 millisekunder.Øg 750-nanometer excitation laser intensitet til ca 4,5 kilowatt per kvadratcentimeter. Når fluorophores har skiftet til en sparsom blinkende mønster, erhverve en super-opløsning billede ved at indsamle 10,000 billeder på 33 hertz. Rekonstruer derefter superopløsningsbillederne fra de rådata, der er beskrevet i tekstprotokollen.I denne undersøgelse bruges STORM til at opnå superopløsningsbilleddannelse ved at aktivere individuelle fotoskiftelige fluorophores stochastisk. Placeringen af hver fluorophore registreres, og en super-opløsning billede er derefter konstrueret baseret på disse steder. Mens absorptionsspektre af Prochlorococcus toppe ved 447 og 680 nanometer og har minimum absorption over 700 nanometer, Prochlorococcus MED4 celler stadig udsender høj autofluorescens, når de udsættes for en ekstremt høj intensitet af 750-nanometer laser, som er nødvendig for STORM imaging.Efter at have brugt den fotobleachingsmetode, der er beskrevet her i 30 minutter, ses cellernes autofluorescens at falde, selv om flere celler med autofluorescens stadig registreres. Forlængelse af fotobleaching til 60 minutter resulterer i de fleste af cellerne mister deres autofluorescens. Disse resultater viser, at den udviklede fotobleaching metode er i stand til i høj grad at reducere autofluorescens af fotosyntetiske organismer.Efter photobleaching bruges STORM til at visualisere celledelingsproteinet, FtsZ, i cellerne. Ved hjælp af STORM afsløres en detaljeret morfologi af FtsZ-ringen. Ved at rotere 3D STORM-billederne blev fire forskellige typer morfologier identificeret, klynger, en ufuldstændig ring, en komplet ring og dobbeltringe.Det er vigtigt at huske, at lysintensiteten og varigheden af fotobleach kan variere for forskellige organismer. Efter sin udvikling, denne metode baner vejen for forskere, der ønsker at studere protein organisation og potentielle funktion i fotosyntetiske celler i detaljer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live Imaging af T-celle signalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Super-resolution Imaging af Natural Killer Cell Immunologisk Synapse på et glas-understøttet Planar lipiddobbeltlaget

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Imaging CD4 T-celle Interstitiel Migration i det betændte Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ og kvantitativ analyse af den immun Synapse i det menneskelige System, ved hjælp af Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Meget multiplexeret, superopløselig billeddannelse af T-celler ved hjælp af madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Høj overførselshastighed måling af Plasma membran genforsegling effektivitet i pattedyrceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering af vært-patogen svar og Vaccine effekt i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...