Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

De auteurs bedanken Daiying Xu voor haar technische bijstand en de reacties op het manuscript. Deze studie wordt ondersteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (projectnummer 41476147) en de Onderzoeksraad van de speciale administratieve regio Hongkong, China (projectnummers 689813 en 16103414) in verleent.

1. voorbereiding en fixatie van de proeven
<ol><li>1 mL van een Prochlorococcus MED4 tot 5 mL van de zeewater gebaseerde Pro99 middellange12beënten. Grow Prochlorococcus culturen bij 23 ° C onder het licht met een intensiteit van 35 µmol fotonen/m2s. vijf dagen later, verzamelen van 1 mL van de cultuur in een 1.5-mL-buis. Opmerking: Vijf dagen na de inenting, Prochlorococcus MED4 zal bereiken de late fase van de log, met ongeveer 108 cellen/...

<ol>
	<li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier:+Super-resolution+imaging+of+cells.">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Wave+of+Cellular+Imaging.">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).</li><li>Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Komis, G., &#352;amajov&#225;, O., Ove&#269;ka, M., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+in+Plant+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li><li>Schubert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+-+Applications+in+Plant+Cell+Research.">Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Superresolution+Imaging+of+the+FtsZ+Ring+during+Cell+Division+of+the+Cyanobacterium+Prochlorococcus.">Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus.</a> mbio. 8 (6), e00657 (2017).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division:+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E.+coli+cell+fission.">Advances in understanding E. coli cell fission.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).</li><li>Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+different+nitrogen+sources+by+the+marine+cyanobacteria+Prochlorococcus+and+Synechococcus.">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li><li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope.">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).</li><li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuickPALM:+3D+real-time+photoactivation+nanoscopy+image+processing+in+ImageJ.">QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ.</a> Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+photosynthesis+in+the+oceans:+The+origins+and+significance+of+divergent+light-harvesting+strategies.">Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies.</a> Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).</li><li>Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus:+The+structure+and+function+of+collective+diversity.">Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).</li><li>Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus+and+Synechococcus+-+a+Comparative-Study+of+Their+Optical-Properties+in+Relation+To+Their+Size+and+Pigmentation.">Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation.</a> Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).</li><li>Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+3D+super-resolution+microscopy+reveals+Caulobacter+crescentusin+vivo+Z-ring+organization.">High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).</li><li>Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+multiple+biomarkers+in+captured+rare+cells+by+sequential+immunostaining+and+photobleaching.">Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching.</a> Methods. 64 (2), 108-113 (2013).</li><li>Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+photobleaching+necessary+for+Raman+imaging+of+bone+tissue+using+a+green+laser?.">Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).</li><li>Haxo, F. T., Blinks, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+Action+Spectra+of+Marine+Algae.">Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae.</a> The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).</li><li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin:+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria.">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li></ol>

In dit protocol, beschreven we een procedure aanzienlijk verminderen de autofluorescence van de cyanobacterium Prochlorococcus (Figuur 3 c) en, vervolgens, immunokleuring de eiwitten in de cellen, waardoor ons te gebruiken om te bestuderen van de 3D-FtsZ STORM ring morphologies in Prochlorococcus (Figuur 4). Dit protocol kan worden vastgesteld voor super-resolutie beeldvorming in andere fotosynthetische organismen.
E...

Super resolutie microscopies kunnen breken de grens van de diffractie van licht en bieden een beeld binnen sub diffractie resoluties (< 200 nm). Ze hebben veel gebruikt in vele organismen eiwit lokalisatie en subcellular structuren te bestuderen. Grote super resolutie Microscopie methodes omvatten gestructureerde verlichting microscopie (SIM), gestimuleerd emissie uitputting microscopie (STED), STORM en photoactivated lokalisatie microscopie (PALM). De mechanismen en de toepassingen van deze super resolutie microscopen geweest herzien elders1,2.
STORM kan bereiken een resolutie zo hoog als 10 nm door ruimtelijke scheiding3,4. Voor de STORM, slechts één molecuul binnen een regio diffractie-limited is geactiveerd ("on") en de rest van de moleculen geïnactiveerd ("off") worden bewaard. Door een accumulatie van snelle switch-on en - off van afzonderlijke moleculen, kan een "diffractie-onbeperkt" beeld worden gegenereerd3. Ondertussen zijn vele soorten organische kleurstoffen en fluorescente proteïnen die van toepassing zijn in de STORM, waardoor een gemakkelijke upgrade van regelmatige fluorescentie microscopie naar hoge resolutie microscopie5,6.
STORM is niet algemeen toegepast in fotosynthetische cellen, zoals cyanobacteriën, algen, en plantaardige cellen met chloroplasten7,8, die te wijten aan het feit dat STORM is vereist hoge laser intensiteit aan station photoswitching. De hoge intensiteit laser ongunstig prikkelt sterke autofluorescence achtergrond in fotosynthetische cellen en interfereert met de lokalisatie van de single-molecuul in STORM beeldbewerking. Om te onderzoeken de subcellular structuren of eiwitinteractie in fotosynthetische cellen gebruiken als STORM, ontwikkelden we een photobleaching protocol om de achtergrond autofluorescence signalen9doven. In een immunefluorescentie kleuring routineprocedure, worden specimens blootgesteld aan wit licht van een hoge intensiteit tijdens de blokkerende stap, die de autofluorescence van fotosynthetische cellen voldoen aan de eisen voor STORM verlaagt. Dit protocol maakt het dus mogelijk om te onderzoeken gepigmenteerde organismen met STORM.
Hier beschrijven we het protocol voor het gebruik van STORM om het imago van de organisatie van FtsZ ring in de eencellige picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ is een zeer geconserveerde tubuline-achtige cytoskeletal eiwit die polymerizes om te vormen van een ring-structuur (de Z-ring) rond de omtrek van een cel10 en is van essentieel belang voor de celdeling11. Behouden van Prochlorococcus cellen zijn eerste photobleached de autofluorescent achtergrond en immunostained met een primaire anti-FtsZ antilichaam te verminderen, en vervolgens een secundair anti-konijn IgG (H + L) antilichaam is geconjugeerd met een fluorophore (b.v. , Alexa Fluor 750). Uiteindelijk, wordt STORM gebruikt voor het observeren van de gedetailleerde FtsZ ring organisaties in Prochlorococcus tijdens verschillende celcyclus stadia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

Super resolutie microscopie is wijd verbeid gebruikt om eiwitinteractie en subcellular structuren in vele organismen te studeren. In fotosynthetische organismen, is de resolutie van de laterale van super resolutie beeldvorming echter alleen ~ 100 nm. De lage resolutie is vooral te wijten aan de achtergrond van de hoge autofluorescence van fotosynthetische cellen veroorzaakt door hoge intensiteit lasers die vereist voor super-resolutie beeldvorming, zoals stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM zijn). Hier beschrijven we een photobleaching-bijgewoonde STORM methode die ontwikkeld werd onlangs voor de mariene picocyanobacterium Prochlorococcusimaging. Na photobleaching, de autofluorescence van Prochlorococcus is effectief verminderd zodat die STORM kan worden uitgevoerd met een laterale resolutie van ~ 10 nm. Met behulp van deze methode, wij verwerven de in vivo driedimensionale (3-D)-organisatie van het FtsZ eiwit en karakteriseren van vier verschillende FtsZ ring morphologies tijdens de celcyclus van Prochlorococcus. De methode we hier beschrijven zouden kunnen worden vastgesteld voor de super resolutie beeldvorming van andere fotosynthetische organismen.

STORM behaalt super resolutie beeldvorming door het activeren van individuele photoswitchable fluorophores stochastically. De locatie van elke fluorophore wordt geregistreerd en een super resolutiebeeld is dan opgebouwd op basis van deze locaties4. De nauwkeurigheid van de locatie van de fluorophore is daarom belangrijk voor de wederopbouw van de super-resolutie afbeelding. De spectra van de absorptie van Prochlorococcus piek bij 447 nm en 680 nm,en Pr...

Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Hier beschrijven we een photobleaching methode ter vermindering van de autofluorescence van cyanobacteriën. Na photobleaching, wordt stochastische optische wederopbouw microscopie gebruikt voor het verkrijgen van driedimensionale Super resolutiebeelden van de cyanobacteriën FtsZ ring.

Photobleaching maakt super resolutie beeldvorming van de FtsZ Ring in de Cyanobacterium Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over eiwitlokalisatie en de dynamiek in fotosynthetische organismen. Door de fotobleachingmethode te combineren met een microscoop met superresolutie, zijn we in staat om de eiwitdynamiek van fotosynthetische organismen tot in de kleinste details te detecteren. Deze methode geeft niet alleen inzicht in de eiwitdynamiek van Prochlorococcus.Het kan ook worden toegepast op vele andere organismen die radio-re-dop-sing en bacteriochlorofyl. Het aantonen van deze procedure zal Yanxin Liu zijn, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Om te beginnen, voeg vijf milliliter van zeewater gebaseerde Pro99 medium aan een cultuurfles en inenting met een milliliter prochlorococcus MED4.Laat de Prochlorococcus groeien bij 23 graden Celsius onder een licht met een intensiteit van 35 micromole fotonen per vierkante meter. Na vijf dagen, verzamel een milliliter van de cultuur in een 1,5 milliliter buis. Voeg 100 microliter vers bereide formaldehyde toe aan de buis om de cultuur te repareren.Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Draai vervolgens het monster een minuut lager dan 13,500 keer G. Verwijder de supernatant en resuspend de cellen in 100 microliter van Pro99 medium.Bewaar het monster op vier graden Celsius in het donker tot het klaar is om immunostaining uit te voeren. Ten eerste, vortex de flacon van polystyreen kralen. Bereid met 50% ethanol een één-op-20.000 verdunning als werkende drijfmest.Zet de kookplaat aan en stel de temperatuur in op 120 graden Celsius. Plaats vervolgens de coverslips op de kookplaat. Laad 100 microliter van de werkende drijfmest op elk deklip en ontcubeer de afdekplaten gedurende 10 minuten op de kookplaat.Breng vervolgens voorzichtig de coverslips over naar Petri gerechten kraal-kant omhoog voor opslag bij kamertemperatuur. Wanneer klaar om de coverslips jas, op te halen een, ervoor te zorgen dat het kraal-kant omhoog. Voeg 100 microliter van een 1 milligram per milliliter poly-L-lysine oplossing toe aan het midden van de coverslip en laat het 30 minuten op kamertemperatuur zitten.Gebruik hierna een pipet om ongebonden poly-L-lysine voorzichtig aan tezuiden en over te brengen naar een buis van 1,5 milliliter. Bewaar deze poly-L-lysine op vier graden Celsius voor later gebruik. Spoel de coverslip met 10 milliliter ultra gefilterd water in een petrischaaltje van 60 millimeter en droog deze vervolgens kort met een papieren handdoek.Breng de gecoate coverslip naar een nieuwe petrischaal met Parafilm aan de onderkant, die zal worden gebruikt als de kleuring schotel. Laad 100 microliter van het vaste monster op de coverslip en laat het 30 minuten zitten om de celbevestiging toe te staan. Gebruik vervolgens een papieren handdoek om de resterende oplossing te absorberen en breng de coverslip vervolgens over naar een put in een 12-put plaat om te wassen.Voeg een milliliter PBS buffer aan de put om de coverslip te wassen. Verwijder vervolgens de PBS en voeg een milliliter verse PBS toe om de coverslip een tweede keer te wassen. Gebruik een pipet om de PBS te verwijderen en te vervangen door een milliliter vers bereide permeabilisatie buffer.Broed de wasschaal 20 minuten lang uit op 37 graden Celsius. Verwijder vervolgens de permeabilisatiebuffer. Begin het wasproces door het toevoegen van een milliliter verse PBS buffer.Leg de wasschaal op een shaker om de schotel vijf minuten zachtjes te roeren. Verwijder hierna de PBS en herhaal het wasproces drie keer. Breng de gewassen hoezenlip naar de kleuring schotel.Voeg 50 microliter blokkeerbuffers toe aan de bovenkant van de coverslip. Plaats de gehele kleuring schotel op ijs en dan verplaatsen onder de xenon lichtbron voor fotobleaching voor ten minste 60 minuten. Nadat u fotobleaching en blokkering hebt gemaakt, gebruikt u de rand van een papieren handdoek om de blokkeringsbuffer te verwijderen.Ten eerste, verdun een microliter anti-FtsZ-antilichaam in 99 microliter blokkeerbuffers. Plaats 50 microliter van het verdunde primaire antilichaam op de afdekken en broed het 30 minuten op kamertemperatuur. Breng de hoezenlip over in een put van de wasschaal.Om te beginnen met de was, voeg een milliliter PBS. Breng de wasschaal vervolgens over op een shaker en schud deze zachtjes gedurende vijf minuten. Verwijder de PBS en herhaal het hele wasproces drie keer.Breng vervolgens de hoezenlip over op de kleuringsschaal. Plaats 50 microliter van het verdunde secundaire antilichaam op de coverslip en broed het 30 minuten in het donker en bij kamertemperatuur. Breng de hoezenlip terug naar de wasschaal.Om te beginnen met de was, voeg een milliliter PBS. Wikkel de wasschaal in aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht. Breng de plaat naar de shaker en schud hem vijf minuten zachtjes.Verwijder de PBS en herhaal het hele wasproces drie keer. Bereid vlak voor de STORM-beeldvorming een milliliter beeldverkeringsbuffer voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Laad de afdek in de laadkamer.Voeg de vers bereide beeldvorming buffer, zacht om te voorkomen dat het afwassen van de cyanobacteriële cellen. Plaats hierna een rechthoekige coverslip bovenop de beeldbuffer om te voorkomen dat deze reageert met de zuurstof in de lucht. Zet de camera, het LED-licht en de laser aan en open de STORM-software.Voeg een halve druppel onderdompelingsolie toe bovenop de lens. Laad de kamer, om ervoor te zorgen dat de objectieve lens contact maakt met de coverslip. En onderzoek het signaal met een laser van 750 nanometer.Identificeer een voorbeeldgebied dat zowel cellen als fiduciële markeringen bevat. Start dan de software voor monster drifting correctie. Verwerf een breed gearchiveerde beelden als referentie, met de camera elektronen vermenigvuldiging te krijgen op 300 en een belichtingstijd van 30 milliseconden.Verhoog de 750 nanometer excitatie laser intensiteit tot ongeveer 4,5 kilowatt per vierkante centimeter. Zodra de fluoroforen zijn overgestapt naar een schaars knipperend patroon, verkrijg je één afbeelding met een superresolutie door 10.000 frames op 33 hertz te verzamelen. Reconstrueer vervolgens de afbeeldingen met superresolutie uit de ruwe gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol.In deze studie, STORM wordt gebruikt om super-resolutie beeldvorming te bereiken door het activeren van individuele foto-switchable fluorofoof stoofspeld. De locatie van elke fluorofophore wordt geregistreerd en een afbeelding met een superresolutie wordt vervolgens op basis van deze locaties geconstrueerd. Terwijl de absorptiespectra van Prochlorococcus pieken op 447 en 680 nanometer en heeft minimale absorptie boven 700 nanometer, Prochlorococcus MED4 cellen nog steeds uitstoten hoge autofluorescentie bij blootstelling aan een extreem hoge intensiteit van de 750 nanometer laser, die nodig is voor STORM beeldvorming.Na het gebruik van de hier beschreven fotobleachingmethode gedurende 30 minuten, wordt de autofluorescentie van de cellen gezien om af te nemen, hoewel verschillende cellen met autofluorescentie nog steeds worden gedetecteerd. Het verlengen van de fotobleaching tot 60 minuten resulteert in de meerderheid van de cellen verliezen hun autofluorescentie. Deze resultaten geven aan dat de ontwikkelde fotobleaching methode in staat is om de autofluorescentie van fotosynthetische organismen sterk te verminderen.Na het fotobleaching wordt STORM gebruikt om het celdelingeiwit FtsZ in de cellen te visualiseren. Met behulp van STORM wordt een gedetailleerde morfologie van de FtsZ-ring onthuld. Door het draaien van de 3D STORM beelden, vier verschillende soorten morfologieën werden geïdentificeerd, clusters, een onvolledige ring, een complete ring, en dubbele ringen.Het is belangrijk om te onthouden dat de lichtintensiteit en de duur van de fotobleach kan verschillen voor verschillende organismen. Na de ontwikkeling maakt deze methode de weg vrij voor onderzoekers die eiwitorganisatie en potentiële functie in fotosynthetische cellen tot in detail willen bestuderen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo imaging van transgene Leishmania parasieten in een Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Met behulp van Bioluminescent Imaging naar Synergie Onderzoek Between Streptococcus pneumoniae En influenza A-virus bij jonge muizen

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritische cel-migratie met behulp van<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Super-resolutie beeldvorming van de Natural Killer Cell Immunological Synapse op een glas-ondersteunde Planar lipidendubbellaag

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Zeer Multiplexed, Superresolutie Imaging van T-cellen Met behulp van madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...