Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Les auteurs remercient Daiying Xu pour son assistance technique et les commentaires sur le manuscrit. Cette étude est financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro du projet 41476147) et le Conseil de subventions de recherche de la région Administrative spéciale de Hong Kong, Chine (numéros de projet 689813 et 16103414).

1. préparation des échantillons et Fixation
<ol><li>Inoculer 1 mL d’axéniques Prochlorococcus med 4 à 5 mL des axée sur l’eau de mer Pro99 moyenne12. Culture de Prochlorococcus cultures à 23 ° C, sous la lumière d’une intensité de 35 µmol photons/m2s. cinq jours plus tard, prélever 1 mL de culture dans un tube de 1,5 mL. NOTE : Cinq jours après l’inoculation, Prochlorococcus MED4 atteindra la phase logarithmique tardive, avec environ ...

<ol>
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Dans ce protocole, nous avons décrit une procédure pour réduire de façon significative l’autofluorescence de la cyanobactérie Prochlorococcus (Figure 3) et, ensuite, réagissent les protéines dans les cellules, ce qui nous a permis d’utiliser la tempête afin d’étudier la FtsZ 3D morphologies anneau en Prochlorococcus (Figure 4). Ce protocole pourrait être adopté pour l’imagerie de Super-résolution chez d’autres organismes p...

Microscopies Super-résolution peuvent briser la limite de diffraction de la lumière et fournir des images dans les résolutions de diffraction sous (< 200 nm). Ils ont été largement utilisés dans de nombreux organismes pour étudier la localisation des protéines et des structures subcellulaires. Major Super-résolution méthodes de microscopie comprennent illumination structurée microscopie (SIM), stimulée par la microscopie d’appauvrissement de la couche d’émission (STED), STORM et microscopie de localisation de photoactivation (PALM). Les mécanismes et les applications de ces super-résolution microscopes ont été examinés ailleurs1,2.
ORAGE peut aboutir à une résolution aussi élevée que 10 nm par séparation spatiale3,4. Pour STORM, qu’une seule molécule dans une région limitée par la diffraction est activée (« on ») et le reste des molécules restent inactivés (« off »). Par une accumulation de marche rapide et - à côté de molécules simples, une image « diffraction-illimité » peut être généré3. Pendant ce temps, plusieurs sortes de colorants organiques et des protéines fluorescentes sont applicables dans la tempête, ce qui permet une mise à niveau facile de microscopie de fluorescence ordinaire à la microscopie à haute résolution5,6.
TEMPÊTE n’a pas été largement appliquée dans les cellules photosynthétiques, comme les cyanobactéries, algues, et les cellules végétales avec chloroplastes7,8, qui est dû au fait que tempête exige intensité laser haute de disque photoswitching. Le laser de haute intensité défavorablement excite fort autofluorescence fond dans les cellules photosynthétiques et interfère avec la localisation de la molécule unique en imagerie de la tempête. Afin d’utiliser tempête pour étudier les structures subcellulaires ou les interactions de protéine dans les cellules photosynthétiques, nous avons élaboré un protocole de photoblanchiment pour étancher l’arrière-plan autofluorescence signaux9. Dans une méthode systématique de la coloration par immunofluorescence, spécimens sont exposés à la lumière blanche de forte intensité pendant l’étape de blocage, qui abaisse l’autofluorescence des cellules photosynthétiques pour répondre aux exigences de la tempête. Par conséquent, ce protocole rend possible d’enquêter sur les organismes pigmentés avec STORM.
Nous décrivons ici le protocole pour utiliser tempête à l’image de l’organisation de bague FtsZ dans le picocyanobacterium unicellulaire Prochlorococcus. FtsZ est une protéine du cytosquelette de tubuline-comme hautement conservée qui se polymérise pour former une structure d’anneau (l’anneau Z) autour de la circonférence d’une cellule10 et est essentielle pour la division cellulaire11. Prochlorococcus cellules sont photobleached première pour réduire l’arrière-plan auto-fluorescente et immunomarquage avec un anticorps anti-FtsZ primaire et ensuite, un anticorps secondaire au anti-lapin IgG (H + L) se sont réuni avec un fluorophore (par exemple , Alexa Fluor 750). Finalement, STORM est utilisé pour observer les organisations d’anneau FtsZ détaillées dans Prochlorococcus pendant les étapes du cycle de cellules différentes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

Microscopie de Super-résolution a été largement utilisée pour étudier les interactions entre protéines et structures subcellulaires chez de nombreux organismes. Des organismes photosynthétiques, cependant, la résolution latérale de l’imagerie de Super-résolution est seulement ~ 100 nm. La faible résolution résulte principalement de l’arrière-plan de l’autofluorescence élevé des cellules photosynthétiques causée par des lasers de haute intensité qui sont nécessaires pour l’imagerie Super-résolution, telles que la microscopie stochastique reconstruction optique (tempête). Nous décrivons ici une méthode assistée par photoblanchiment STORM a été mis au point récemment pour l’imagerie de la marine picocyanobacterium Prochlorococcus. Après photoblanchiment, l’autofluorescence de Prochlorococcus est effectivement réduit donc cette tempête peut être effectuée avec une résolution latérale d’environ 10 nm. En utilisant cette méthode, nous acquérir l’organisation in vivo en trois dimensions (3d) de la protéine FtsZ et caractériser les quatre différentes morphologies de bague FtsZ durant le cycle cellulaire de Prochlorococcus. La méthode que nous décrivons ici pourrait être adoptée pour l’imagerie de Super-résolution d’autres organismes photosynthétiques.

TEMPÊTE atteint imagerie Super-résolution en activant des fluorophores individuels ayant stochastique. La position de chaque molécule est enregistrée et une image de Super-résolution est alors construite selon ces emplacements4. Par conséquent, la précision de la localisation du fluorophore est importante pour la reconstruction d’image de Super-résolution. Les spectres d’absorption de Prochlorococcus culminer à 447 nm et 680 nmet Prochloro...

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Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Nous décrivons ici une méthode de photoblanchiment afin de réduire l’autofluorescence des cyanobactéries. Après photoblanchiment, microscopie stochastique reconstruction optique est utilisée pour obtenir des images de Super-résolution en trois dimensions de l’anneau FtsZ cyanobactérie.

Photoblanchiment permet l’imagerie de l’anneau FtsZ dans la cyanobactérie Prochlorococcus Super-résolution

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés sur la localisation des protéines et la dynamique des organismes photosynthétiques. En combinant la méthode de photobleaching avec le microscope à super résolution, nous sommes en mesure de détecter la dynamique protéique des organismes photosynthétiques dans un détail remarquable. Cette méthode permet non seulement de mieux comprendre la dynamique protéique du Prochlorococcus.Il peut également être appliqué à de nombreux autres organismes contenant radio-re-dop-sing et bactériophylle. Yanxin Liu, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera cette procédure. Pour commencer, ajoutez cinq millilitres de pro99 moyen à base d’eau de mer à un flacon de culture et inoculez-le avec un millilitre de Prochlorococcus MED4.Cultivez le Prochlorococcus à 23 degrés Celsius sous une lumière avec une intensité de 35 photons micromole par mètre carré. Après cinq jours, recueillir un millilitre de la culture dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter 100 microlitres de formaldéhyde fraîchement préparé au tube pour fixer la culture.Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, faites tourner l’échantillon à 13 500 fois G pendant une minute. Enlevez le supernatant et réutilisez les cellules en 100 microlitres de pro99 moyen.Conserver l’échantillon à quatre degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à ce qu’il soit prêt à effectuer l’immunostaining. Tout d’abord, vortex le flacon de perles de polystyrène. En utilisant 50% d’éthanol, préparez une dilution de 1 à 20 000 comme boue de travail.Allumez la plaque chauffante et réglez la température à 120 degrés Celsius. Ensuite, placez les coverslips sur la plaque chaude. Chargez 100 microlitres de la boue de travail sur chaque coverslip et incuber les coverslips sur la plaque chauffante pendant 10 minutes.Ensuite, transférez soigneusement les coverslips sur les boîtes de Pétri côté perle vers le haut pour le stockage à température ambiante. Lorsqu’il est prêt à enduire les coverslips, récupérer un, en s’assurant qu’il est côté perle vers le haut. Ajouter 100 microlitres d’un milligramme par millilitre de solution poly-L-lysine au centre du coverslip et laisser reposer à température ambiante pendant 30 minutes.Après cela, utilisez une pipette pour aspirer soigneusement toute poly-L-lysine non attachée et la transférer dans un tube de 1,5 millilitre. Conservez cette poly-L-lysine à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Rincer le coverslip avec 10 millilitres d’eau ultra filtrée dans une boîte petri de 60 millimètres, puis le sécher brièvement avec une serviette en papier.Transférer le coverslip enduit dans une nouvelle boîte de Pétri avec parafilm en bas, qui sera utilisé comme plat de coloration. Chargez 100 microlitres de l’échantillon fixe sur le coverslip et laissez-le reposer pendant 30 minutes pour permettre l’attachement cellulaire. Ensuite, utilisez une serviette en papier pour absorber la solution restante, puis transférez le coverslip dans un puits dans une assiette de 12 puits pour le lavage.Ajouter un millilitre de tampon PBS au puits pour laver le coverslip. Retirez ensuite le PBS et ajoutez un millilitre de PBS frais pour laver le coverslip une deuxième fois. Utilisez une pipette pour enlever le PBS et le remplacer par un millilitre de tampon de perméabilisation fraîchement préparé.Incuber le plat à laver à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Retirez ensuite le tampon de perméabilisation. Commencez le processus de lavage en ajoutant un millilitre de tampon PBS frais.Déposer le plat à laver sur un shaker pour agiter doucement le plat pendant cinq minutes. Après cela, retirez le PBS et répétez le processus de lavage trois fois. Transférer le coverslip lavé dans le plat à taches.Ajouter 50 microlitres de tampon de blocage sur le dessus du coverslip. Placez tout le plat de coloration sur la glace, puis déplacez-le sous la source lumineuse du xénon pour le photobleaching pendant au moins 60 minutes. Après le photobleaching et le blocage, utilisez le bord d’une serviette en papier pour enlever le tampon de blocage.Tout d’abord, diluer un microlitre d’anticorps anti-FtsZ en 99 microlitres de tampon de blocage. Placez 50 microlitres de l’anticorps primaire dilué sur le coverslip et incubez-le à température ambiante pendant 30 minutes. Transférer le coverslip dans un puits du plat à laver.Pour commencer le lavage, ajouter un millilitre de PBS. Transférer ensuite le plat à laver dans un shaker et le secouer doucement pendant cinq minutes. Retirez le PBS et répétez l’ensemble du processus de lavage trois fois.Ensuite, transférez le coverslip dans le plat de coloration. Placez 50 microlitres de l’anticorps secondaire dilué sur le coverslip et incubez-le dans l’obscurité et à température ambiante pendant 30 minutes. Transférer le coverslip dans le plat à laver.Pour commencer le lavage, ajouter un millilitre de PBS. Envelopper le plat de lavage dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière. Transférer la plaque sur le shaker et la secouer doucement pendant cinq minutes.Retirez le PBS et répétez l’ensemble du processus de lavage trois fois. Immédiatement avant l’imagerie STORM, préparez un millilitre de tampon d’imagerie tel qu’il est décrit dans le protocole texte. Chargez le coverslip dans la chambre de chargement.Ajouter le tampon d’imagerie fraîchement préparé, en étant doux pour éviter de laver les cellules cyanobactériennes. Après cela, placez un coverslip rectangulaire sur le tampon d’imagerie pour l’empêcher de réagir avec l’oxygène dans l’air. Allumez la caméra, la lumière LED et le laser, et ouvrez le logiciel STORM.Ajouter une demi-goutte d’huile d’immersion sur le dessus de la lentille. Chargez la chambre, en vous assurant que l’objectif est en contact avec le coverslip. Et examinez le signal avec un laser de 750 nanomètres.Identifier une zone d’échantillon qui contient à la fois des cellules et des marqueurs fiduciaux. Ensuite, démarrez le logiciel pour la correction de dérive de l’échantillon. Acquérir une image largement déposée comme référence, avec le gain de multiplication des électrons de la caméra à 300 et un temps d’exposition de 30 millisecondes.Augmentez l’intensité du laser d’excitation de 750 nanomètres à environ 4,5 kilowatts par centimètre carré. Une fois que les fluorophores ont fait la transition vers un motif de clignotement clairsemé, acquérir une image super-résolution en collectant 10 000 images à 33 hertz. Reconstruisez ensuite les images de super-résolution à partir des données brutes décrites dans le protocole texte.Dans cette étude, STORM est utilisé pour obtenir une imagerie à super résolution en activant stochastically fluorophores photo-commutables individuels. L’emplacement de chaque fluorophore est enregistré, et une image de super-résolution est ensuite construite en fonction de ces emplacements. Alors que les spectres d’absorption de Prochlorococcus culminent à 447 et 680 nanomètres et ont une absorption minimale supérieure à 700 nanomètres, les cellules Prochlorococcus MED4 émettent encore une autofluorescence élevée lorsqu’elles sont exposées à une intensité extrêmement élevée du laser de 750 nanomètres, ce qui est nécessaire pour l’imagerie STORM.Après avoir utilisé la méthode de photobleaching décrite ici pendant 30 minutes, l’autofluorescence des cellules est vue pour diminuer, bien que plusieurs cellules avec l’autofluorescence soient toujours détectées. L’allongement de la photobleaching à 60 minutes entraîne la perte de l’autofluorescence de la majorité des cellules. Ces résultats indiquent que la méthode de photobleaching développée est capable de réduire considérablement l’autofluorescence des organismes photosynthétiques.Après la photobleaching, STORM est utilisé pour visualiser la protéine de division cellulaire, FtsZ, dans les cellules. À l’aide de STORM, une morphologie détaillée de l’anneau FtsZ est révélée. En tournant les images STORM 3D, quatre types différents de morphologies ont été identifiés, des grappes, un anneau incomplet, un anneau complet et des anneaux doubles.Il est important de se rappeler que l’intensité lumineuse et la durée du photobleach peuvent différer pour différents organismes. Après son développement, cette méthode ouvre la voie aux chercheurs qui veulent étudier l’organisation des protéines et la fonction potentielle dans les cellules photosynthétiques en détail.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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