Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

המחברים מודים Daiying Xu על לה סיוע טכני והערות על כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי מענקים הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מספר הפרוייקט 41476147) המועצה מענקים למחקר של הונג קונג אזור מנהלי מיוחד, סין (פרוייקט מספרים 689813 ו- 16103414).

1. לטעום קיבוע והכנה
<ol><li>לחסן 1 מ"ל של axenic MED4 Prochlorococcus 5 מ ל מבוסס על מי ים Pro99 בינוני12. מגדל Prochlorococcus תרבויות ב 23 ° C תחת האור עוצמה של 35 µmol פוטונים/m2ס כעבור חמישה ימים, לאסוף 1 מ"ל של תרבות לתוך צינור 1.5-mL. הערה: חמישה ימים לאחר חיסון Prochlorococcus MED4 יגיע שלב כניסה מא...

<ol>
	<li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier:+Super-resolution+imaging+of+cells.">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Wave+of+Cellular+Imaging.">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).</li><li>Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Komis, G., &#352;amajov&#225;, O., Ove&#269;ka, M., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+in+Plant+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li><li>Schubert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+-+Applications+in+Plant+Cell+Research.">Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Superresolution+Imaging+of+the+FtsZ+Ring+during+Cell+Division+of+the+Cyanobacterium+Prochlorococcus.">Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus.</a> mbio. 8 (6), e00657 (2017).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division:+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E.+coli+cell+fission.">Advances in understanding E. coli cell fission.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).</li><li>Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+different+nitrogen+sources+by+the+marine+cyanobacteria+Prochlorococcus+and+Synechococcus.">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li><li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope.">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).</li><li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuickPALM:+3D+real-time+photoactivation+nanoscopy+image+processing+in+ImageJ.">QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ.</a> Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+photosynthesis+in+the+oceans:+The+origins+and+significance+of+divergent+light-harvesting+strategies.">Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies.</a> Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).</li><li>Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus:+The+structure+and+function+of+collective+diversity.">Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).</li><li>Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus+and+Synechococcus+-+a+Comparative-Study+of+Their+Optical-Properties+in+Relation+To+Their+Size+and+Pigmentation.">Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation.</a> Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).</li><li>Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+3D+super-resolution+microscopy+reveals+Caulobacter+crescentusin+vivo+Z-ring+organization.">High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).</li><li>Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+multiple+biomarkers+in+captured+rare+cells+by+sequential+immunostaining+and+photobleaching.">Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching.</a> Methods. 64 (2), 108-113 (2013).</li><li>Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+photobleaching+necessary+for+Raman+imaging+of+bone+tissue+using+a+green+laser?.">Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).</li><li>Haxo, F. T., Blinks, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+Action+Spectra+of+Marine+Algae.">Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae.</a> The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).</li><li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin:+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria.">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li></ol>

ב פרוטוקול זה, אנו המתואר הליך כדי להפחית באופן משמעותי את autofluorescence של cyanobacterium Prochlorococcus (איור 3C) ו, אז, immunostain החלבונים בתאים, שאיפשר לנו לנצל את סטורם ללמוד את FtsZ תלת-ממדי טבעת מורפולוגיות ב- Prochlorococcus (איור 4). פרוטוקול זה עשוי להיות מאומץ עבור הדמיה ס?...

Microscopies סופר רזולוציה ניתן לשבור את מגבלת עקיפה של אור, לספק תמונות תוך עקיפה משנה החלטות (< 200 ננומטר). הם היה בשימוש נרחב אורגניזמים רבים ללמוד חלבון לוקליזציה ומבנים subcellular. רס ן סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה כוללים תאורה מובנית מיקרוסקופ (SIM), גירוי פליטה דלדול מיקרוסקופ (STED), סופה ו photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופ (דקל). מנגנוני והיישומים של אלה רזולוציה סופר מיקרוסקופים כבר בדקתי במקומות אחרים1,2.
סופה ניתן להשיג רזולוציה גבוהה כמו 10 ננומטר על ידי הפרדה מרחבית3,4. . סטורם, מולקולה אחת בלבד בתוך אזור מוגבל עקיפה מופעל ("על"), השאר של המולקולות נשמרים מוחלש ("off"). על ידי הצטברות של מתג מהיר- לסירוגין - מולקולות יחיד, תמונת "עקיפה-בלתי מוגבל" יכול להיות שנוצר3. בינתיים, סוגים רבים של צבעי אורגניות וחלבונים פלורסנט ישימות בסערה, המאפשרת שדרוג קל של קרינה פלואורסצנטית רגילה מיקרוסקופ מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה5,6.
הסערה לא הוחל נרחב תאים פוטוסינתטיים, כגון כחוליות, אצות, ודורש תאי צמחים עם מהכלורופלסט7,8, אשר בשל העובדה הסערה עוצמת הלייזר גבוהה כדי נסיעה photoswitching. הלייזר בעוצמה גבוהה בעלת מרגש רקע חזק autofluorescence תאים פוטוסינתטיים, מפריע לוקליזציה מולקולה בודדת בתחום ההדמיה סערה. על מנת להשתמש סערה לחקור את המבנים subcellular או אינטראקציות חלבון תאים פוטוסינתטיים, פיתחנו פרוטוקול photobleaching כדי להרוות את אותות autofluorescence רקע9. במסגרת הליך שגרתי immunofluorescent מוכתמים, דגימות נחשפים אור לבן בעוצמה גבוהה במהלך השלב חסימה, אשר מוריד את autofluorescence של תאים פוטוסינתטיים כדי לעמוד בדרישות סערה. לפיכך, פרוטוקול זה הופך ריאלי לחקור אורגניזמים פיגמנט עם הסערה.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שישמש סערה תמונת הארגון טבעת FtsZ picocyanobacterium חד־תאיות Prochlorococcus. FtsZ הוא מאוד שנשמרת טובולין דמוי cytoskeletal חלבון אשר polymerizes כדי ליצור מבנה הטבעת (הטבעת Z) סביב היקף התא10 הוא חיוני עבור ה11של חלוקת התא. נשמר Prochlorococcus תאים הן photobleached הראשון כדי להפחית את הרקע autofluorescent ואת immunostained עם נוגדן anti-FtsZ העיקרי, ואז נוגדנים IgG (H + L) משני הארנב אנטי מצומדת עם fluorophore (למשל , אלקסה עבור חיל הים 750). בסופו של דבר, סערה משמשת להתבוננות הארגונים מפורטת של הטבעת FtsZ ב Prochlorococcus בשלבים שונים של מחזור התא.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

מיקרוסקופ ברזולוציה סופר כבר בשימוש נרחב ללמוד אינטראקציות חלבון ומבנים subcellular אורגניזמים רבים. אורגניזמים פוטוסינתטיים, עם זאת, הרזולוציה לרוחב של הדמיה סופר-ברזולוציה הוא רק 100 ~ ננומטר. הרזולוציה הנמוכה נובעת בעיקר רקע autofluorescence גבוהה של תאים פוטוסינתטיים הנגרמת על ידי לייזר בעוצמה גבוהה הנדרשים עבור הדמיה ברזולוציה סופר, כגון שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה). כאן, אנו מתארים בסיוע photobleaching סערה שיטה אשר פותחה לאחרונה הדמיה של picocyanobacterium ימי Prochlorococcus. לאחר photobleaching, autofluorescence של Prochlorococcus ביעילות פוחת כך הסערה יכול להתבצע עם רזולוציה לרוחב של ~ 10 ננומטר. באמצעות שיטה זו, אנו רוכשים הארגון ויוו תלת-ממדיים (3-D) של החלבון FtsZ, לאפיין את ארבעת מורפולוגיות טבעת FtsZ שונים במהלך מחזור התא של Prochlorococcus. השיטה שנתאר כאן עשוי להיות מאומץ על ההדמיה סופר רזולוציה של אורגניזמים פוטוסינתטיים אחרים.

הסערה משיגה הדמיה ברזולוציה סופר על ידי הפעלת photoswitchable בודדים fluorophores stochastically. המיקום של כל fluorophore נרשם, תמונה סופר-ברזולוציה ואז נבנה בהתבסס על מיקומים אלה4. לכן, מידת הדיוק של המיקום fluorophore חשוב עבור שחזור התמונה ברזולוציה-העל. ספקטרום הבליעה של Prochlorococcus ...

Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

כאן נתאר שיטת photobleaching כדי להפחית את autofluorescence של כחוליות. לאחר photobleaching, שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ משמשת כדי לקבל תמונות סופר-ברזולוציה תלת מימדי של הטבעת FtsZ cyanobacterial.

Photobleaching מאפשר הדמיה ברזולוציה-העל של הטבעת FtsZ Cyanobacterium Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על לוקליזציה של חלבונים ועל הדינמיקה באורגניזמים פוטוסינתטיים. על ידי שילוב שיטת photobleaching עם מיקרוסקופ ברזולוציה סופר, אנו מסוגלים לזהות את דינמיקת החלבון של אורגניזמים פוטוסינתטיים בפירוט מדהים. שיטה זו לא רק מספקת תובנה על דינמיקת החלבון של פרוכלורוקוק.זה יכול להיות מיושם גם על אורגניזמים רבים אחרים המכילים רדיו-re-dop-לשיר ו bacteriochlorophyll. הוכחת הליך זה תהיה Yanxin ליו, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להוסיף חמישה מיליליטר של מי ים מבוססי Pro99 בינוני לבקבוק תרבות לחסן אותו עם מיליליטר אחד של Prochlorococcus MED4.לגדל את Prochlorococcus ב 23 מעלות צלזיוס תחת אור בעוצמה של 35 פוטונים micromole למ"ר. לאחר חמישה ימים, לאסוף מיליליטר אחד של התרבות לתוך צינור 1.5 מיליליטר. הוסף 100 microliters של פורמלדהיד מוכן טרי לצינור כדי לתקן את התרבות.דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. לאחר מכן, לסובב את המדגם ב 13, 500 פעמים G לדקה אחת. הסר את supernatant ו resuspend התאים ב 100 microliters של מדיום Pro99.לאחסן את המדגם בארבע מעלות צלזיוס בחושך עד מוכן לבצע immunostaining. ראשית, מערבולת הבקבוקון של גם גם פדיות פוליסטירן. באמצעות 50% אתנול, להכין אחד עד 20, 000 דילול כמו תרחיף עובד.מפעילים את החום ומגדירים את הטמפרטורה ל-120 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מניחים את הכיסויים על הצלחת החמה. לטעון 100 microliters של תרחיף עובד על כל coverslip ולהדק את הכיסויים על החם במשך 10 דקות.לאחר מכן מעבירים בזהירות את הכיסויים למנות פטרי לצד חרוזים לאחסון בטמפרטורת החדר. כאשר מוכן לצפות את כיסויים, לאחזר אחד, לוודא שזה צד חרוז למעלה. הוסף 100 microliters של מיליגרם אחד לכל פתרון פולי-L-ליסין מיליליטר למרכז הכיסוי ולתת לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי לשאף בזהירות כל פולי-L-לינזין מחובר ולהעביר אותו צינור 1.5 מיליליטר. אחסן פולי-ל-ליסין זה בארבע מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. שוטפים את הכיסויים ב-10 מיליליטר של מים מסוננים במיוחד בצלחת פטרי 60 מ"מ ואז מייבשים אותה בקצרה במגבת נייר.מעבירים את כיסוי מצופה לצלחת פטרי חדשה עם Parafilm בתחתית, אשר ישמש כצלחת הכתמים. לטעון 100 microliters של המדגם קבוע על coverslip ולתת לו לשבת במשך 30 דקות כדי לאפשר קובץ מצורף לתא. לאחר מכן, השתמש במגבת נייר כדי לספוג את הפתרון הנותר ולאחר מכן להעביר את כיסוי ל הבאר בצלחת 12 היטב לכביסה.הוסף מיליליטר אחד של מאגר PBS ל באר לשטוף את הכיסוי. לאחר מכן להסיר את PBS ולהוסיף מיליליטר אחד של PBS טרי לשטוף את coverslip בפעם השנייה. השתמש פיפטה כדי להסיר את PBS ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מאגר permeabilization מוכן טרי.דגירה צלחת הכביסה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן הסר את מאגר החיבור. התחל את תהליך הכביסה על-ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר PBS טרי.מניחים את צלחת הכביסה על שייקר כדי להתסיס בעדינות את המנה במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את PBS ולחזור על תהליך הכביסה שלוש פעמים. מעבירים את הכיסויים השטופים לצלחת ההכתמות.הוסף 50 מיקרוליטרים של מאגר חסימה בחלק העליון של הכיסוי. מניחים את כל צלחת הכתמים על קרח ולאחר מכן להזיז אותו תחת מקור אור קסנון עבור photobleaching לפחות 60 דקות. לאחר פוטובלאצ'ים וחסימה, השתמש בקצה מגבת נייר כדי להסיר את מאגר החסימה.ראשית, לדלל מיקרוליטר אחד של נוגדן נגד FtsZ לתוך 99 microliters של חיץ חסימה. מניחים 50 microliters של הנוגדן העיקרי מדולל על כיסוי הדגירה אותו בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מעבירים את הכיסויים לגם של צלחת הכביסה.כדי להתחיל את הכביסה, להוסיף מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן מעבירים את צלחת הכביסה לשייקר ומנערים אותה בעדינות במשך חמש דקות. הסר את PBS וחזור על כל תהליך הכביסה שלוש פעמים.לאחר מכן, מעבירים את הכיסויים לצלחת ההכתמות. מניחים 50 מיקרוליטרים של הנוגדן המשני המדולל על המכסה ומדגרים אותו בחושך וטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מעבירים את הכיסויים בחזרה לצלחת הכביסה.כדי להתחיל את הכביסה, להוסיף מיליליטר אחד של PBS. עוטפים את צלחת הכביסה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור. מעבירים את הצלחת לשייקר ומנערים אותה בעדינות במשך חמש דקות.הסר את PBS וחזור על כל תהליך הכביסה שלוש פעמים. מיד לפני הדמיית STORM, הכן מיליליטר אחד של מאגר הדמיה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. טען את הכיסויים לתא הטעינה.מוסיפים את חיץ ההדמיה הטרי, להיות עדין כדי למנוע שטיפת תאים ציאנובקטריאליים. לאחר מכן, מניחים כיסוי מלבני על גבי מאגר ההדמיה כדי למנוע ממנו להגיב עם החמצן באוויר. הפעל את המצלמה, את אור ה-LED ואת הלייזר, ולפתוח את תוכנת STORM.מוסיפים חצי טיפת שמן טבילה על גבי העדשה. לטעון את התא, לוודא כי העדשה האובייקטיבית היא יצירת קשר עם כיסוי. ולבדוק את האות עם לייזר 750 ננומטר.זהה אזור דגימה המכיל הן תאים והן סמנים נאמנות. לאחר מכן הפעל את התוכנה לתיקון נסחף לדוגמה. לרכוש תמונה אחת רחבה מתויק כהפניה, עם רווח כפל אלקטרון המצלמה ב 300 ותזמן חשיפה של 30 אלפיות השניה.הגדל את עוצמת הלייזר של 750 ננומטר ל-4.5 קילוואט לס"מ מרובע בקירוב. לאחר הפלואורופורים עברו לדפוס מהבהב דליל, לרכוש תמונה אחת ברזולוציה סופר על ידי איסוף 10, 000 מסגרות ב 33 הרץ. לאחר מכן בנה מחדש את התמונות ברזולוציית העל מהנתונים הגולמיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.במחקר זה, STORM משמש להשגת הדמיה ברזולוציה סופר על ידי הפעלת פלואורופורים בודדים הניתנים להחלפת תמונות באופן סטוצ'סט. המיקום של כל פלואורופור נרשם, ותמונה ברזולוציית-על נבנית לאחר מכן בהתבסס על מיקומים אלה. בעוד ספקטרום הספיגה של Prochlorococcus פסגות ב 447 ו 680 ננומטר ויש לו ספיגה מינימלית מעל 700 ננומטר, Prochlorococcus MED4 תאים עדיין פולטים שפעת אוטומטית גבוהה כאשר נחשפים לעוצמה גבוהה מאוד של לייזר 750 ננומטר, אשר נדרש עבור הדמיה STORM.לאחר שימוש בשיטת photobleaching המתוארת כאן במשך 30 דקות, נראה כי שפעת התאים יורדת, אם כי מספר תאים עם שפעת אוטומטית עדיין מזוהים. הארכת הצילום ל-60 דקות גורמת לרוב התאים לאבד את שפעת הרכב שלהם. תוצאות אלה מצביעות על כך ששיטת הפוטובלצ'ינג המפותחת מסוגלת להפחית במידה ניכרת את שפעת הרכב של אורגניזמים פוטוסינתטיים.לאחר photobleaching, STORM משמש כדי לדמיין את החלבון חלוקת התא, FtsZ, בתאים. באמצעות STORM, מורפולוגיה מפורטת של טבעת FtsZ מתגלה. על ידי סיבוב תמונות 3D STORM, זוהו ארבעה סוגים שונים של מורפולוגיות, אשכולות, טבעת לא שלמה, טבעת שלמה וטבעות כפולות.חשוב לזכור כי עוצמת האור ומשך הזמן של photobleach עשוי להיות שונה עבור אורגניזמים שונים. לאחר התפתחותו, שיטה זו סוללת את הדרך לחוקרים שרוצים לחקור את ארגון החלבון ואת הפונקציה הפוטנציאלית בתאים פוטוסינתטיים בפירוט.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

בתחום ההדמיה vivo של טפילים טראנסגנטי שושנת יריחו שורה חיים

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

נדידת תאים דנדריטים ניטור באמצעות<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H דימות תהודה מגנטית

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים T באמצעות madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...