Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
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लेखक उसे तकनीकी सहायता और पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए Daiying Xu धंयवाद । यह अध्ययन राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (परियोजना संख्या ४१४७६१४७) और हांगकांग विशेष प्रशासनिक क्षेत्र, चीन (परियोजना संख्या ६८९८१३ और १६१०३४१४) के अनुसंधान अनुदान परिषद से अनुदान द्वारा समर्थित है ।

1. नमूना तैयारी और निर्धारण
<ol><li>Inoculate axenic Prochlorococcus MED4 के 1 मिलीलीटर के समुद्री जल के 5 मिलीलीटर आधारित Pro99 मध्यम12। ३५ µmol फोटॉनों की तीव्रता के साथ प्रकाश के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर Prochlorococcus संस्कृतिय?...

<ol>
	<li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier:+Super-resolution+imaging+of+cells.">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Wave+of+Cellular+Imaging.">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li><li>Rust, M. 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W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division:+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E.+coli+cell+fission.">Advances in understanding E. coli cell fission.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).</li><li>Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+different+nitrogen+sources+by+the+marine+cyanobacteria+Prochlorococcus+and+Synechococcus.">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li><li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope.">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).</li><li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. 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H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus+and+Synechococcus+-+a+Comparative-Study+of+Their+Optical-Properties+in+Relation+To+Their+Size+and+Pigmentation.">Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation.</a> Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).</li><li>Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+3D+super-resolution+microscopy+reveals+Caulobacter+crescentusin+vivo+Z-ring+organization.">High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).</li><li>Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+multiple+biomarkers+in+captured+rare+cells+by+sequential+immunostaining+and+photobleaching.">Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching.</a> Methods. 64 (2), 108-113 (2013).</li><li>Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+photobleaching+necessary+for+Raman+imaging+of+bone+tissue+using+a+green+laser?.">Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).</li><li>Haxo, F. T., Blinks, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+Action+Spectra+of+Marine+Algae.">Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae.</a> The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).</li><li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin:+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria.">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल में, हम काफी cyanobacterium Prochlorococcus (चित्रा3 सी) के autofluorescence को कम करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन और, फिर, immunostain कोशिकाओं में प्रोटीन, जो हमें 3 डी FtsZ अध्ययन करने के लिए तूफान का उपयोग करने के ल?...

सुपर संकल्प माइक्रोस्कोप्स प्रकाश की विवर्तन सीमा को तोड़ने और उप-विवर्तन प्रस्तावों (< २०० एनएम) के भीतर छवियों को प्रदान कर सकते हैं । वे कई जीवों में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है प्रोटीन स्थानीयकरण और सेलुलर संरचनाओं का अध्ययन । प्रमुख सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी विधियों संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम), प्रेरित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी (STED), तूफान, और photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) शामिल हैं । तंत्र और इन सुपर संकल्प सूक्ष्मदर्शी के आवेदनों की समीक्षा की गई है कहीं और1,2।
तूफान के रूप में उच्च के रूप में एक संकल्प प्राप्त कर सकते है 10 स्थानिक जुदाई3,4द्वारा एनएम । तूफान के लिए, एक विवर्तन-सीमित क्षेत्र के भीतर केवल एक अणु ("पर") सक्रिय है और अणुओं के बाकी निष्क्रिय रखा जाता है ("बंद") । तेजी से स्विच का एक संचय करके-पर और एक अणुओं के बंद, एक "विवर्तन-असीमित" छवि उत्पंन किया जा सकता है3। इस बीच, कार्बनिक रंजक और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के कई प्रकार के तूफान में लागू होते हैं, नियमित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी5,6के लिए एक आसान उन्नयन की अनुमति ।
तूफान व्यापक रूप से संश्लेषक कोशिकाओं में लागू नहीं किया गया है, जैसे cyanobacteria, शैवाल, और chloroplasts के साथ संयंत्र कोशिकाओं7,8, जो इस तथ्य के कारण है कि तूफान photoswitching ड्राइव करने के लिए उच्च लेजर तीव्रता की आवश्यकता है । उच्च तीव्रता लेजर प्रतिकूल संश्लेषक कोशिकाओं में मजबूत autofluorescence पृष्ठभूमि उत्तेजित और स्टॉर्म इमेजिंग में एकल अणु स्थानीयकरण के साथ हस्तक्षेप । आदेश में उपसेलुलर संरचनाओं या संश्लेषक कोशिकाओं में प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए तूफान का उपयोग करने के लिए, हम पृष्ठभूमि autofluorescence9संकेतों को बुझाने के लिए एक photobleaching प्रोटोकॉल विकसित किया । एक नियमित immunofluorescent धुंधला प्रक्रिया में, नमूनों अवरुद्ध कदम है, जो संश्लेषक कोशिकाओं तूफान के लिए आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए autofluorescence को कम करती है के दौरान एक उच्च तीव्रता के सफेद प्रकाश को उजागर कर रहे हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल यह संभव तूफान के साथ pigmented जीवों की जांच करने के लिए बनाता है ।
यहां, हम कोशिकीय picocyanobacterium Prochlorococcusमें FtsZ अंगूठी संगठन छवि के लिए तूफान का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । FtsZ एक उच्च संरक्षित tubulin-तरह cytoskeletal प्रोटीन है जो एक अंगूठी संरचना (एक सेल10 की परिधि के चारों ओर Z अंगूठी) के रूप में polymerizes है और सेल के लिए आवश्यक है विभाजन11। संरक्षित Prochlorococcus कोशिकाओं पहले photobleached एक प्राथमिक विरोधी FtsZ एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि और immunostained को कम करने के लिए कर रहे हैं, और फिर एक माध्यमिक विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) एंटीबॉडी एक संयुग्मित के साथ fluorophore है (उदा. , Alexa Fluor ७५०) । अंततः, तूफान अलग सेल चक्र चरणों के दौरान Prochlorococcus में विस्तृत FtsZ अंगूठी संगठनों का पालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से कई जीवों में प्रोटीन बातचीत और सेलुलर संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । संश्लेषक जीवों में, हालांकि, सुपर संकल्प इमेजिंग के पार्श्व संकल्प केवल ~ १०० एनएम है । कम संकल्प मुख्य रूप से उच्च तीव्रता पराबैंगनीकिरण है कि सुपर संकल्प इमेजिंग, जैसे stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के लिए आवश्यक है की वजह से संश्लेषक कोशिकाओं की उच्च autofluorescence पृष्ठभूमि के कारण है । यहां, हम एक photobleaching-सहायता स्टॉर्म विधि जो हाल ही में इमेजिंग समुद्री picocyanobacterium Prochlorococcusके लिए विकसित किया गया था का वर्णन । photobleaching के बाद, Prochlorococcus के autofluorescence प्रभावी ढंग से कम है ताकि तूफान ~ 10 एनएम के एक पार्श्व संकल्प के साथ किया जा सकता है । इस विधि का प्रयोग, हम vivo में तीन आयामी (3-डी) FtsZ प्रोटीन के संगठन का अधिग्रहण और Prochlorococcusके सेल चक्र के दौरान चार अलग FtsZ अंगूठी morphologies की विशेषता है । विधि हम यहां का वर्णन अंय संश्लेषक जीवों के सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए अपनाया जा सकता है ।

तूफान व्यक्तिगत photoswitchable fluorophores stochastically सक्रिय द्वारा सुपर संकल्प इमेजिंग प्राप्त करते हैं । हर fluorophore का स्थान दर्ज है और एक सुपर संकल्प छवि तो इन स्थानों के आधार पर निर्माण किया है4. इसलिए...

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Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

यहाँ हम cyanobacteria के autofluorescence को कम करने के लिए एक photobleaching विधि का वर्णन करते हैं । photobleaching के बाद, stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी cyanobacterial FtsZ अंगूठी के तीन आयामी सुपर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Photobleaching Cyanobacterium Prochlorococcus में FtsZ रिंग के सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम करता है

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

यह विधि प्रोटीन स्थानीयकरण और फोटोसिंथेटिक जीवों में गतिशीलता पर महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप के साथ फोटोब्लैचिंग विधि के संयोजन से, हम एक उल्लेखनीय विस्तार में फोटोसिंथेटिक जीवों की प्रोटीन गतिशीलता का पता लगाने में सक्षम हैं। यह विधि न केवल प्रोक्लोरोकोकस की प्रोटीन गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।इसे रेडियो-री-डोपिंग-सिंग और बैक्टीरियोलोरोफिल युक्त कई अन्य जीवों पर भी लागू किया जा सकता है। इस प्रक्रिया का प्रदर्शन Yanxin लियू, मेरी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा । शुरू करने के लिए, समुद्री जल आधारित Pro99 माध्यम के पांच मिलीलीटर को एक संस्कृति फ्लास्क में जोड़ें और इसे प्रोक्लोरोकोकस MED4 के एक मिलीलीटर के साथ टीका लगाएं।प्रति वर्ग मीटर 35 माइक्रोमोल फोटॉन की तीव्रता के साथ एक प्रकाश के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर प्रोक्लोकोकस बढ़ाएं। पांच दिनों के बाद, संस्कृति के एक मिलीलीटर को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा करें। संस्कृति को ठीक करने के लिए ट्यूब में ताजा तैयार फॉर्मलडिहाइड के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट। फिर, एक मिनट के लिए 13, 500 बार जी पर नमूना नीचे स्पिन। सुपरनिटेंट निकालें और Pro99 मीडियम के 100 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से रीसस्ट करें।इम्यूनोदाता करने के लिए तैयार होने तक अंधेरे में चार डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर करें। सबसे पहले, पॉलीस्टीरिन मोतियों की शीशी को भंवर से करें। 50% इथेनॉल का उपयोग करके, एक-से-20, 000 कमजोर पड़ने को एक कामकाजी घोल के रूप में तैयार करें।हॉटप्लेट चालू करें और तापमान को 120 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। इसके बाद, कवरस्लिप को गर्म प्लेट पर रखें। प्रत्येक कवरस्लिप पर काम करने वाले घोल के 100 माइक्रोलीटर लोड करें और हॉटप्लेट पर कवरस्लिप को 10 मिनट तक इनक्यूबेट करें।फिर ध्यान से कमरे के तापमान पर भंडारण के लिए पेट्री व्यंजन मनका-साइड अप करने के लिए कवरस्लिप स्थानांतरित करें। जब कवरस्लिप कोट करने के लिए तैयार है, तो एक को पुनः प्राप्त करें, यह सुनिश्चित करें कि यह मनका-साइड अप है। कवरस्लिप के केंद्र में एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पॉली-एल-लिसिन समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें।इसके बाद, किसी भी असंबद्ध पॉली-एल-लिसिन को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें और इसे 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। बाद में उपयोग के लिए इस पॉली-एल-लिसिन को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एक ६० मिलीमीटर पेट्री डिश में अल्ट्रा फ़िल्टर पानी के 10 मिलीलीटर के साथ कवरस्लिप कुल्ला और फिर संक्षेप में यह एक कागज तौलिया के साथ सूखी ।कोटेड कवरस्लिप को नीचे पैराफिल्म के साथ एक नई पेट्री डिश में ट्रांसफर करें, जिसका इस्तेमाल स्टेनिंग डिश के रूप में किया जाएगा । कवरस्लिप पर तय नमूने के 100 माइक्रोलीटर लोड करें और सेल अटैचमेंट की अनुमति देने के लिए इसे 30 मिनट तक बैठने दें। इसके बाद, शेष समाधान को अवशोषित करने के लिए एक कागज तौलिया का उपयोग करें और फिर धोने के लिए 12-अच्छी प्लेट में एक अच्छी तरह से कवरस्लिप को स्थानांतरित करें।कवरस्लिप को धोने के लिए पीबीएस बफर का एक मिलीलीटर अच्छी तरह से जोड़ें। फिर पीबीएस को हटा दें और दूसरी बार कवरस्लिप को धोने के लिए ताजा पीबीएस का एक मिलीलीटर जोड़ें। पीबीएस को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें और इसे हौसले से तैयार पारमेबिलाइजेशन बफर के एक मिलीलीटर के साथ बदलें।20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर वाशिंग डिश इनक्यूबेट। इसके बाद परमीलता बफर को हटा दें। ताजा पीबीएस बफर के एक मिलीलीटर जोड़कर धोने की प्रक्रिया शुरू करें।धोने के पकवान को एक शेकर पर रखें ताकि डिश को धीरे से पांच मिनट के लिए उत्तेजित किया जा सके । इसके बाद पीबीएस को हटा दें और वॉशिंग प्रोसेस को तीन बार दोहराएं। धोया कवरस्लिप को धुंधला पकवान में स्थानांतरित करें।कवरस्लिप के शीर्ष पर बफर को अवरुद्ध करने के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। बर्फ पर पूरे धुंधला पकवान रखें और फिर इसे कम से कम 60 मिनट के लिए फोटोब्लैचिंग के लिए ज़ेनन लाइट सोर्स के नीचे ले जाएं। फोटोब्लैचिंग और ब्लॉकिंग के बाद, अवरुद्ध बफर को हटाने के लिए एक पेपर तौलिया के किनारे का उपयोग करें।सबसे पहले, बफर को अवरुद्ध करने के 99 माइक्रोलीटर में एंटी-एफजेड एंटीबॉडी के एक माइक्रोलीटर को पतला करें। पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 50 माइक्रोलीटर को कवरस्लिप पर रखें और इसे 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। कवर्लिप को वॉशिंग डिश के कुएं में ट्रांसफर करें।धोने शुरू करने के लिए, पीबीएस का एक मिलीलीटर जोड़ें। इसके बाद वॉशिंग डिश को शेकर में ट्रांसफर करें और धीरे-धीरे इसे पांच मिनट तक हिलाएं। पीबीएस निकालें और पूरी धुलाई प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं।इसके बाद, कवरस्लिप को धुंधला पकवान में स्थानांतरित करें। कमजोर माध्यमिक एंटीबॉडी के 50 माइक्रोलीटर को कवरस्लिप पर रखें और इसे अंधेरे में और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कवरस्लिप को धोने के पकवान में वापस स्थानांतरित करें।धोने शुरू करने के लिए, पीबीएस का एक मिलीलीटर जोड़ें। इसे प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में वाशिंग डिश लपेटें। प्लेट को शेकर में ट्रांसफर करें और धीरे-धीरे इसे पांच मिनट तक हिलाएं।पीबीएस निकालें और पूरी धुलाई प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं। तूफान इमेजिंग से तुरंत पहले, टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित इमेजिंग बफर का एक मिलीलीटर तैयार करें। कवर्लिप को लोडिंग चैंबर में लोड करें।ताजा तैयार इमेजिंग बफर जोड़ें, साइनोबैक्टीरियल कोशिकाओं को धोने से बचने के लिए कोमल जा रहा है। इसके बाद, हवा में ऑक्सीजन के साथ प्रतिक्रिया करने से रोकने के लिए इमेजिंग बफर के शीर्ष पर एक आयताकार कवरलिप रखें। कैमरा, एलईडी लाइट और लेजर चालू करें, और तूफान सॉफ्टवेयर खोलें।लेंस के ऊपर विसर्जन तेल की आधी बूंद डालें। कक्ष लोड, सुनिश्चित करें कि उद्देश्य लेंस कवरस्लिप के साथ संपर्क कर रही है। और एक 750-नैनोमीटर लेजर के साथ संकेत की जांच करें।एक नमूना क्षेत्र की पहचान करें जिसमें कोशिकाओं और प्रत्ययी मार्कर दोनों शामिल हैं। फिर नमूना बहती सुधार के लिए सॉफ्टवेयर शुरू करें। एक संदर्भ के रूप में एक व्यापक दायर छवियों का अधिग्रहण, ३०० पर कैमरा इलेक्ट्रॉन गुणा लाभ और 30 मिलीसेकंड के एक जोखिम समय के साथ ।750-नैनोमीटर उत्तेजन लेजर तीव्रता को लगभग 4.5 किलोवाट प्रति वर्ग सेंटीमीटर तक बढ़ाएं। एक बार फ्लोरोफोरस एक विरल निमिष पैटर्न में संक्रमण हो गया है, ३३ हर्ट्ज पर 10, 000 फ्रेम इकट्ठा करके एक सुपर संकल्प छवि प्राप्त । फिर पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित कच्चे डेटा से सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों का पुनर्निर्माण करें।इस अध्ययन में, तूफान का उपयोग व्यक्तिगत फोटो-स्विचेबल फ्लोरोफोरस को उदासीन रूप से सक्रिय करके सुपर-रेजोल्यूशन इमेजिंग प्राप्त करने के लिए किया जाता है। हर फ्लोरोफोर का स्थान दर्ज किया जाता है, और इन स्थानों के आधार पर एक सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि का निर्माण किया जाता है। जबकि प्रोक्लोकोकस चोटियों का अवशोषण स्पेक्ट्रा 447 और 680 नैनोमीटर पर है और 700 नैनोमीटर से ऊपर न्यूनतम अवशोषण है, प्रोक्लोरोकोकस मेड4 कोशिकाएं अभी भी 750-नैनोमीटर लेजर की अत्यंत उच्च तीव्रता के संपर्क में आने पर उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस उत्सर्जित करती हैं, जो तूफान इमेजिंग के लिए आवश्यक है।30 मिनट के लिए यहां वर्णित फोटोब्लैचिंग विधि का उपयोग करने के बाद, कोशिकाओं की ऑटोफ्लोरेसेंस कम होती है, हालांकि ऑटोफ्लोरेसेंस वाली कई कोशिकाओं का अभी भी पता लगाया जाता है। फोटोब्लैचिंग को 60 मिनट तक बढ़ाने के परिणामस्वरूप अधिकांश कोशिकाएं अपने ऑटोफ्लोरेसेंस को खो देती हैं। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि विकसित फोटोब्लैचिंग विधि प्रकाश संश्लेषण जीवों के ऑटोफ्लोरेसेंस को बहुत कम करने में सक्षम है।फोटोब्लीचिंग के बाद, स्टॉर्म का उपयोग कोशिकाओं में सेल डिवीजन प्रोटीन, एफटीएसजेड की कल्पना करने के लिए किया जाता है। तूफान का उपयोग करना, FTSZ अंगूठी की एक विस्तृत आकृति विज्ञान से पता चला है । 3 डी स्टॉर्म छवियों को घुमाकर, चार विभिन्न प्रकार के मोर्फोलोजी की पहचान की गई, क्लस्टर, एक अधूरी अंगूठी, एक पूरी अंगूठी, और डबल रिंग।यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि फोटोब्लाच की हल्की तीव्रता और अवधि विभिन्न जीवों के लिए भिन्न हो सकती है। इसके विकास के बाद, यह विधि शोधकर्ताओं के लिए मार्ग प्रशस्त करती है जो प्रोटीन संगठन और प्रकाश संश्लेषण कोशिकाओं में संभावित कार्य का विस्तार से अध्ययन करना चाहते हैं।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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ट्रांसजेनिक लीशमैनिया परजीवियों की एक लाइव होस्ट में vivo इमेजिंग में

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

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Bioluminescent इमेजिंग बीच योगवाहिता जांच स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया इन्फ्लुएंजा और शिशु चूहे में एक वायरस

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

टी सेल की वास्तविक समय लाइव इमेजिंग परिसर गठन संकेतन

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

का उपयोग करते हुए निगरानी वृक्ष के समान सेल प्रवासन<sup&gt; 19</sup&gt; एफ /<sup&gt; 1</sup&gt; एच चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

एक गिलास समर्थित प्लानर लिपिड bilayer पर प्राकृतिक हत्यारा सेल रोग प्रतिरक्षण अन्तर्ग्रथन की सुपर संकल्प इमेजिंग

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

सूजन डर्मिस में इमेजिंग सीडी 4 टी सेल बीचवाला प्रवासन

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

इमेजिंग प्रवाह Cytometry का उपयोग कर मानव प्रणाली में प्रतिरक्षा Synapse के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

बेहद मल्टीप्लेक्जड, सुपरस्टोयलिंग इमेजिंग टी सेल

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में क्षमता को फिर से सील प्लाज्मा झिल्ली का उच्च प्रवाह माप

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

चूहों में मेजबान-रोगज़नक़ प्रतिक्रियाओं और वैक्सीन प्रभावकारिता का मूल्यांकन

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...