Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
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著者は、彼女のテクニカル サポートと原稿のコメントありがとう Daiying 徐。本研究は、中国の国家自然科学基金 (プロジェクト番号 41476147) からの助成金、研究助成金の評議会は、香港特別行政区、中国 (プロジェクト番号 689813 および 16103414) でサポートされます。

1. 試料の調製及び固定
<ol><li>海水ベース Pro99 中12の 5 mL を無菌プロクロロコッカスMED4 1 mL を接種します。5 日後 35 µmol 光子/m2s の強度と光の下で 23 ° cプロクロロコッカス文化を育てる、1.5 mL チューブに文化の 1 mL を集めます。 注: 接種後 5 日間プロクロロコッカスMED4 がフェーズに到達、後半ログ約 108セル/ml、嵐イメージングのた?...

<ol>
	<li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier:+Super-resolution+imaging+of+cells.">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Wave+of+Cellular+Imaging.">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).</li><li>Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Komis, G., &#352;amajov&#225;, O., Ove&#269;ka, M., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+in+Plant+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li><li>Schubert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+-+Applications+in+Plant+Cell+Research.">Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Superresolution+Imaging+of+the+FtsZ+Ring+during+Cell+Division+of+the+Cyanobacterium+Prochlorococcus.">Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus.</a> mbio. 8 (6), e00657 (2017).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division:+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E.+coli+cell+fission.">Advances in understanding E. coli cell fission.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).</li><li>Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+different+nitrogen+sources+by+the+marine+cyanobacteria+Prochlorococcus+and+Synechococcus.">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li><li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope.">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).</li><li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuickPALM:+3D+real-time+photoactivation+nanoscopy+image+processing+in+ImageJ.">QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ.</a> Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+photosynthesis+in+the+oceans:+The+origins+and+significance+of+divergent+light-harvesting+strategies.">Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies.</a> Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).</li><li>Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus:+The+structure+and+function+of+collective+diversity.">Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).</li><li>Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus+and+Synechococcus+-+a+Comparative-Study+of+Their+Optical-Properties+in+Relation+To+Their+Size+and+Pigmentation.">Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation.</a> Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).</li><li>Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+3D+super-resolution+microscopy+reveals+Caulobacter+crescentusin+vivo+Z-ring+organization.">High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).</li><li>Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+multiple+biomarkers+in+captured+rare+cells+by+sequential+immunostaining+and+photobleaching.">Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching.</a> Methods. 64 (2), 108-113 (2013).</li><li>Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+photobleaching+necessary+for+Raman+imaging+of+bone+tissue+using+a+green+laser?.">Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).</li><li>Haxo, F. T., Blinks, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+Action+Spectra+of+Marine+Algae.">Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae.</a> The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).</li><li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin:+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria.">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li></ol>

このプロトコルでは、ラン藻プロクロロコッカス(図 3) の蛍光を大幅に削減するための手順について説明しましたし、その後、immunostain 3-D FtsZ を勉強する嵐を利用することを可能にした細胞のタンパク質リング形態プロクロロコッカス(図 4)。このプロトコルは、他の光合成の有機体で超解像イメージングに採用される可能性がありま?...

超解像顕微鏡は光の回折限界を打破し、サブ回折解像度 (< 200 nm) 内のイメージを提供できます。彼らは蛋白質のローカリゼーションおよび細胞レベル下の構造について研究する多くの生物において広く使用でされています。超解像顕微鏡検査方法は、構造化照明顕微鏡を用いて (SIM) の主要なセンサー ローカリゼーション顕微鏡 (ヤシ)、嵐、枯渇顕微鏡 (STED) を刺激します。メカニズムと顕微鏡がされているこれらの超解像度のアプリケーションの見直し他1,2。
嵐が 10 と高解像度を達成できる空間的な分離3,4nm。嵐、回折限界領域内で 1 つだけの分子は (「上」) 活性化と分子の残りの部分が ("off") 不活化されます。迅速なスイッチのと - 単一分子の蓄積、「回折無制限」画像生成された3できます。一方、有機染料、蛍光タンパク質の多くの種類は、嵐、通常蛍光顕微鏡から高分解能顕微鏡5,6への簡単なアップグレードを可能に適用されます。
嵐が藻類、シアノ バクテリアなどの光合成細胞に広く適用されていない植物細胞葉緑体7、8、その嵐であるという事実のためには、ドライブのスイッチングに高レーザー強度を必要とします。高強度レーザーは不利な光合成細胞の蛍光が強い背景を励起し、嵐イメージングにおける単一分子局在を妨げます。細胞レベル下の構造または光合成細胞の蛋白質の相互作用を調査する嵐を使用するためには、バック グラウンド蛍光信号9を癒やすため退色プロトコルを開発しました。ルーチン蛍光染色の手順で標本は嵐のための要件を満たすために光合成細胞の蛍光を下げる妨害のステップ中に高輝度の白色光にさらされます。したがって、このプロトコルの場合、嵐と色素の有機体を調査することは不可能になります。
ここでは、単細胞 picocyanobacteriumプロクロロコッカスで FtsZ リング組織を画像に嵐を使用するプロトコルについて述べる。FtsZ は非常に節約されたチューブリンのような細胞骨格タンパク質10セルの外周リング構造 (Z のリング) を形成する重合、細胞分裂11のために不可欠です。プロクロロコッカスは保持細胞が蛍光背景と主アンチ FtsZ 抗体 immunostained を削減する最初の photobleached と、fluorophore と二次抗うさぎ IgG (H + L) 抗体の共役し (など、Alexa Fluor 750)。最終的には、嵐を使用して、異なる細胞周期段階プロクロロコッカス詳細の FtsZ リング組織を観察します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

超解像顕微鏡法は、蛋白質の相互作用および多くの生物で細胞内構造について研究に広く使用されています。光合成生物でただし、超解像イメージングの空間分解能はのみ ~ 100 nm。低解像度は、主に確率論的光再建顕微鏡 (嵐) などの超解像イメージングに必要な高強度レーザーによる光合成細胞の高い蛍光バック グラウンドによるものです。ここでは、述べるフォトブリーチングによる嵐開発された海洋 picocyanobacteriumプロクロロコッカスをイメージングの最近。その嵐は ~ 10 の水平解像度で実行できるので退色後、プロクロロコッカスの蛍光は減ります nm。このメソッドを使用して、我々 は FtsZ タンパク質の生体内三次元 (3 D) 組織を取得し、プロクロロコッカスの細胞周期の間に 4 つの異なる FtsZ リング形態の特徴します。我々 はここで説明するメソッドは、他の光合成生物の超解像イメージングに採用される可能性があります。

嵐は、確率的個々 スイッチング蛍光物質を活性化して超解像イメージングを実現します。すべての蛍光体の位置が記録され、これらの場所4に基づく超解像画像を構築します。したがって、fluorophore 位置の精度は超解像画像再構成のために重要です。プロクロロコッカス吸収スペクトル ピーク 447 nm および 680 nm、およびプロクロロコッカス...

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Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

ここで藍藻類の蛍光を抑えるフォトブリーチング法について述べる。退色後は、確率光再建顕微鏡 FtsZ リングがシアノ バクテリアの三次元超解像度画像を得るためです。

退色により、シアノ バクテリアプロクロロコッカスFtsZ リングの超解像イメージング

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

この方法は、タンパク質の局在化と光合成生物のダイナミクスに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。超解像顕微鏡とフォトブラチ法を組み合わせることで、光合成生物のタンパク質ダイナミクスを極力詳細に検出することができます。この方法は、プロクロロコッカスのタンパク質ダイナミクスに関する洞察を提供するだけでなく、また、ラジオ再ドップ歌とバクテロクロロフィルを含む他の多くの生物にも適用することができます。この手順を実証することは、私の研究室の大学院生であるYanxin Liuです。まず、5ミリリットルの海水ベースのPro99培地を培養フラスコに加え、プロクロロコッカスMED4の1ミリリットルで接種します。1平方メートルあたり35マイクロモル光子の強度を持つ光の下で摂氏23度でプロクロロコッカスを成長させます。5日後、培養液を1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットル回収する。培養液を固定するために、作りたてのホルムアルデヒドを100マイクロリットル加えます。室温で暗闇の中で20分間インキュベートします。その後、13、500回Gで1分間サンプルをスピンダウンする。上清を取り除き、Pro99培地の100マイクロリットルで細胞を再懸濁します。サンプルは、免疫染色を行う準備ができるまで暗闇の中で摂氏4度で保存します。まず、ポリスチレンビーズのバイアルを渦に入れる。50%エタノールを使用し、働くスラリーとして1対20,000希釈を調製する。ホットプレートをオンにし、温度を摂氏120度に設定します。次に、ホットプレートにカバースリップを置きます。作業スラリー100マイクロリットルを各カバースリップに積み込み、ホットプレートのカバーリップを10分間インキュベートします。その後、慎重に室温で保存するためにペトリ皿ビーズサイドにカバースリップを転送します。カバースリップをコーティングする準備ができたら、1つを取り出し、ビーズサイドアップであることを確認します。カバースリップの中央に1ミリグラム1ミリグラムの1ミリグラムの1ミリリットルをカバースリップの中心に加え、30分間室温に座らせます。この後、ピペットを使用して、取り付けられていないポリL-リジンを慎重に吸引し、1.5ミリリットルのチューブに移します。後で使用するために摂氏4度でこのポリL-リジンを保存します。60ミリメートルのペトリ皿に10ミリリットルの超ろ過水でカバースリップを洗い流し、ペーパータオルで簡単に乾かします。コーティングされたカバースリップを下部にパラフィルムを持つ新しいペトリ皿に移し、染色皿として使用します。固定サンプル100マイクロリットルをカバースリップに積み込み、30分間座らせてセルを取り付けます。次に、ペーパータオルを使用して残りの溶液を吸収し、カバースリップを12ウェルプレートのウェルに移して洗浄します。PBSバッファーを1ミリリットルのウェルに加えてカバースリップを洗います。その後、PBSを取り出し、新鮮なPBSを1ミリリットル加え、カバースリップを2回洗います。ピペットを使用してPBSを取り除き、作りたてのパーメアビライゼーションバッファーの1ミリリットルに置き換えます。37°Cで20分間、洗浄皿をインキュベートします。次に、パーメアビライズバッファーを除去します。新鮮なPBSバッファーを1ミリリットル加えて洗浄プロセスを開始します。シェーカーの上に洗い物皿を置き、皿を5分間軽く混ぜます。この後、PBSを取り除き、洗浄工程を3回繰り返します。洗ったカバースリップを染色皿に移します。カバースリップの上部に50マイクロリットルのブロッキングバッファを追加します。氷の上に全体の染色皿を置き、少なくとも60分間光漂白のためにキセノン光源の下に移動します。フォトブリーチとブロッキングの後、ペーパータオルの端を使用してブロッキングバッファを取り外します。まず、抗FtsZ抗体の1マイクロリットルを99マイクロリットルのブロッキングバッファーに希釈します。希釈した一次抗体の50マイクロリットルをカバースリップに置き、室温で30分間インキュベートします。カバースリップを洗濯皿の井戸に移します。洗浄を開始するには、PBSを1ミリリットル加えます。その後、洗う皿をシェーカーに移し、5分間軽く振ります。PBSを取り出し、洗浄プロセス全体を3回繰り返します。次に、カバースリップを染色皿に移します。希釈した二次抗体の50マイクロリットルをカバースリップに置き、暗闇と室温で30分間インキュベートします。カバースリップを洗濯皿に戻します。洗浄を開始するには、PBSを1ミリリットル加えます。洗浄皿をアルミニウム箔で包み、光から守ります。プレートをシェーカーに移し、5分間軽く振ります。PBSを取り出し、洗浄プロセス全体を3回繰り返します。STORMイメージングの直前に、テキストプロトコルで概説されているように、イメージングバッファを1ミリリットル用意します。カバースリップをローディングチャンバーに積み込みます。作りたてのイメージングバッファーを追加し、シアノバクテリア細胞を洗い流さないように穏やかです。この後、画像バッファーの上に長方形のカバースリップを置き、空気中の酸素と反応するのを防ぎます。カメラ、LEDライト、レーザーの電源を入れ、STORMソフトウェアを開きます。レンズの上に浸漬油の半分の滴を追加します。チャンバーをロードし、対物レンズがカバースリップに接触していることを確認します。そして、750ナノメートルのレーザーで信号を調べます。細胞と受託マーカーの両方を含むサンプル領域を特定します。次に、サンプルドリフト補正用のソフトウェアを起動します。カメラの電子乗算ゲインが300、露光時間が30ミリ秒の画像を基準として、1つのワイドファイル画像を取得します。750ナノメートルの励起レーザー強度を平方センチメートルあたり約4.5キロワットに増加させます。蛍光ホルがまばらな点滅パターンに移行したら、33ヘルツで10,000フレームを収集して1つの超解像度画像を取得します。次に、テキスト プロトコルで説明されているように、生データから超解像度イメージを再構築します。本研究では、STORMを用いて、個々のフォトスイッチ可能蛍光体をストカストに活性化させることで、超解像イメージングを達成する。すべての蛍光素の位置が記録され、これらの場所に基づいて超解像度の画像が構築されます。プロクロロコッカスの吸収スペクトルは447ナノメートルと680ナノメートルでピークを迎え、700ナノメートル以上の最小吸収を有するが、Prochlococcus MED4細胞は、STORMイメージングに必要な750ナノメートルレーザーの極めて高い強度にさらされたときに依然として高い自己蛍光を発する。ここで説明した光漂白法を30分間使用した後、自己蛍光を有する細胞は数個も検出されているが、細胞の自己蛍光は減少することが分かる。60分に光漂白を伸長させると、大部分の細胞が自家蛍光を失う。これらの結果は、開発された光漂白法が光合成生物の自己蛍光を大幅に低減できることを示している。フォトブリーチングの後、STORMは細胞内の細胞分裂タンパク質FtsZを視覚化するために使用されます。STORMを用いて、FtsZリングの詳細な形態が明らかになる。3D STORM 画像を回転させることにより、4 種類の形態、クラスタ、不完全なリング、完全なリング、およびダブル リングが特定されました。光の強度とフォトブリーチの持続時間は、異なる生物によって異なる可能性があることを覚えておくことが重要です。その開発後、この方法は、タンパク質組織と光合成細胞の潜在的な機能を詳細に研究したい研究者のための道を開きます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

使用して樹状細胞の移行の監視<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H磁気共鳴イメージング

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

madSTORMを用いたT細胞の高度に多重化された超解像イメージング

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

退色により、シアノ バクテリアプロクロロコッカスFtsZ リングの超解像イメージング

退色により、シアノバクテリアプロクロロコッカスFtsZ リングの超解像イメージング