Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

저자는 그녀의 기술 지원 및 원고에 대 한 의견 Daiying 쑤 감사합니다. 이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 (프로젝트 번호 41476147)에서 교부 금 및 연구 보조금 위원회는 홍콩 특별 행정구, 중국 (프로젝트 번호 689813 및 16103414)의 의해 지원 됩니다.

1. 샘플 준비 및 고정
<ol><li>해 수 기반 Pro99 중간12의 5 mL을 axenic Prochlorococcus MED4의 1 mL 접종 5 일 후 35 µmol 광자/m2s의 진도 빛 아래 23 ° C에서 Prochlorococcus 문화 성장, 1.5 mL 튜브에 문화의 1 mL를 수집 합니다. 참고:는 접종 후 5 일 Prochlorococcus MED4 도달 한다 늦은 로그 단계, 약 108 셀/mL, 폭풍 이미징에 대 한 적절 한입니다.</li>
	<li>문화를 해결 ?...

<ol>
	<li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier:+Super-resolution+imaging+of+cells.">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Wave+of+Cellular+Imaging.">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).</li><li>Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Komis, G., &#352;amajov&#225;, O., Ove&#269;ka, M., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+in+Plant+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li><li>Schubert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+-+Applications+in+Plant+Cell+Research.">Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Superresolution+Imaging+of+the+FtsZ+Ring+during+Cell+Division+of+the+Cyanobacterium+Prochlorococcus.">Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus.</a> mbio. 8 (6), e00657 (2017).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division:+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E.+coli+cell+fission.">Advances in understanding E. coli cell fission.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).</li><li>Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+different+nitrogen+sources+by+the+marine+cyanobacteria+Prochlorococcus+and+Synechococcus.">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li><li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope.">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).</li><li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuickPALM:+3D+real-time+photoactivation+nanoscopy+image+processing+in+ImageJ.">QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ.</a> Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+photosynthesis+in+the+oceans:+The+origins+and+significance+of+divergent+light-harvesting+strategies.">Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies.</a> Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).</li><li>Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus:+The+structure+and+function+of+collective+diversity.">Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).</li><li>Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus+and+Synechococcus+-+a+Comparative-Study+of+Their+Optical-Properties+in+Relation+To+Their+Size+and+Pigmentation.">Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation.</a> Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).</li><li>Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+3D+super-resolution+microscopy+reveals+Caulobacter+crescentusin+vivo+Z-ring+organization.">High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).</li><li>Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+multiple+biomarkers+in+captured+rare+cells+by+sequential+immunostaining+and+photobleaching.">Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching.</a> Methods. 64 (2), 108-113 (2013).</li><li>Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+photobleaching+necessary+for+Raman+imaging+of+bone+tissue+using+a+green+laser?.">Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).</li><li>Haxo, F. T., Blinks, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+Action+Spectra+of+Marine+Algae.">Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae.</a> The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).</li><li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin:+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria.">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li></ol>

이 프로토콜에서 설명 하는 cyanobacterium Prochlorococcus (그림 3C)의 autofluorescence를 크게 감소 하는 절차와, 다음, immunostain 공부 3 차원 FtsZ 폭풍을 활용 수 있게 세포에 있는 단백질 반지 Prochlorococcus (그림 4)에서 형태학. 이 프로토콜은 슈퍼 해상도 영상 다른 광합성 유기 체에 대 한 채택 될 수도 있습니다.
광합성 유기 체에...

슈퍼 해상도 microscopies 빛의 회절 한계를 휴식 하 고 하위 회절 해상도 (< 200 nm) 내에서 이미지를 제공할 수 있습니다. 그들은 널리 사용 되었습니다 많은 유기 체에서 단백질 지 방화 및 subcellular 구조 공부 하. 슈퍼 해상도 현미경 방법 등 구조화 조명 현미경 (SIM)를 주요 자극 방출 소모 현미경 (호텔 위치), 폭풍, 그리고 photoactivated 지역화 현미경 검사 법 (종 려). 메커니즘 및 응용 프로그램의 이러한 슈퍼 해상도 현미경 되었습니다 다른1,2검토.
폭풍 10 높은 해상도 달성할 수 있다 공간 분리3,4nm. 폭풍, 회절 제한 된 지역 내에서 하나의 분자 ("에") 활성화 되 고 분자의 나머지 ("off") 사 유지 됩니다. 단일 분자의-와 급속 한 스위치에의 축적, "회절 무제한" 이미지 생성된3수 있습니다. 한편, 많은 종류의 유기 염료 및 형광 단백질 고해상도 현미경5,6일반 형광 현미경 검사 법에서 쉽게 업그레이드할 수 있도록 폭풍에 적용 됩니다.
폭풍은 널리 적용 되지 광합성 세포, 박테리아, 조류, 등에서 하며 식물 세포 엽록체7,8, 사실 그 폭풍은 드라이브 photoswitching 높은 레이저 강도. 고 강도 레이저 형편이 나쁘게 광합성 세포에 강한 autofluorescence 배경 흥분 하며 폭풍 영상에서 단일 분자 지역화 방해 합니다. 폭풍우를 사용 하 여 subcellular 구조 또는 광합성 세포에 있는 단백질 상호 작용을 조사 하려면, 우리는 배경 autofluorescence 신호9를 풀기 위해 photobleaching 프로토콜을 개발 했다. 일상적인 immunofluorescent 얼룩 절차에서는 표본 단계에서 차단, 폭풍에 대 한 요구 사항에 맞게 광합성 세포의 autofluorescence를 절감 하 고 강도의 하얀 빛에 노출 됩니다. 따라서,이 프로토콜은 폭풍 안료 생물 조사 가능 합니다.
여기, 우리는 폭풍 FtsZ 반지 조직 단 세포 picocyanobacterium Prochlorococcus에서 이미지를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. FtsZ 반지 구조 (Z 반지) 셀10 의 둘레를 polymerizes 이며11세포 분열 필수적인 매우 보존된 tubulin 같은 cytoskeletal 단백질 이다. Prochlorococcus 유지은 autofluorescent 배경 및 기본 안티-FtsZ 항 체와 immunostained을 줄이기 위해 첫 번째 photobleached와 보조 반대로 토끼 (H + L) IgG 항 체는 fluorophore와 활용은 다음 (예: , 알 렉 사 Fluor 750). 결국, 폭풍우는 다른 세포 주기 단계 동안 Prochlorococcus 에서 자세한 FtsZ 반지 단체를 관찰 하는 데 사용 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

슈퍼 해상도 현미경은 단백질 상호 작용 및 많은 유기 체에서 subcellular 구조 연구에 널리 사용 되었습니다. 그러나 광합성 유기 체,, 슈퍼 해상도 영상의 가로 해상도만 ~ 100 nm. 낮은 해상도 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍) 등 슈퍼 해상도 영상에 필요한 고 강도 레이저에 의해 발생 하는 광합성 세포의 높은 autofluorescence 배경 때문 이다. 여기, 우리는 photobleaching 기반 폭풍 방법을 개발 된 최근 해양 picocyanobacterium Prochlorococcus이미징 기술. Photobleaching, 후 Prochlorococcus 의 autofluorescence는 효과적으로 감소 그 폭풍 ~ 10의 측면 분해능으로 수행할 수 있도록 nm. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 FtsZ 단백질의 조직에 vivo에서 3 차원 (3 차원)을 취득 하 고 Prochlorococcus의 세포 주기 동안 4 개의 다른 FtsZ 반지 형태학 특성. 우리는 여기에 설명 하는 방법 다른 광합성 유기 체의 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 채택 될 수도 있습니다.

폭풍 확률론 개별 photoswitchable fluorophores를 활성화 하 여 슈퍼 해상도 이미지를 달성 한다. 각 fluorophore의 위치를 기록 하 고 슈퍼 해상도 이미지 다음이 위치4에 따라 만들어집니다. 따라서, fluorophore 위치 정밀도 슈퍼 해상도 이미지 재건을 위해 중요 하다. 447 Prochlorococcus 의 흡수 스펙트럼 피크 및 680 nm,그리고 Prochlorococcus는 최소 흡수 700 nm<su...

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Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

여기 우리는 박테리아의 autofluorescence를 줄이기 위해 photobleaching 메서드를 설명 합니다. Photobleaching, 후 확률적 광학 재건 현미경 cyanobacterial FtsZ 반지의 3 차원 슈퍼 해상도 이미지를 얻을 하는 데 사용 됩니다.

Photobleaching은 Cyanobacterium Prochlorococcus 에서 FtsZ 반지의 슈퍼 해상도 이미징 가능

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

이 방법은 단백질 국소화와 광합성 유기체의 역학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 광표백 방법과 초해상도 현미경을 결합하여 광합성 유기체의 단백질 역학을 놀라운 세부 사항으로 감지할 수 있습니다. 이 방법은 프로클로로코커스의 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.그것은 또한 무선 재 도프 노래 및 박테리오 클로로소필을 포함하는 많은 다른 유기체에 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 얀신 리우 (Yanxin Liu)가 될 것입니다. 우선, 배양 플라스크에 바닷물 기반 의 Pro99 배지 의 5 밀리리터를 추가하고 프로 클로로 코커스 MED4의 1 밀리리터로 접종.평방 미터당 35 마이크로몰 광자의 강도와 빛 아래 섭씨 23도에서 프로 클로로 코커스를 성장. 5 일 후, 1.5 밀리 리터 튜브에 문화의 1 밀리 리터를 수집합니다. 문화를 고치기 위해 새로 준비된 포름알데히드 100마이크로리터를 튜브에 추가합니다.실온에서 20분 동안 어둠 속에서 배양하세요. 그런 다음 1 분 동안 13, 500 회 G에서 샘플을 회전시합니다. Pro99 배지의 100 마이크로리터에서 상체를 제거하고 세포를 다시 분리합니다.면역 염색을 수행 할 준비가 될 때까지 어둠 속에서 섭씨 4도에 샘플을 저장합니다. 첫째, 폴리스티렌 구슬의 유리병을 소용돌이. 50%에탄올을 사용하여 1대 20, 000 희석을 작동 슬러리로 준비합니다.핫플레이트를 켜고 온도를 섭씨 120도로 설정합니다. 다음으로 커버립을 핫 플레이트에 놓습니다. 작업 슬러리 100 마이크로리터를 각 커버슬립에 적재하고 핫플레이트의 커버립을 10분 동안 배양합니다.그런 다음 커버립을 페트리 접시비드 사이드위로 조심스럽게 옮겨 실온에서 보관합니다. 커버립을 코팅할 준비가 되면 하나를 검색하여 구단 쪽위로 위로 올라섭도록 합니다. 밀리리터 폴리-L-리신 용액 1밀리그램 100마이크로리터를 커버슬립 중앙에 넣고 30분 동안 실온에 앉게 합니다.그런 다음 파이펫을 사용하여 부착되지 않은 폴리 L-리신을 조심스럽게 흡인하고 1.5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 이 폴리 L-리신을 섭씨 4도에 저장하여 나중에 사용할 수 있습니다. 60mm 페트리 접시에 울트라 여과된 물 10밀리리터로 커버슬립을 헹구고 종이 타월로 짧게 건조시다.코팅 된 커버 슬립을 바닥에 파라 필름과 함께 새로운 페트리 접시로 옮기면 염색 요리로 사용됩니다. 고정 된 샘플의 100 마이크로 리터를 커버 슬립에로드하고 세포 부착을 허용하기 위해 30 분 동안 앉아있게하십시오. 다음으로, 종이 타월을 사용하여 남은 용액을 흡수한 다음 커버슬립을 12웰 플레이트에 넣고 세탁합니다.커버슬립을 세척하기 위해 PBS 버퍼 1밀리리터를 웰에 추가합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 신선한 PBS의 밀리리터 를 추가하여 커버슬립을 두 번째로 씻어낸다. 파이펫을 사용하여 PBS를 제거하고 새로 준비된 충류 버퍼 1밀리리터로 교체하십시오.20분 동안 섭씨 37도에서 세탁접시를 배양합니다. 그런 다음 투과화 버퍼를 제거합니다. 신선한 PBS 버퍼의 1 밀리리터를 추가하여 세척 과정을 시작합니다.세척 접시를 셰이커에 놓고 5분간 부드럽게 접시를 어기십시오. 그 후 PBS를 제거하고 세번 세척 과정을 반복합니다. 세척된 커버슬립을 염색 접시에 옮기습니다.커버슬립 상단에 블로킹 버퍼 50마이크로리터를 추가합니다. 전체 염색 접시를 얼음 위에 놓고 크세논 광원 아래에 이동하여 최소 60분 동안 광표백을 합니다. 표백 및 차단 후 종이 타월 가장자리를 사용하여 차단 버퍼를 제거합니다.첫째, 안티 FtsZ 항체의 마이크로리터 1개를 블로킹 버퍼의 99 마이크로리터로 희석시. 희석된 1차 항체 50마이크로리터를 커버슬립에 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 커버슬립을 세탁접시의 우물로 옮기.세척을 시작하려면 PBS 의 1 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 세척 접시를 셰이커에 옮기고 부드럽게 5 분간 흔들어 줍니다. PBS를 제거하고 전체 세척 과정을 세 번 반복합니다.다음으로, 커버슬립을 염색 접시에 옮기습니다. 희석된 이차 항체의 50마이크로리터를 커버슬립에 놓고 어둡고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 커버슬립을 세탁접시로 다시 옮기습니다.세척을 시작하려면 PBS 의 1 밀리리터를 추가합니다. 알루미늄 호일로 세척 접시를 감싸서 빛으로부터 보호합니다. 접시를 셰이커로 옮기고 부드럽게 흔들어 5분간 흔들어 줍니다.PBS를 제거하고 전체 세척 과정을 세 번 반복합니다. STORM 이미징 바로 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이미징 버퍼 1밀리리터를 준비합니다. 커버슬립을 로딩 챔버에 로드합니다.새로 준비된 이미징 버퍼를 추가하여 시아노균 세포를 씻어내지 않도록 부드럽게 합니다. 그런 다음, 공기 중의 산소와 반응하지 않도록 이미징 버퍼 위에 직사각형 커버슬립을 놓습니다. 카메라, LED 라이트 및 레이저를 켜고 STORM 소프트웨어를 엽니다.렌즈 위에 반 방울의 침지 오일을 넣습니다. 챔버를 로드하여 객관적인 렌즈가 커버슬립과 접촉하고 있는지 확인합니다. 그리고 750 나노미터 레이저로 신호를 검사한다.셀과 수탁 마커를 모두 포함하는 샘플 영역을 식별합니다. 그런 다음 샘플 드리프트 보정을 위한 소프트웨어를 시작합니다. 카메라 전자 곱셈 이득이 300밀리초, 노출 시간 30밀리초로 한 개의 와이드 포동 된 이미지를 참조로 획득하십시오.750나노미터 의 흥분 레이저 강도를 평방 센티미터당 약 4.5km로 늘립니다. 형광이 희소한 깜박임 패턴으로 전환되면 33 hertz에서 10, 000 프레임을 수집하여 하나의 슈퍼 해상도 이미지를 얻습니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 원시 데이터에서 초해상도 이미지를 재구성합니다.이 연구에서 STORM은 개별 사진 전환 형광을 관적으로 활성화하여 초해상도 이미징을 달성하는 데 사용됩니다. 모든 불소의 위치가 기록되고 이러한 위치를 기반으로 초해상도 이미지가 구성됩니다. 프로클로로 코커스의 흡수 스펙트럼은 447 및 680 나노미터에서 피크하고 700 나노미터 이상의 최소 흡수를 가지고 있지만, Prochlorococcus MED4 세포는 여전히 STORM 이미징에 필요한 750 나노미터 레이저의 매우 높은 강도에 노출되면 높은 자동 불발성을 방출합니다.여기에 설명된 포토표백 방법을 30분 동안 사용한 후, 자가형광을 가진 여러 세포가 여전히 검출되더라도 세포의 자동 형광은 감소하는 것으로 보입니다. 광표백을 60분으로 연장하면 대부분의 세포가 자가 불화를 잃게 됩니다. 이러한 결과는 개발된 광표백 방법이 광합성 유기체의 자동 형광을 크게 감소시킬 수 있음을 나타낸다.포토표백 후 STORM은 세포 분열 단백질인 FtsZ를 세포에서 시각화하는 데 사용됩니다. STORM을 사용하여 FtsZ 링의 상세한 형태가 드러난다. 3D STORM 이미지를 회전하여 4가지 유형의 형태학, 클러스터, 불완전한 링, 완전한 링 및 이중 링이 확인되었습니다.광표백의 빛 강도와 지속 시간이 다른 유기체에 대해 다를 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 방법은 단백질 조직과 광합성 세포에서의 잠재적 기능을 자세히 연구하고자 하는 연구자들을 위한 길을 열어줍니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

연구

면역학 및 감염병학

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

사용 모니터링 수지상 세포 이동<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H 자기 공명 영상

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

madSTORM을 이용한 T 세포의 고해상도 이미징

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...