Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Forfatterne takker Daiying Xu for hennes kundestøtte og kommentarer på manuskriptet. Denne studien er støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation av Kina (prosjektnummeret 41476147) og gir forskningsråd Hong Kong spesiell administrativ Region, Kina (prosjektnumre 689813 og 16103414).

1. Prøv forberedelse og fiksering
<ol><li>Vaksinere 1 mL av axenic Prochlorococcus MED4 til 5 mL av sjøvann-baserte Pro99 middels12. Vokse Prochlorococcus kulturer på 23 ° C under lys med en intensitet av 35 µmol fotoner/m2s. fem dager senere, samle 1 mL av kultur i en 1.5-mL tube. Merk: Fem dager etter vaksinasjon, Prochlorococcus MED4 vil nå slutten Logg fasen, med ca 108 cellen/mL, som er passende for STORM bildebehandling.</li>
	<li>L...

<ol>
	<li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier:+Super-resolution+imaging+of+cells.">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Wave+of+Cellular+Imaging.">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).</li><li>Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Komis, G., &#352;amajov&#225;, O., Ove&#269;ka, M., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+in+Plant+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li><li>Schubert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+-+Applications+in+Plant+Cell+Research.">Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Superresolution+Imaging+of+the+FtsZ+Ring+during+Cell+Division+of+the+Cyanobacterium+Prochlorococcus.">Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus.</a> mbio. 8 (6), e00657 (2017).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division:+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E.+coli+cell+fission.">Advances in understanding E. coli cell fission.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).</li><li>Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+different+nitrogen+sources+by+the+marine+cyanobacteria+Prochlorococcus+and+Synechococcus.">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li><li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope.">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).</li><li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuickPALM:+3D+real-time+photoactivation+nanoscopy+image+processing+in+ImageJ.">QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ.</a> Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+photosynthesis+in+the+oceans:+The+origins+and+significance+of+divergent+light-harvesting+strategies.">Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies.</a> Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).</li><li>Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus:+The+structure+and+function+of+collective+diversity.">Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).</li><li>Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus+and+Synechococcus+-+a+Comparative-Study+of+Their+Optical-Properties+in+Relation+To+Their+Size+and+Pigmentation.">Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation.</a> Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).</li><li>Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+3D+super-resolution+microscopy+reveals+Caulobacter+crescentusin+vivo+Z-ring+organization.">High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).</li><li>Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+multiple+biomarkers+in+captured+rare+cells+by+sequential+immunostaining+and+photobleaching.">Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching.</a> Methods. 64 (2), 108-113 (2013).</li><li>Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+photobleaching+necessary+for+Raman+imaging+of+bone+tissue+using+a+green+laser?.">Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).</li><li>Haxo, F. T., Blinks, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+Action+Spectra+of+Marine+Algae.">Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae.</a> The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).</li><li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin:+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria.">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li></ol>

I denne protokollen, vi beskrev en prosedyre for å redusere autofluorescence av cyanobacterium Prochlorococcus (Figur 3 c) og deretter immunostai proteinene i celler som mulig for oss å bruke STORM å studere det 3D FtsZ Ring morphologies i Prochlorococcus (Figur 4). Denne protokollen kan vedtas for super-oppløsning imaging i andre fotosynteseaktiviteten organismer.
Tidligere studier på fotosynteseaktiviteten org...

Super-oppløsning microscopies kan bryte Diffraksjon grensen av lys og gir bilder i sub Diffraksjon oppløsninger (< 200 nm). De har vært mye brukt i mange organismer protein lokalisering og subcellular strukturer. Store super-oppløsning mikroskopi metodene omfatter strukturert belysning mikroskopi (SIM), stimulert utslipp uttømming mikroskopi (STED), STORM og photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM). Mekanismer og bruk av disse super-oppløsning mikroskop har vært vurdert andre steder1,2.
STORMEN kan oppnå så høy som 10 oppløsning nm av romlige separasjon3,4. For STORM, bare ett molekyl innenfor et Diffraksjon-begrenset område er aktivert ("på") og resten av molekyler blir holdt deaktivert ("off"). En opphopning av rask slå på- og - ut av enkelt molekyler, kan en "Diffraksjon-ubegrenset" bilde være generert3. I mellomtiden, mange typer organisk fargestoffer og fluorescerende proteiner gjelder i STORM, slik at en enkel oppgradering fra vanlige fluorescens mikroskopi til høy oppløsning mikroskopi5,6.
STORMEN har ikke vært mye brukt i fotosynteseaktiviteten celler, for eksempel Cyanobakterie, alger, og anlegget celler med chloroplasts7,8, som skyldes faktum at STORM krever høy laser intensitet for å kjøre photoswitching. Høy intensitet laser unfavorably interesserer sterk autofluorescence bakgrunn i fotosynteseaktiviteten celler og forstyrrer den single-molekyl lokaliseringen i STORM bildebehandling. Bruke STORM for å undersøke subcellular strukturer eller protein interaksjoner i fotosynteseaktiviteten celler, utviklet vi en photobleaching protokoll for å slukke bakgrunn autofluorescence signaler9. I en rutinemessig immunofluorescent flekker prosedyre, er prøver utsatt for hvitt lys med en høy intensitet under det blokkerende trinnet, som senker autofluorescence fotosynteseaktiviteten celler som oppfyller kravene for STORM. Dermed gjør denne protokollen det mulig å undersøke pigmentert organismer med STORM.
Her beskriver vi protokollen for å bruke STORM for å image FtsZ ring organisasjonen i den encellede picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ er en høyt konservert tubulin-lignende cellen cytoskjelett proteiner som polymerizes for å danne en ring struktur (Z ringen) rundt omkretsen av en celle10 og er avgjørende for celledeling11. Bevart Prochlorococcus cellene er første photobleached å redusere autofluorescent bakgrunnen og immunostained med et primære anti-FtsZ antistoff, og deretter en sekundær anti-kanin IgG (H + L) antistoffer blir bøyd med en fluorophore (f.eks , Alexa Fluor 750). Til slutt, brukes STORM til å observere de detaljerte FtsZ ring organisasjonene i Prochlorococcus under forskjellige cellen syklus faser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

Super-oppløsning mikroskopi er mye brukt til å studere protein interaksjoner og subcellular strukturer i mange organismer. I fotosynteseaktiviteten organismer, men lateral oppløsningen på super-oppløsning imaging er bare ~ 100 nm. Den lave oppløsningen skyldes i hovedsak høye autofluorescence bakgrunnen fotosynteseaktiviteten celler forårsaket av høy intensitet lasere som kreves for super-oppløsning bildebehandling, som Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM). Her beskriver vi en photobleaching-assistert STORM metode som ble utviklet nylig for imaging marine picocyanobacterium Prochlorococcus. Etter photobleaching, autofluorescence av Prochlorococcus effektivt reduseres slik at STORM kan utføres med en lateral oppløsning på ~ 10 nm. Bruker denne metoden, vi skaffe i vivo tredimensjonale (3D) organiseringen av FtsZ protein og karakterisere fire ulike FtsZ ring morphologies under cellen syklus av Prochlorococcus. Metoden som beskrives her kan vedtas for super-oppløsning avbilding av andre fotosynteseaktiviteten organismer.

STORM oppnår super-oppløsning bildebehandling av personlige photoswitchable fluorophores stochastically. Plasseringen av hver fluorophore registreres og en super-oppløsning bildet er så konstruert basert på disse plasseringene4. Presisjonen for hvor fluorophore er derfor viktig for super-oppløsning bildet gjenoppbygging. Absorpsjon spektra av Prochlorococcus peak på 447 nm og 680 nm,og Prochlorococcus har et minimum absorpsjon på bølgelen...

Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Her beskriver vi en photobleaching metode for å redusere autofluorescence av Cyanobakterie. Etter photobleaching brukes stokastiske optisk rekonstruksjon mikroskopi til å få tredimensjonal super-oppløsning bilder av cyanobacterial FtsZ ringen.

Photobleaching aktiverer super-oppløsning Imaging FtsZ ringen i Cyanobacterium Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om protein lokalisering og dynamikken i fotosyntetiske organismer. Ved å kombinere fotobleachingsmetoden med mikroskop med superoppløsning, er vi i stand til å oppdage proteindynamikken til fotosyntetiske organismer i en bemerkelsesverdig detalj. Denne metoden gir ikke bare innsikt i proteindynamikken til Prochlorococcus.Det kan også brukes på mange andre organismer som inneholder radio-re-dop-synge og bakteriochlorophyll. Å demonstrere denne prosedyren vil være Yanxin Liu, en utdannet student fra laboratoriet mitt. Til å begynne med legger du til fem milliliter sjøvannsbasert Pro99-medium til en kulturkolbe og inokulerer det med ett milliliter Prochlorococcus MED4.Vokse Prochlorococcus på 23 grader Celsius under et lys med en intensitet på 35 mikromol fotoner per kvadratmeter. Etter fem dager, samle en milliliter av kulturen i en 1,5 milliliter tube. Tilsett 100 mikroliter nylaget formaldehyd til røret for å fikse kulturen.Inkuber i mørket ved romtemperatur i 20 minutter. Deretter spinner du ned prøven på 13, 500 ganger G i ett minutt. Fjern de overnaturante og gjenoppuss cellene i 100 mikroliter av Pro99 medium.Oppbevar prøven ved fire grader Celsius i mørket til den er klar til å utføre immunstaining. Først vortex hetteglasset med polystyren perler. Bruk 50% etanol, forberede en en-til-20,000 fortynning som en fungerende slurry.Slå på kokeplaten og sett temperaturen til 120 grader Celsius. Deretter plasserer du dekkglassene på kokeplaten. Legg 100 mikroliter av arbeidsslamen på hver dekkslipp og inkuber dekkslepene på kokeplaten i 10 minutter.Deretter overfører du forsiktig dekkslipper til Petri retter perle-side opp for lagring ved romtemperatur. Når du er klar til å belegge dekkglassene, hent en, og pass på at den er perle-side opp. Tilsett 100 mikroliter av ett mg per milliliter poly-L-lysinløsning til midten av dekkslippen og la den sitte ved romtemperatur i 30 minutter.Etter dette, bruk en pipette til å forsiktig aspirere eventuelle ufestede poly-L-lysin og overføre den til et 1,5 milliliter rør. Oppbevar denne poly-L-lysinen ved fire grader Celsius til senere bruk. Skyll dekkslippen med 10 milliliter ultrafiltrert vann i en 60-millimeter petriskål og tørk den deretter kort med et papirhåndkle.Overfør den belagte dekkslippen til en ny petriskål med Parafilm nederst, som vil bli brukt som fargingsfat. Legg 100 mikroliter av den faste prøven på dekkslippen og la den sitte i 30 minutter for å tillate cellevedlegg. Deretter bruker du et papirhåndkle til å absorbere den gjenværende løsningen og deretter overføre dekkslippen til en brønn i en 12-brønns plate for vasking.Tilsett en milliliter PBS-buffer til brønnen for å vaske dekkslippen. Fjern deretter PBS og tilsett en milliliter fersk PBS for å vaske dekkglasset en gang til. Bruk en pipette til å fjerne PBS og erstatte den med en milliliter nylaget permeabiliseringsbuffer.Inkuber vaskefatet ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Fjern deretter permeabiliseringsbufferen. Start vaskeprosessen ved å legge til en milliliter fersk PBS-buffer.Legg vaskefatet på en shaker for å forsiktig røre opp fatet i fem minutter. Deretter fjerner du PBS og gjentar vaskeprosessen tre ganger. Overfør den vasket dekkslipsen til fargefatet.Tilsett 50 mikroliter blokkerer buffer på toppen av dekkslippen. Plasser hele fargefatet på isen, og flytt den deretter under xenon-lyskilden for fotografering i minst 60 minutter. Etter fotobleaching og blokkering, bruk kanten av et papirhåndkle for å fjerne blokkeringsbufferen.Først fortynne en mikroliter anti-FtsZ antistoff i 99 mikroliter av blokkerende buffer. Legg 50 mikroliter av det fortynnede primære antistoffet på dekkslippen og inkuber det ved romtemperatur i 30 minutter. Overfør dekkslippen til en brønn av vaskefatet.For å starte vasken, legg til en milliliter PBS. Overfør deretter vaskefatet til en shaker og rist den forsiktig i fem minutter. Fjern PBS og gjenta hele vaskeprosessen tre ganger.Deretter overfører du dekkslippen til fargefatet. Legg 50 mikroliter av det fortynnede sekundære antistoffet på dekkslippen og inkuber det i mørket og ved romtemperatur i 30 minutter. Overfør dekkslippen tilbake til vaskefatet.For å starte vasken, legg til en milliliter PBS. Pakk vaskefatet i aluminiumsfolie for å beskytte den mot lys. Overfør platen til shakeren og rist den forsiktig i fem minutter.Fjern PBS og gjenta hele vaskeprosessen tre ganger. Umiddelbart før STORM-avbildningen, klargjør du én milliliter bildebuffer som beskrevet i tekstprotokollen. Legg dekkglasset inn i lastekammeret.Tilsett den nylagde bildebufferen, vær forsiktig for å unngå å vaske av de cyanobakterielle cellene. Etter dette plasserer du en rektangulær dekkglass på toppen av bildebufferen for å hindre at den reagerer med oksygenet i luften. Slå på kameraet, LED-lyset og laseren, og åpne STORM-programvaren.Tilsett en halv dråpe nedsenkingsolje på toppen av linsen. Legg i kammeret, og pass på at objektivet kommer i kontakt med dekkslippen. Og undersøke signalet med en 750-nanometer laser.Identifiser et utvalgsområde som inneholder både celler og fiducial markører. Start deretter programvaren for prøve drivende korreksjon. Få en bred arkivert bilder som en referanse, med kameraet elektron multiplikasjon gevinst på 300 og en eksponeringstid på 30 millisekunder.Øk 750 nanometer eksitasjon laser intensiteten til ca 4,5 kilowatt per kvadratcentimeter. Når fluoroforene har gått over til et sparsomt blinkende mønster, kan du skaffe ett superoppløsningsbilde ved å samle 10 000 bilder ved 33 hertz. Rekonstruer deretter superoppløsningsbildene fra rådata som beskrevet i tekstprotokollen.I denne studien brukes STORM til å oppnå superoppløsningsavbildning ved å aktivere individuelle foto-byttbare fluoroforer stochastically. Plasseringen av hver fluorofor registreres, og et superoppløsningsbilde bygges deretter basert på disse stedene. Mens absorpsjonsspektraet til Prochlorococcus topper på 447 og 680 nanometer og har minimumsabsorpsjon over 700 nanometer, avgir Prochlorococcus MED4-celler fortsatt høy autofluorescence når de utsettes for en ekstremt høy intensitet av 750 nanometer laseren, som kreves for STORM-avbildning.Etter bruk av fotobleachingsmetoden som er beskrevet her i 30 minutter, er cellenes autofluorescence sett å redusere, selv om flere celler med autofluorescence fortsatt oppdages. Forlenge fotobleaching til 60 minutter resulterer i at de fleste cellene mister sin autofluorescence. Disse resultatene indikerer at den utviklede fotobleachingsmetoden i stor grad kan redusere autofluorescence av fotosyntetiske organismer.Etter fotobleaching brukes STORM til å visualisere celledelingsproteinet FtsZ i cellene. Ved hjelp av STORM avsløres en detaljert morfologi av FtsZ-ringen. Ved å rotere 3D STORM-bildene ble fire forskjellige typer morfologier identifisert, klynger, en ufullstendig ring, en komplett ring og doble ringer.Det er viktig å huske at lysintensiteten og varigheten av fotobleachen kan variere for forskjellige organismer. Etter utviklingen baner denne metoden vei for forskere som ønsker å studere proteinorganisasjon og potensiell funksjon i fotosyntetiske celler i detalj.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live Imaging av T-celle signalisering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Super-oppløsning Imaging of Natural Killer Cell Immunologiske Synapse på en Glass-støttet Planar lipidbilag

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Imaging CD4 T Cell Interstitiell Migrasjon i Betente dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ og kvantitativ analyse av immun Synapse i menneskelige systemet ved hjelp av Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Meget multiplexert, superoppløselig bildebehandling av T-celler ved hjelp av madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Høy gjennomstrømming-måling av Plasma membran Resealing effektivitet i pattedyrceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluering av Host-patogen svar og vaksinen i mus

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...