Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
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Os autores agradecer Daiying Xu para a assistência técnica e comentários sobre o manuscrito. Este estudo é suportado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais da China (número do projeto 41476147) e Conselho de bolsas de investigação de Hong Kong região administrativa especial, China (números do projeto, 689813 e 16103414).

1. preparação e fixação da amostra
<ol><li>Inocule 1 mL de axénica MED4 ficobilinas para 5 mL do baseado em água do mar Pro99 médio12. Cultivar culturas ficobilinas a 23 ° C, sob a luz com uma intensidade de 35 µmol fótons/m2s. cinco dias depois, coletar 1 mL da cultura para um tubo de 1,5 mL. Nota: Cinco dias após a inoculação, ficobilinas MED4 atingirá a fase tardia do log, com aproximadamente 108 células/mL, que é apropriado ...

<ol>
	<li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier:+Super-resolution+imaging+of+cells.">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Wave+of+Cellular+Imaging.">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li><li>Rust, M. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+different+nitrogen+sources+by+the+marine+cyanobacteria+Prochlorococcus+and+Synechococcus.">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li><li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope.">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).</li><li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin:+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria.">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li></ol>

Neste protocolo, descrevemos um procedimento para reduzir significativamente a autofluorescência da Associação ficobilinas (Figura 3) e, em seguida, delgados das proteínas nas células, que nos permitiram utilizar tempestade para estudar a FtsZ 3D morfologias anel em ficobilinas (Figura 4). Este protocolo pode ser adotado para a imagem latente de super-resolução em outros organismos fotossintéticos.
Estudos an...

Microscopies de super-resolução podem quebrar o limite de difração de luz e fornecer imagens dentro de resoluções de difração sub (< 200 nm). Eles têm sido amplamente utilizados em muitos organismos para estudar a localização da proteína e estruturas subcelulares. Major Super-resolução microscopia métodos incluem iluminação estruturada microscopia (SIM), estimulou a microscopia de depleção de emissão (STED), tempestade e microscopia de localização fotoativados (PALM). Os mecanismos e aplicações destes super-resolução microscópios foram revisaram em outro lugar1,2.
TEMPESTADE pode alcançar uma resolução tão alta quanto 10 nm por separação espacial3,4. Para tempestade, somente uma molécula dentro de uma região de difração limitada é ativada ("on") e o resto das moléculas são mantidas inactivada ("off"). Pelo acúmulo de ligar rápido e - fora de moléculas simples, uma imagem "difração-ilimitado" pode ser gerado3. Entretanto, muitos tipos de corantes orgânicos e proteínas fluorescentes são aplicáveis na tempestade, permitindo uma atualização fácil de microscopia de fluorescência regular para microscopia de alta resolução5,6.
TEMPESTADE não tem sido amplamente aplicada em células fotossintéticas, como cianobactérias, algas, e células vegetais com cloroplastos7,8, que é devido ao fato de que a tempestade requer intensidade elevada do laser para unidade photoswitching. O laser de alta intensidade desfavoravelmente excita autofluorescência forte fundo nas células fotossintéticas e interfere com a localização do único-molécula em imagem de tempestade. Para usar a tempestade para investigar as estruturas subcelulares ou interações da proteína nas células fotossintéticas, desenvolvemos um protocolo de fotobranqueamento para saciar o fundo autofluorescência sinais9. Em um procedimento de coloração imunofluorescente rotina, amostras são expostas a luz branca de alta intensidade durante a etapa de bloqueio, o que reduz a autofluorescência de células fotossintéticas para cumprir as exigências para a tempestade. Assim, este protocolo torna viável para investigar organismos pigmentados com tempestade.
Aqui, descrevemos o protocolo para usar a tempestade a imagem da organização de anel FtsZ no picocyanobacterium unicelular ficobilinas. FtsZ é uma proteína do citoesqueleto altamente conservada de tubulina, como que se polimeriza para formar uma estrutura em anel (o anel Z) em torno da circunferência de uma célula10 e é essencial para a divisão celular11. Preservado ficobilinas células são primeira foto para reduzir a autofluorescent fundo e immunostained com um anticorpo primário anti-FtsZ, e em seguida um anticorpo de IgG (H + L) de antisecundário coelho é conjugado com um fluoróforo (por exemplo, , Alexa Fluor 750). Eventualmente, a tempestade é usado para observar as organizações de anel FtsZ detalhadas em ficobilinas durante fases do ciclo celular diferente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

Microscopia de super-resolução tem sido amplamente utilizada para o estudo das interações da proteína e estruturas subcelulares em muitos organismos. Em organismos fotossintéticos, no entanto, a resolução lateral da imagem latente de super-resolução é apenas ~ 100 nm. A baixa resolução é principalmente devido à alta autofluorescência fundo das células fotossintéticas causada por lasers de alta intensidade que são necessários para a imagem latente de super-resolução, tais como a microscopia de reconstrução óptica estocástico (Tempestade). Aqui, descrevemos um assistida fotobranqueamento tempestade método que foi desenvolvido recentemente para o picocyanobacterium marinho ficobilinasde imagem. Após fotobranqueamento, a autofluorescência de ficobilinas efetivamente é reduzida assim que a tempestade pode ser realizada com uma resolução lateral de ~ 10 nm. Usando este método, podemos adquirir a organização na vivo tridimensional (3D) da proteína FtsZ e caracterizar quatro diferentes morfologias de anel FtsZ durante o ciclo celular de ficobilinas. O método que descrevemos aqui pode ser adotado para o tratamento de imagens de super-resolução de outros organismos fotossintéticos.

TEMPESTADE atinge imagem super-resolução ativando photoswitchable individuais fluorophores estocàstica. A localização de cada fluoróforo é registrada e uma imagem de super-resolução então é construída com base nestes locais4. Portanto, a precisão da localização fluoróforo é importante para a reconstrução de imagem super resolução. Os espectros de absorção de ficobilinas um pico de 447 nm e 680 nme ficobilinas tem uma absorç...

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Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Aqui nós descrevemos um método fotobranqueamento para reduzir a autofluorescência de cianobactérias. Depois fotobranqueamento, microscopia de reconstrução óptica estocástico é usada para obter imagens tridimensionais de super-resolução do anel FtsZ cianobactérias.

Fotobranqueamento permite Super-resolução imagem do anel FtsZ a associação ficobilinas

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre localização de proteínas e a dinâmica em organismos fotossintéticos. Combinando o método de fotobleaching com microscópio de super-resolução, somos capazes de detectar a dinâmica proteica de organismos fotossintéticos em um detalhe notável. Este método não só fornece uma visão da dinâmica proteica do Prochlorococcus.Também pode ser aplicado a muitos outros organismos que contêm radio-re-dop-sing e bacteriochlorophyll. Demonstrando este procedimento será Yanxin Liu, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, adicione cinco mililitros de meio Pro99 à base de água do mar a um frasco de cultura e inocula-o com um mililitro de Prochlorococcus MED4.Cresça o Prochlorococcus a 23 graus Celsius sob uma luz com uma intensidade de 35 fótons micromole por metro quadrado. Depois de cinco dias, colete um mililitro da cultura em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 100 microliters de formaldeído recém-preparado ao tubo para corrigir a cultura.Incubar no escuro à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, gire a amostra a 13.500 vezes G por um minuto. Remova o supernascer e resuspenja as células em 100 microliters do meio Pro99.Armazene a amostra a quatro graus Celsius no escuro até que esteja pronto para realizar a imunostaining. Primeiro, vórtice o frasco de contas de poliestireno. Usando 50% de etanol, prepare uma diluição de 1 a 20.000 como um chorume de trabalho.Ligue a placa quente e afina a temperatura para 120 graus Celsius. Em seguida, coloque as tampas na placa quente. Carregue 100 microliters do chorume de trabalho em cada tampa e incubar as tampas na placa de aquecimento por 10 minutos.Em seguida, transfira cuidadosamente as tampas para as placas de Petri para armazenamento à temperatura ambiente. Quando estiver pronto para revestir as tampas, recupere uma, certificando-se de que ela esteja do lado das contas para cima. Adicione 100 microliters de uma solução de um miligrama por mililitro de poli-L-lisina ao centro da fenda e deixe-o sentado em temperatura ambiente por 30 minutos.Depois disso, use uma pipeta para aspirar cuidadosamente qualquer poli-l-lysina nãoectada e transfira-a para um tubo de 1,5 mililitro. Armazene esta poli-L-lysine a quatro graus Celsius para uso posterior. Enxágüe o deslizamento com 10 mililitros de água ultra filtrada em uma placa de Petri de 60 milímetros e, em seguida, seque-o brevemente com uma toalha de papel.Transfira o talo revestido para uma nova placa de Petri com Parafilm na parte inferior, que será usada como a placa de coloração. Carregue 100 microliters da amostra fixa no deslizamento de tampas e deixe descansar por 30 minutos para permitir o apego celular. Em seguida, use uma toalha de papel para absorver a solução restante e, em seguida, transfira o deslizamento de tampas para um poço em uma placa de 12 poços para lavar.Adicione um mililitro de tampão PBS ao poço para lavar a tampa. Em seguida, remova o PBS e adicione um mililitro de PBS fresco para lavar o deslizamento de tampas uma segunda vez. Use uma pipeta para remover o PBS e substitua-o por um mililitro de tampão de permeabilização recém-preparado.Incubar a assada a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, remova o tampão de permeabilização. Inicie o processo de lavagem adicionando um mililitro de tampão PBS fresco.Coloque o prato de lavagem em um agitador para agitar suavemente o prato por cinco minutos. Depois disso, remova o PBS e repita o processo de lavagem três vezes. Transfira a mancha lavada para o prato de coloração.Adicione 50 microliters de tampão de bloqueio na parte superior da tampa. Coloque todo o prato de coloração no gelo e, em seguida, mova-o sob a fonte de luz de xenônio para fotobleaching por pelo menos 60 minutos. Depois de fotobleachar e bloquear, use a borda de uma toalha de papel para remover o tampão de bloqueio.Primeiro, diluir um microliter de anticorpo anti-FtsZ em 99 microliters de tampão de bloqueio. Coloque 50 microliters do anticorpo primário diluído no deslizamento de tampas e incuba-o à temperatura ambiente por 30 minutos. Transfira o deslizamento para um poço do prato de lavagem.Para começar a lavagem, adicione um mililitro de PBS. Em seguida, transfira o prato de lavagem para um agitador e agite-o suavemente por cinco minutos. Retire o PBS e repita todo o processo de lavagem três vezes.Em seguida, transfira o deslizamento de cobertura para o prato de coloração. Coloque 50 microliters do anticorpo secundário diluído sobre o deslizamento de tampas e incuba-o no escuro e à temperatura ambiente por 30 minutos. Transfira o deslizamento de volta para o prato de lavagem.Para começar a lavagem, adicione um mililitro de PBS. Enrole o prato de lavagem em papel alumínio para protegê-lo da luz. Transfira a placa para o agitador e agite-a suavemente por cinco minutos.Retire o PBS e repita todo o processo de lavagem três vezes. Imediatamente antes da imagem STORM, prepare um mililitro de tampão de imagem conforme descrito no protocolo de texto. Coloque a tampa na câmara de carregamento.Adicione o tampão de imagem recém-preparado, sendo suave para evitar lavar as células cianobacterianas. Depois disso, coloque uma mancha retangular em cima do tampão de imagem para evitar que ele reaja com o oxigênio no ar. Ligue a câmera, a luz LED e o laser, e abra o software STORM.Adicione meia gota de óleo de imersão em cima da lente. Carregue a câmara, certificando-se de que a lente objetiva está fazendo contato com a tampa. E examine o sinal com um laser de 750 nanômetros.Identifique uma área amostral que contenha células e marcadores fiduciários. Em seguida, inicie o software para correção de deriva de amostra. Adquira uma imagem ampla como referência, com o ganho de multiplicação de elétrons da câmera em 300 e um tempo de exposição de 30 milissegundos.Aumente a intensidade do laser de excitação de 750 nanômetros para aproximadamente 4,5 quilowatts por centímetro quadrado. Uma vez que os fluoroforos tenham transitado para um padrão de piscar esparso, adquira uma imagem de super resolução coletando 10.000 quadros a 33 hertz. Em seguida, reconstrua as imagens de super-resolução a partir dos dados brutos, conforme descrito no protocolo de texto.Neste estudo, o STORM é usado para obter imagens de super resolução ativando fluoroforos foto-comutação individual estochasticamente. A localização de cada fluoróforo é registrada, e uma imagem de super resolução é então construída com base nesses locais. Enquanto o espectro de absorção de Prochlorococcus atinge picos de 447 e 680 nanômetros e tem absorção mínima acima de 700 nanômetros, as células Prochlorococcus MED4 ainda emitem alta autofluorescência quando expostas a uma intensidade extremamente alta do laser de 750 nanômetros, o que é necessário para imagens STORM.Depois de usar o método de fotobleaching descrito aqui por 30 minutos, a autofluorescência das células é vista para diminuir, embora várias células com autofluorescência ainda sejam detectadas. Alongar o fotobleaching para 60 minutos resulta na maioria das células perdendo sua autofluorescência. Esses resultados indicam que o método de fotobleaching desenvolvido é capaz de reduzir consideravelmente a autofluorescência de organismos fotossintéticos.Após a fotobleaching, storm é usado para visualizar a proteína de divisão celular, FtsZ, nas células. Usando STORM, uma morfologia detalhada do anel FtsZ é revelada. Ao girar as imagens 3D STORM, foram identificados quatro tipos diferentes de morfologias, aglomerados, um anel incompleto, um anel completo e anéis duplos.É importante lembrar que a intensidade da luz e duração do fotobleach podem diferir para diferentes organismos. Após seu desenvolvimento, esse método abre caminho para pesquisadores que desejam estudar a organização de proteínas e a função potencial em células fotossintéticas em detalhes.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo de imagens de parasitas Leishmania transgênicas em um host ao vivo

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Imunologia e Infecção

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Ressonância Magnética

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Super-Resolution Imaging da Célula Natural Killer imunológica Synapse em um vidro com suporte Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imagem altamente multiplexada e de super resolução de células T usando madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...