Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Авторы благодарят Daiying Xu за ее техническую помощь и комментарии на рукопись. Это исследование поддерживается гранты от Фонда национального естественных наук Китая (номер 41476147 проекта) и научно-исследовательских грантов Советом Специального административного района Гонконг, Китай (номера проектов 689813 и 16103414).

1. Образец подготовки и фиксации
<ol><li>Прививать 1 мл стерильных Prochlorococcus MED4 до 5 мл на основе морской воды Pro99 средних12. Расти Prochlorococcus культур при 23 ° C под свет с интенсивностью 35 мкмоль фотоны/m2s. пять дней спустя, собирать 1 мл культуры в 1,5 мл. Примечание: Чере...

<ol>
	<li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier:+Super-resolution+imaging+of+cells.">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Wave+of+Cellular+Imaging.">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).</li><li>Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Komis, G., &#352;amajov&#225;, O., Ove&#269;ka, M., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+in+Plant+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li><li>Schubert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+-+Applications+in+Plant+Cell+Research.">Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Superresolution+Imaging+of+the+FtsZ+Ring+during+Cell+Division+of+the+Cyanobacterium+Prochlorococcus.">Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus.</a> mbio. 8 (6), e00657 (2017).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division:+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E.+coli+cell+fission.">Advances in understanding E. coli cell fission.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).</li><li>Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+different+nitrogen+sources+by+the+marine+cyanobacteria+Prochlorococcus+and+Synechococcus.">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li><li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope.">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).</li><li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuickPALM:+3D+real-time+photoactivation+nanoscopy+image+processing+in+ImageJ.">QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ.</a> Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+photosynthesis+in+the+oceans:+The+origins+and+significance+of+divergent+light-harvesting+strategies.">Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies.</a> Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).</li><li>Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus:+The+structure+and+function+of+collective+diversity.">Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).</li><li>Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus+and+Synechococcus+-+a+Comparative-Study+of+Their+Optical-Properties+in+Relation+To+Their+Size+and+Pigmentation.">Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation.</a> Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).</li><li>Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+3D+super-resolution+microscopy+reveals+Caulobacter+crescentusin+vivo+Z-ring+organization.">High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).</li><li>Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+multiple+biomarkers+in+captured+rare+cells+by+sequential+immunostaining+and+photobleaching.">Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching.</a> Methods. 64 (2), 108-113 (2013).</li><li>Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+photobleaching+necessary+for+Raman+imaging+of+bone+tissue+using+a+green+laser?.">Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).</li><li>Haxo, F. T., Blinks, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+Action+Spectra+of+Marine+Algae.">Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae.</a> The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).</li><li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin:+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria.">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li></ol>

В этом протоколе, мы описали процедура значительно сократить аутофлюоресценция цианобактерии Prochlorococcus (рис. 3 c) и, затем, имунноконтраст белков в клетках, которые позволили нам использовать шторм для того чтобы изучить 3-D FtsZ кольцо морфологии в Prochlorococcus (<strong class=...

Суперразрешением microscopies может нарушить дифракционный предел света и предоставляют изображения в рамках резолюций Подкомиссии дифракции (< 200 Нм). Они широко используются во многих организмах для изучения белков локализации и внутриклеточных структур. Основные суперразрешением микроскопии методы включают структурированного освещения микроскопии (SIM), стимулировали выбросов истощения микроскопии (интереса), шторм и photoactivated локализации микроскопии (PALM). 1,2обзор других механизмов и применения этих супер-резолюции, которые были микроскопы.
ШТОРМ может достичь резолюции аж 10 Нм, пространственное разделение3,4. Для ШТОРМА только одна молекула в регион дифракционный активируется («по») и остальная часть молекулы хранятся инактивированных («выключено»). Накоплением быстрого переключения на и - офф одной молекулы «дифракционный Безлимитный» изображение может быть сгенерированный3. Между тем многие виды органических красителей и флуоресцентные белки применимы в шторм, что позволяет легко модернизировать от регулярных флуоресцентной микроскопии высокого разрешения микроскопии5,6.
ШТОРМ не применяется широко в фотосинтезирующих клеток, таких как синезеленых водорослей, морских водорослей, и растительных клеток с хлоропластов7,8, которая обусловлена тем, что шторм требует высокой лазерной интенсивности для привода photoswitching. Высокой интенсивности лазерного неблагоприятно возбуждает аутофлюоресценция сильный фон в фотосинтезирующих клеток и препятствует сингл молекула локализации в шторм изображений. Чтобы использовать шторм расследовать внутриклеточных структур или белковых взаимодействий в фотосинтезирующих клеток, мы разработали протокол Фотообесцвечивание чтобы утолить фон аутофлюоресценция сигналы9. В процедуре обычной immunofluorescent окрашивания образцов подвергаются белый свет высокой интенсивности во время блокировки шага, который понижает аутофлюоресценция фотосинтезирующих клеток для удовлетворения требований для ШТОРМА. Таким образом этот протокол делает возможным расследовать пигментированной организмов с ШТОРМОМ.
Здесь мы описываем протокол использовать ШТОРМА для изображений FtsZ кольцо Организации одноклеточных picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ является весьма сохранены тубулин как цитоскелета белком, который polymerizes сформировать структуру кольцо (кольцо Z) по окружности ячейки10 и имеет важное значение для деления клеток11. Сохранились Prochlorococcus клетки первого photobleached уменьшить фон autofluorescent и immunostained с основных анти FtsZ антитела, и затем вторичные антитела IgG (H + L) анти кролик проспряганное с Флюорофор (например , Alexa Fluor 750). В конце концов шторм используется для наблюдать подробную FtsZ кольцо организаций в Prochlorococcus стадии различных клеточного цикла.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

Супер-резолюции микроскопии широко использовался для изучения взаимодействия протеина и внутриклеточных структур многих организмов. В фотосинтетических организмов, однако, латеральное разрешение суперразрешением изображений является только ~ 100 Нм. Низкое разрешение обусловлено главным образом высоким аутофлюоресценция фон фотосинтезирующих клеток, вызванные лазеров высокой интенсивности, которые необходимы для супер-резолюции изображений, таких как стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм). Здесь мы описываем при содействии Фотообесцвечивание шторм метод который была разработана недавно для изображений морской picocyanobacterium Prochlorococcus. После Фотообесцвечивание, Аутофлюоресценция Prochlorococcus эффективно снижается так что шторм может быть выполнена с латеральное разрешение ~ 10 Нм. С помощью этого метода, мы приобретаем в vivo трехмерной (3-D) Организации FtsZ белка и характеризуют четыре различных FtsZ кольцо морфологии во время цикла клетки Prochlorococcus. Метод, который мы описываем здесь могут быть приняты для супер-резолюции изображений других фотосинтетических организмов.

Шторм достигает суперразрешением изображений путем активации отдельных фотопереключаемых флуорофоров ковшах. Расположение каждого Флюорофор записывается и супер-разрешение изображения затем строится на основе этих мест4. Таким образом точность место?...

Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Здесь мы описываем метод Фотообесцвечивание для снижения аутофлюоресценция цианобактерий. После Фотообесцвечивание стохастический оптических реконструкции микроскопии используется для получения изображений трехмерных суперразрешением цианобактерий кольца FtsZ.

Фотообесцвечивание позволяет супер резолюции изображений FtsZ кольца в цианобактерии Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы по локализации белка и динамике в фотосинтетических организмах. Объединив метод фотоблейинга с микроскопом супер-разрешения, мы можем обнаружить белковую динамику фотосинтетических организмов в замечательной детали. Этот метод не только дает представление о белковой динамике Прохлорококка.Он также может быть применен ко многим другим организмам, содержащим радио-re-dop-sing и bacteriochlorophyll. Демонстрацией этой процедуры будет Янсин Лю, аспирант моей лаборатории. Для начала добавьте пять миллилитров морской воды на основе среды Pro99 в культурную колбу и прививайте ее одним миллилитром Prochlorococcus MED4.Выращиваем прохлорококк при 23 градусах Цельсия при свете с интенсивностью 35 микромоленых фотонов на квадратный метр. Через пять дней соберите один миллилитр культуры в 1,5 миллилитровую трубку. Добавьте 100 микролитров свежеприготовленного формальдегида в трубку, чтобы исправить культуру.Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем, спина вниз образца на 13500 раз G в течение одной минуты. Удалите супернатант и повторно наполните клетки в 100 микролитров среды Pro99.Храните образец при четырех градусах Цельсия в темноте до готовности к проведению иммуностимулятора. Во-первых, вихрь флакон из полистирола бисера. Используя 50% этанола, приготовьте разбавление от одного до 20 000 в качестве рабочей суспензии.Включите плиту и установите температуру до 120 градусов по Цельсию. Затем поместите крышки на горячую тарелку. Загрузите 100 микролитров рабочей суспензии на каждую крышку и инкубировать крышки на плите в течение 10 минут.Затем осторожно перенесите крышки в чашки Петри бисером для хранения при комнатной температуре. Когда готовы покрыть крышки, получить один, убедившись, что это бисером вверх. Добавьте 100 микролитров по 1 миллиграмму на миллилитр раствора поли-L-лизина в центр крышки и дайте ему сидеть при комнатной температуре в течение 30 минут.После этого используйте пипетку, чтобы тщательно аспирировать любой непривязанный поли-L-лизин и перенести его в 1,5 миллилитровую трубку. Храните этот поли-L-лизин при четырех градусах цельсия для более длительного использования. Промыть крышку 10 миллилитров ультра фильтрованной воды в 60-миллиметровой чашке Петри, а затем кратко высушить его бумажным полотенцем.Перенесите крышку с покрытием на новую чашку Петри с Parafilm внизу, которая будет использоваться в качестве окрашивания. Загрузите 100 микролитров фиксированного образца на крышку и дайте ему сидеть в течение 30 минут, чтобы позволить вложение ячейки. Затем используйте бумажное полотенце, чтобы поглотить оставшийся раствор, а затем передать крышку в колодец в 12-хорошо пластины для мытья.Добавьте один миллилитр буфера PBS к хорошо для мытья крышки. Затем удалите PBS и добавить один миллилитр свежего PBS для мытья крышки во второй раз. Используйте пипетки, чтобы удалить PBS и заменить его на один миллилитр свежеприготовленного буфера протеабилизации.Инкубировать мытье посуды при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Затем удалите буфер пермеабилизации. Начните процесс стирки, добавив один миллилитр свежего буфера PBS.Поместите мытье посуды на шейкер, чтобы аккуратно агитировать блюдо в течение пяти минут. После этого удалите PBS и повторите процесс стирки три раза. Перенесите промытую крышку на окрашивание блюда.Добавьте 50 микролитров блокирующего буфера в верхней части крышки. Поместите все окрашивание блюдо на лед, а затем переместить его под ксенон источник света для фотоотливания, по крайней мере 60 минут. После фотоблейинга и блокировки используйте край бумажного полотенца для удаления блокирующего буфера.Во-первых, разбавить один микролитер анти-Fts' антитела в 99 микролитров блокирующего буфера. Поместите 50 микролитров разбавленного первичного антитела на крышку и инкубировать его при комнатной температуре в течение 30 минут. Перенесите крышку в колодец стиральной тарелки.Для начала стирки добавьте один миллилитр PBS. Затем перенесите мытье посуды в шейкер и аккуратно встряхните его в течение пяти минут. Удалите PBS и повторите весь процесс стирки три раза.Затем перенесите крышку на окрашивание блюда. Поместите 50 микролитров разбавленного вторичного антитела на крышку и инкубировать его в темноте и при комнатной температуре в течение 30 минут. Перенесите крышку обратно в стиральную тарелку.Для начала стирки добавьте один миллилитр PBS. Оберните стиральную тарелку в алюминиевую фольгу, чтобы защитить ее от света. Перенесите тарелку в шейкер и аккуратно встряхните ее в течение пяти минут.Удалите PBS и повторите весь процесс стирки три раза. Непосредственно перед изображением STORM подготовьтесь к одному миллилитру буфера изображений, как указано в текстовом протоколе. Загрузите крышку в погрузочную камеру.Добавьте свежеприготовленный буфер изображения, будучи нежным, чтобы избежать смывания цианобактериальных клеток. После этого поместите прямоугольный крышку поверх буфера изображения, чтобы предотвратить его реакцию с кислородом в воздухе. Включите камеру, светодиодный свет и лазер и откройте программное обеспечение STORM.Добавить пол капли масла погружения на верхней части объектива. Загрузите камеру, убедившись, что объектив цели соего контакта с крышкой. И изучите сигнал с помощью 750-нанометрового лазера.Определите область выборки, которая содержит как клетки, так и фидуциальные маркеры. Затем запустите программное обеспечение для коррекции проб дрейфа. Приобрети одно широкое изображение в качестве эталона, с увеличением умножения электронов камеры на 300 и временем экспозиции 30 миллисекунд.Увеличьте интенсивность лазера возбудивания 750 нанометров примерно до 4,5 киловатт на квадратный сантиметр. После того, как флюорофоры перешли в разреженный мигающий узор, приобрети одно изображение супер-разрешения, собрав 10 000 кадров на 33 герц. Затем реконструируют изображения супер-разрешения из необработанных данных, изложенных в текстовом протоколе.В этом исследовании, STORM используется для достижения супер-разрешение изображения путем активации отдельных фото-переключаемых фторфоров стохастично. Расположение каждого фторфора записывается, и изображение с супер-разрешением затем строится на основе этих мест. В то время как спектры поглощения Prochlorococcus достигает 447 и 680 нанометров и имеет минимальное поглощение выше 700 нанометров, клетки Prochlorococcus MED4 по-прежнему излучают высокую аутофторесценцию при воздействии чрезвычайно высокой интенсивности 750-нанометрового лазера, который необходим для визуализации STORM.После использования метода фотоотливания, описанного здесь в течение 30 минут, наблюдается снижение аутофторесценции клеток, хотя несколько клеток с аутофторесценцией все еще обнаружены. Удлинение фотооттеки до 60 минут приводит к потере большинством клеток аутофторесценции. Эти результаты свидетельствуют о том, что разработанный метод фотоблейинга способен значительно снизить аутофторесценцию фотосинтетических организмов.После фотоблейинга, STORM используется для визуализации белка деления клеток, Fts, в клетках. С помощью STORM раскрывается подробная морфология кольца Фтса. Путем вращать изображения 3D STORM, 4 по-разному типа морфологий были определены, кластеры, неполное кольцо, вполне кольцо, и двойные кольца.Важно помнить, что интенсивность света и продолжительность фотоблейча могут отличаться для разных организмов. После своего развития, этот метод прокладывает путь для исследователей, которые хотят изучить организацию белка и потенциальную функцию в фотосинтетических клетках в деталях.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

В естественных изображений трансгенных Паразиты Leishmania в реальный хост

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Использование изображений Биолюминесцентный по расследованию синергизм между Пневмококк И вируса гриппа А в младенческой Мыши

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

В режиме реального времени Живая съемка Т-клеточного сигнального комплекса Формирование

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Мониторинг дендритных клеток с использованием миграции<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Магнитно-резонансная томография

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Супер-Resolution Imaging в естественных клеток-киллеров Иммунологические Synapse на стекло при поддержке Planar липидного бислоя

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Воображение CD4 Т-клеток Внутритканевая миграции в воспаленном дермы

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Высоко мультиплексированная, высокоразрешающая визуализация т-клеток с использованием madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Высок объём измерение плазматической мембраны запечатывания эффективность в клетках млекопитающих

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Оценка хост возбудитель ответы и эффективность вакцины в мышей

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...