Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
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Los autores agradecen Daiying Xu por su asistencia y comentarios sobre el manuscrito. Este estudio es apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (número de proyecto 41476147) y el Consejo de becas de investigación de la región administrativa especial Hong Kong, China (números de proyecto 689813 y 16103414).

1. preparación y fijación de la muestra
<ol><li>Inocular 1 mL de axénicos Prochlorococcus MED4 a 5 mL de base de agua de mar Pro99 medio12. Crecer culturas Prochlorococcus a 23 ° C a la luz con una intensidad de 35 μmol fotones/m2s. cinco días más tarde, recoger 1 mL de cultivo en un tubo de 1,5 mL. Nota: Cinco días después de la inoculación, Prochlorococcus MED4 llegará la última fase de registro, con aproximadamente 108 células/m...

<ol>
	<li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier:+Super-resolution+imaging+of+cells.">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Wave+of+Cellular+Imaging.">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li><li>Rust, M. 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En este protocolo, se describe un procedimiento para reducir significativamente la autofluorescencia de la cianobacteria Prochlorococcus (figura 3) y, luego, immunostain las proteínas en las células, que nos permitieron utilizar tormenta para estudiar la FtsZ 3D morfologías de anillo en Prochlorococcus (figura 4). Este protocolo puede adoptarse para la proyección de imagen de súper-resolución de otros organismos fotosintéticos.
<p cl...

Microscopías de super-resolución pueden romper el límite de difracción de la luz y proporcionan imágenes en resoluciones de la secundario-difracción (< 200 nm). Han sido ampliamente utilizados en muchos organismos para estudiar la localización de proteínas y estructuras subcelulares. Grandes súper resolución microscopia métodos incluyen microscopía de iluminación estructurada (SIM), estimuló la microscopia de agotamiento de la emisión (STED), tormenta y microscopía de localización fotoactivado (PALM). Los mecanismos y aplicaciones de estos súper-resolución microscopios han sido revisaron en otra parte1,2.
TORMENTA puede alcanzar una resolución tan alta como 10 nm por separación espacial3,4. Para la tormenta, solamente una molécula dentro de una región limitada de la difracción está activada ("on") y el resto de las moléculas se mantienen inactiva ("off"). Por una acumulación de encendido rápido y - de las moléculas individuales, una imagen "difracción ilimitado" puede ser generado3. Mientras tanto, muchas clases de colorantes orgánicos y proteínas fluorescentes son aplicables en la tormenta, lo que permite una fácil actualización de microscopía de fluorescencia regular a microscopía de alta resolución5,6.
TORMENTA no se ha aplicado extensamente en células fotosintéticas, como cianobacterias, algas y células vegetales con cloroplastos7,8, que es debido al hecho de la tormenta requiere intensidad de láser de alta a la unidad photoswitching. El láser de alta intensidad desfavorable excita autofluorescence fuerte fondo en células fotosintéticas e interfiere con la localización de una sola molécula en proyección de imagen de la tormenta. Para poder utilizar tormenta para investigar las estructuras subcelulares o interacciones de la proteína en células fotosintéticas, hemos desarrollado un protocolo fotoblanqueo para calmar el fondo autofluorescence señales9. En un procedimiento rutinario de tinción inmunofluorescente, ejemplares están expuestos a la luz blanca de alta intensidad durante la etapa de bloqueo que reduce el autofluorescence de células fotosintéticas para cumplir los requisitos para la tormenta. Así, este protocolo hace posible investigar organismos pigmentados con tormenta.
Aquí, describimos el protocolo para usar la tormenta a la imagen de la organización del anillo de FtsZ en la picocyanobacterium unicelular Prochlorococcus. FtsZ es una proteína citoesquelética altamente conservada de tubulina-como que se polimeriza para formar una estructura de anillo (el anillo Z) alrededor de la circunferencia de un celular de10 y es esencial para la división celular11. Conserva Prochlorococcus células son primer photobleached para reducir el fondo autofluorescent y immunostained con un anticuerpo primario anti-FtsZ, y entonces un anticuerpo de IgG (H+L) de anti-conejo secundario se conjuga con un fluoróforo (p. ej. , Alexa Fluor 750). Finalmente, la tormenta se utiliza para observar a las organizaciones detalladas de anillo de FtsZ en Prochlorococcus en etapas del ciclo de la célula diferentes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

Microscopía de superresolución ha sido ampliamente utilizado para el estudio de las interacciones entre proteínas y estructuras subcelulares en muchos organismos. En organismos fotosintéticos, sin embargo, la resolución lateral de proyección de imagen de súper-resolución es sólo de ~ 100 nm. La baja resolución es principalmente debido al fondo de la autofluorescencia alta de células fotosintéticas causados por rayos láser de alta intensidad que se requieren para la proyección de imagen de súper-resolución, tales como microscopía óptica estocástica de la reconstrucción (tormenta). Aquí, describimos un asistida por photobleaching tormenta método desarrollado recientemente para la proyección de imagen la picocyanobacterium Marina Prochlorococcus. Después de photobleaching, el autofluorescence de Prochlorococcus es reducido por lo que la tormenta se puede realizar con una resolución lateral de ~ 10 nm. Usando este método, adquiere la organización en vivo tridimensional (3D) de la proteína FtsZ y caracterizar cuatro diferentes morfologías de anillo de FtsZ durante el ciclo celular de Prochlorococcus. El método que se describe aquí puede adoptarse para la proyección de imagen de súper-resolución de otros organismos fotosintéticos.

TORMENTA alcanza proyección de imagen de súper-resolución activando fotoconmutables individuales fluoróforos estocástico. Se registra la ubicación de cada fluoróforo y una súper resolución de imagen se construye entonces basado en estos puntos4. Por lo tanto, la precisión de la localización del fluoróforo es importante para la reconstrucción de imagen de la estupendo-resolución. Los espectros de absorción de Prochlorococcus pico en 447 nm y ...

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Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Aquí se describe un método de fotoblanqueo para reducir la autofluorescencia de las cianobacterias. Después de photobleaching, microscopia óptica estocástica de la reconstrucción se utiliza para obtener imágenes de resolución súper tridimensional del anillo de FtsZ cianobacterias.

Fotoblanqueo permite proyección de imagen de súper-resolución del anillo de FtsZ en la cianobacteria Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la localización de proteínas y la dinámica en organismos fotosintéticos. Al combinar el método de fotoblanca con el microscopio de superresor resolución, somos capaces de detectar la dinámica proteica de los organismos fotosintéticos en un detalle notable. Este método no sólo proporciona información sobre la dinámica proteica de Prochlorococcus.También se puede aplicar a muchos otros organismos que contienen radio-re-dop-sing y bacterioclorofila. Demostrar este procedimiento será Yanxin Liu, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para empezar, añada cinco mililitros de pro99 a base de agua de mar medio a un matraz de cultivo e inocularlo con un mililitro de Prochlorococcus MED4.Crecer el Prochlorococcus a 23 grados Celsius bajo una luz con una intensidad de 35 fotones micromóleos por metro cuadrado. Después de cinco días, recoger un mililitro del cultivo en un tubo de 1,5 mililitros. Añadir 100 microlitros de formaldehído recién preparado al tubo para fijar el cultivo.Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego, gire hacia abajo la muestra a 13, 500 veces G durante un minuto. Retire el sobrenadante y resusppend las células en 100 microlitros de medio Pro99.Almacene la muestra a cuatro grados centígrados en la oscuridad hasta que esté lista para realizar la inmunosumanía. Primero, vórtice el vial de cuentas de poliestireno. Usando 50%etanol, preparar una dilución de uno a 20.000 como un lodo de trabajo.Encienda la placa de cocción y ajuste la temperatura a 120 grados Centígrados. A continuación, coloque los cubreobjetos en la placa caliente. Cargue 100 microlitros de la suspensión de trabajo en cada cubreobjetos e incubar los cubreobjetos en la placa eléctrica durante 10 minutos.A continuación, transfiera cuidadosamente los cubreobjetos a los platos de Petri del lado del cordón para almacenarlos a temperatura ambiente. Cuando esté listo para cubrir los cubreobjetos, recupere uno, asegurándose de que esté del lado del cordón hacia arriba. Añadir 100 microlitros de una solución de poli-L-lisina de un miligramo por mililitro al centro del cubreobjeto y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.Después de esto, utilice una pipeta para aspirar cuidadosamente cualquier poli-lisina no atada y transfiérelo a un tubo de 1,5 mililitros. Almacene esta poli-L-lisina a cuatro grados Celsius para su uso posterior. Enjuague el cubreobjetos con 10 mililitros de agua ultrafiltrada en un plato Petri de 60 milímetros y luego séquelo brevemente con una toalla de papel.Transfiera el cubreobjeto recubierto a un nuevo plato de Petri con Parafilm en la parte inferior, que se utilizará como plato de tinción. Cargue 100 microlitros de la muestra fija en el cubreobjetos y déjelo reposar durante 30 minutos para permitir la fijación de la célula. A continuación, utilice una toalla de papel para absorber la solución restante y luego transfiera el cubreobjetos a un pozo en una placa de 12 pozos para el lavado.Agregue un mililitro de tampón PBS al pozo para lavar el cubreobjetos. A continuación, retire el PBS y agregue un mililitro de PBS fresco para lavar el cubreobjetos una segunda vez. Utilice una pipeta para extraer el PBS y reemplazarlo por un mililitro de tampón de permeabilización recién preparado.Incubar el plato de lavado a 37 grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, quite el búfer de permeabilización. Comience el proceso de lavado añadiendo un mililitro de tampón PBS fresco.Coloque el plato de lavado en una coctelera para agitar suavemente el plato durante cinco minutos. Después de esto, retire el PBS y repita el proceso de lavado tres veces. Transfiera el cubreobjetos lavado al plato de tinción.Agregue 50 microlitros de búfer de bloqueo en la parte superior del cubreobjetos. Coloque toda la bandeja de tinción sobre hielo y luego muévala debajo de la fuente de luz de xenón para fotoblanchar durante al menos 60 minutos. Después de fotoblanquear y bloquear, utilice el borde de una toalla de papel para quitar el búfer de bloqueo.En primer lugar, diluir un microlitro de anticuerpo anti-FtsZ en 99 microlitros de tampón de bloqueo. Coloque 50 microlitros del anticuerpo primario diluido en el cubreobjetos e incimélo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transfiera el cubreobjetos a un pozo del plato de lavado.Para comenzar el lavado, agregue un mililitro de PBS. A continuación, transfiera el plato de lavado a una coctelera y agítelo suavemente durante cinco minutos. Retire el PBS y repita todo el proceso de lavado tres veces.A continuación, transfiera el cubreobjetos a la placa de tinción. Coloque 50 microlitros del anticuerpo secundario diluido en el cubreobjetos e inciba en la oscuridad y a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transfiera el cubreobjetos de vuelta a la placa de lavado.Para comenzar el lavado, agregue un mililitro de PBS. Envuelva el plato de lavado en papel de aluminio para protegerlo de la luz. Transfiera el plato a la coctelera y agítela suavemente durante cinco minutos.Retire el PBS y repita todo el proceso de lavado tres veces. Inmediatamente antes de la toma de imágenes STORM, prepare un mililitro de búfer de imágenes como se describe en el protocolo de texto. Cargue el cubreobjetos en la cámara de carga.Agregue el tampón de imágenes recién preparado, siendo suave para evitar lavar las células cianobacterianas. Después de esto, coloque un cubreobjetos rectangular en la parte superior del búfer de imágenes para evitar que reaccione con el oxígeno en el aire. Encienda la cámara, la luz LED y el láser, y abra el software STORM.Agregue media gota de aceite de inmersión en la parte superior de la lente. Cargue la cámara, asegurándose de que el objetivo esté haciendo contacto con el cubreobjetos. Y examine la señal con un láser de 750 nanómetros.Identifique un área de muestra que contenga celdas y marcadores fiduciarios. A continuación, inicie el software para la corrección de deriva de muestra. Adquiera una imagen de archivo ancho como referencia, con la ganancia de multiplicación de electrones de la cámara a 300 y un tiempo de exposición de 30 milisegundos.Aumente la intensidad del láser de excitación de 750 nanómetros a aproximadamente 4,5 kilovatios por centímetro cuadrado. Una vez que los fluoróforos han pasado a un patrón de parpadeo disperso, adquiera una imagen de super resolución recogiendo 10.000 fotogramas a 33 hercios. A continuación, reconstruya las imágenes de superprosorción a partir de los datos sin procesar como se describe en el protocolo de texto.En este estudio, STORM se utiliza para lograr imágenes de super-resolución mediante la activación de fluoróforos foto-conmutables individuales estocásticamente. Se registra la ubicación de cada fluoróforo y se construye una imagen de super resolución basada en estas ubicaciones. Mientras que los espectros de absorción de Prochlorococcus alcanzan un máximo de 447 y 680 nanómetros y tienen una absorción mínima superior a 700 nanómetros, las células de Prochlorococcus MED4 todavía emiten alta autofluorescencia cuando se exponen a una intensidad extremadamente alta del láser de 750 nanómetros, que se requiere para la toma de imágenes STORM.Después de usar el método de fotoblanqueo descrito aquí durante 30 minutos, se observa que la autofluorescencia de las células disminuye, aunque todavía se detectan varias células con autofluorescencia. El alargamiento del fotoblancar a 60 minutos hace que la mayoría de las células pierdan su autofluorescencia. Estos resultados indican que el método de fotoblanquido desarrollado es capaz de reducir en gran medida la autofluorescencia de los organismos fotosintéticos.Después del fotoblancada, STORM se utiliza para visualizar la proteína de división celular, FtsZ, en las células. Usando STORM, se revela una morfología detallada del anillo FtsZ. Al rotar las imágenes 3D STORM, se identificaron cuatro tipos diferentes de morfologías, racimos, un anillo incompleto, un anillo completo y anillos dobles.Es importante recordar que la intensidad de la luz y la duración del fotoblanqueo pueden diferir para diferentes organismos. Después de su desarrollo, este método allana el camino para los investigadores que quieren estudiar la organización de proteínas y la función potencial en las células fotosintéticas en detalle.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Investigación

Inmunología e Infección

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

De las Migraciones células dendríticas mediante resonancia 19F / 1H Magnetic

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Multiplexado de alta resolución de imágenes de células T utilizando madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...