Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Författarna vill tacka Daiying Xu för hennes tekniskt stöd och synpunkter på manuskriptet. Denna studie stöds av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (projektnummer 41476147) och beviljar Vetenskapsrådet för den särskilda administrativa regionen Hongkong, Kina (projektnummer 689813 och 16103414).

1. prov förberedelse och fixering
<ol><li>Inokulera 1 mL axenic Prochlorococcus MED4 till 5 mL av havsvatten-baserade Pro99 medium12. Växa Prochlorococcus kulturer vid 23 ° C under ljuset med en intensitet av 35 µmol fotoner/m2s. fem dagar senare, samla 1 mL av kulturen i ett 1,5 mL rör. Obs: Fem dagar efter inympningen, Prochlorococcus MED4 når den sena fasen logg, med cirka 108 celler/mL, vilket är lämpligt för avbildning av STORM.</...

<ol>
	<li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier:+Super-resolution+imaging+of+cells.">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Wave+of+Cellular+Imaging.">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).</li><li>Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Komis, G., &#352;amajov&#225;, O., Ove&#269;ka, M., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+in+Plant+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li><li>Schubert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+-+Applications+in+Plant+Cell+Research.">Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Superresolution+Imaging+of+the+FtsZ+Ring+during+Cell+Division+of+the+Cyanobacterium+Prochlorococcus.">Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus.</a> mbio. 8 (6), e00657 (2017).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division:+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E.+coli+cell+fission.">Advances in understanding E. coli cell fission.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).</li><li>Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+different+nitrogen+sources+by+the+marine+cyanobacteria+Prochlorococcus+and+Synechococcus.">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li><li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope.">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).</li><li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuickPALM:+3D+real-time+photoactivation+nanoscopy+image+processing+in+ImageJ.">QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ.</a> Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+photosynthesis+in+the+oceans:+The+origins+and+significance+of+divergent+light-harvesting+strategies.">Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies.</a> Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).</li><li>Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus:+The+structure+and+function+of+collective+diversity.">Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).</li><li>Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus+and+Synechococcus+-+a+Comparative-Study+of+Their+Optical-Properties+in+Relation+To+Their+Size+and+Pigmentation.">Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation.</a> Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).</li><li>Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+3D+super-resolution+microscopy+reveals+Caulobacter+crescentusin+vivo+Z-ring+organization.">High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).</li><li>Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+multiple+biomarkers+in+captured+rare+cells+by+sequential+immunostaining+and+photobleaching.">Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching.</a> Methods. 64 (2), 108-113 (2013).</li><li>Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+photobleaching+necessary+for+Raman+imaging+of+bone+tissue+using+a+green+laser?.">Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).</li><li>Haxo, F. T., Blinks, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+Action+Spectra+of+Marine+Algae.">Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae.</a> The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).</li><li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin:+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria.">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li></ol>

I detta protokoll, beskrev vi ett förfarande för att avsevärt minska autofluorescens av Cyanobakterien Prochlorococcus (figur 3 c) och, sedan immunostain proteinerna i cellerna, vilket gjorde det möjligt för oss att utnyttja STORM för att studera den 3D-FtsZ Ring morfologier i Prochlorococcus (figur 4). Detta protokoll kan antas för super-upplösning imaging i andra fotosyntetiska organismer.
Tidigare studier ...

Super-upplösning microscopies kan bryta diffraktionsgränsen av ljus och ger bilder inom sub diffraktion resolutioner (< 200 nm). De har allmänt använts i många organismer för att studera protein lokalisering och subcellulära strukturer. Major super-resolution mikroskopi metoder omfattar strukturerade belysningen mikroskopi (SIM), stimulerat utsläpp utarmning mikroskopi (STED), STORM och photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM). Mekanismerna och tillämpningar av dessa super-upplösning Mikroskop har varit recenserade någon annanstans1,2.
STORMEN kan uppnå en upplösning som är så hög som 10 nm med rumsliga avskiljandet3,4. För STORM, endast en molekyl inom en diffraktion begränsad region är aktiverad (”on”) och resten av molekylerna hålls inaktiverade (”off”). Av en ansamling av snabb switch-on - och off av enstaka molekyler, kan en ”diffraktion-obegränsad” bild vara genererade3. Under tiden, många typer av organiska färgämnen och fluorescerande proteiner är tillämpliga i STORM, möjliggör en enkel uppgradering från regelbundna fluorescensmikroskopi högupplösande mikroskopi5,6.
STORMEN har inte tillämpats allmänt i fotosyntetiska celler, såsom cyanobakterier, alger, och växtceller med kloroplaster7,8, som beror på faktumet att STORM kräver hög laser intensitet att driva photoswitching. Hög intensitet laser unfavorably väcker stark autofluorescens bakgrund i fotosyntetiska celler och stör singel-molekyl lokaliseringen i STORM imaging. För att kunna använda STORM för att undersöka den subcellulära strukturer eller proteininteraktioner i fotosyntetiska celler, utvecklade vi ett fotoblekning protokoll för att släcka bakgrunden autofluorescens signaler9. I en rutinmässig Immunofluorescerande färgningsproceduren utsätts exemplar till vitt ljus med en hög intensitet under blockerande steg, vilket sänker autofluorescens fotosyntetiska celler att uppfylla kraven för STORM. Således gör detta protokoll det möjligt att undersöka pigmenterade organismer med STORM.
Här beskriver vi protokollet om du vill använda STORM till bild FtsZ ring organisationen i de encelliga picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ är ett mycket tubulin-liknande cytoskeletal protein som polymerizes för att bilda en ringstruktur (Z ring) runt omkretsen av en cell10 och är viktigt för celldelningen11. Bevarade Prochlorococcus celler är första photobleached att minska autofluorescent bakgrund och immunostained med en primär anti-FtsZ antikropp och sedan en sekundär anti-kanin IgG (H + L) antikropp är konjugerat med en fluorophore (t.ex. , Alexa Fluor 750). Så småningom används STORM att iaktta de detaljerade FtsZ ring organisationerna i Prochlorococcus under olika cellcykelns faser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

Super-resolution mikroskopi har använts att studera proteininteraktioner och subcellulära strukturer i många organismer. I fotosyntetiserande organismer, men super-upplösning imaging lateral upplösning är endast ~ 100 nm. Den låga upplösningen beror främst på hög autofluorescens bakgrunden av fotosyntetiska celler som orsakas av hög intensitet lasrar som krävs för super-upplösning imaging, såsom stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM). Här beskriver vi en fotoblekning-assisted STORM metod som utvecklades nyligen för imaging den marina picocyanobacterium Prochlorococcus. Efter fotoblekning, reduceras effektivt autofluorescens av Prochlorococcus så att stormen kan utföras med en lateral upplösning på ~ 10 nm. Med den här metoden vi förvärva i vivo tredimensionell (3-D) organisationen av FtsZ protein och karakterisera fyra olika FtsZ ring morfologier under cellcykeln av Prochlorococcus. Den metod som vi beskriver här kan antas för den super-upplösning imaging andra fotosyntetiska organismer.

STORM uppnår super-upplösning imaging genom att aktivera enskilda photoswitchable fluorophores stochastically. Placeringen av varje fluorophore registreras och en super-upplösning bilden sedan konstrueras utifrån dessa platser4. Precisionen av fluorophore var därför viktigt för super-upplösning bild återuppbyggnad. Absorberingsspectra av Prochlorococcus topp på 447 nm och 680 nm,och Prochlorococcus har en minimal absorption vid vågläng...

Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Här beskriver vi en fotoblekning metod för att minska autofluorescens av cyanobakterier. Efter fotoblekning används stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi att erhålla tredimensionella super-upplösning bilder av Cyanobakterie FtsZ ringen.

Fotoblekning gör super-upplösning Imaging av FtsZ Ring i det Cyanobakterien Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor om protein lokalisering och dynamiken i fotosyntetiska organismer. Genom att kombinera fotobleaching metoden med super-upplösning mikroskop, vi kan upptäcka proteindynamiken i fotosyntetiska organismer i en anmärkningsvärd detalj. Denna metod ger inte bara insikt i proteindynamiken i Prochlorococcus.Det kan också appliceras på många andra organismer som innehåller radio-re-dop-sing och bakterioklorofyll. Demonstrera denna procedur kommer att Yanxin Liu, en doktorand från mitt laboratorium. Till att börja med, tillsätt fem milliliter havsvattenbaserade Pro99 medium till en odlingskolv och inokulera den med en milliliter Prochlorococcus MED4.Odla Prochlorococcusen på 23 grader Celsius under en ljus med en intensitet av 35 mikromolfotoner per kvadratmeter. Efter fem dagar, samla en milliliter av kulturen i en 1,5 milliliter tub. Lägg till 100 mikroliter av nyberedd formaldehyd till röret för att fixa kulturen.Inkubera i mörker i rumstemperatur i 20 minuter. Sedan snurrar du ner provet vid 13, 500 gånger G i en minut. Ta bort supernatanten och resuspend cellerna i 100 mikroliter av Pro99 medium.Förvara provet i fyra grader Celsius i mörkret tills det är redo att utföra immunostaining. Först virvel vikalen av polystyren pärlor. Använd 50%etanol, förbereda en en-till-20, 000 utspädning som en fungerande slurry.Sätt på värmeplattan och ställ in temperaturen på 120 grader Celsius. Placera därefter täcken på värmeplattan. Lasta 100 mikroliter av arbetsslammet på varje täckplatta och inkubera täcken på värmeplattan i 10 minuter.Sedan försiktigt överföra täcken till Petri rätter pärla-sida upp för förvaring vid rumstemperatur. När du är redo att belägga täcken, hämta en, se till att det är pärla-sida upp. Lägg till 100 mikroliter av en ett milligram per milliliter poly-L-lysinlösning till mitten av täcket och låt den sitta i rumstemperatur i 30 minuter.Efter detta, använd en pipett för att noggrant aspirera någon lös poly-L-lysin och överföra den till en 1,5 milliliter rör. Förvara denna poly-L-lysin vid fyra grader Celsius för senare användning. Skölj täcket med 10 milliliter ultra filtrerat vatten i en 60-millimeters Petriskål och torka den sedan kort med en pappershandduk.Överför den belagda täckslip till en ny Petriskål med Parafilm i botten, som kommer att användas som färgning skålen. Ladda 100 mikroliter av det fasta provet på täcket och låt det sitta i 30 minuter för att tillåta celltillsats. Därefter använder en pappershandduk för att absorbera den återstående lösningen och sedan överföra täckskydd till en brunn i en 12-brunnsplatta för tvätt.Tillsätt en milliliter PBS-buffert i brunnen för att tvätta täcket. Ta sedan bort PBS och tillsätt en milliliter färsk PBS för att tvätta täcket en andra gång. Använd en pipett för att ta bort PBS och ersätta den med en milliliter nyberedd permeabiliseringsbuffert.Inkubera diskrätten i 37 grader Celsius i 20 minuter. Ta sedan bort permeabiliseringsbufferten. Påbörja tvättprocessen genom att lägga till en milliliter färsk PBS-buffert.Placera tvätträtten på en shaker för att försiktigt agitera skålen i fem minuter. Efter detta, ta bort PBS och upprepa tvättprocessen tre gånger. Överför den tvättade täckfärgen till färgningsfatet.Lägg till 50 mikroliter av blockerande buffert på ovansidan av täcket. Placera hela färgningsfatet på is och flytta den sedan under xenonljuskällan för fotoblekning i minst 60 minuter. Efter fotoblekning och blockering använder du kanten på en pappershandduk för att ta bort blockeringsbufferten.Först späd en mikroliter av anti-FtsZ antikropp i 99 mikroliter av blockerande buffert. Placera 50 mikroliter av den utspädda primära antikroppen på täcket och inkubera den i rumstemperatur i 30 minuter. Överför täcket till en brunn av tvätten.För att börja tvätta, tillsätt en milliliter PBS. Överför sedan diskrätten till en shaker och skaka försiktigt den i fem minuter. Ta bort PBS och upprepa hela tvättprocessen tre gånger.Därefter överför du täckfärgen till färgningsfatet. Placera 50 mikroliter av den utspädda sekundära antikroppen på täcket och inkubera den i mörker och i rumstemperatur i 30 minuter. Överför överdragsslipen tillbaka till diskfatet.För att börja tvätta, tillsätt en milliliter PBS. Linda diskrätten i aluminiumfolie för att skydda den från ljus. Överför plattan till skakren och skaka den försiktigt i fem minuter.Ta bort PBS och upprepa hela tvättprocessen tre gånger. Omedelbart före STORM-avbildningen, förbered en milliliter bildbuffert enligt textprotokollet. Ladda täckskydden i lastkammaren.Tillsätt den nyberedda bildbufferten och var försiktig för att undvika att de cyanobakteriella cellerna tvättas bort. Placera efter detta en rektangulär täckbild ovanpå bildframställningsbufferten för att förhindra att den reagerar med syret i luften. Slå på kameran, LED-lampan och lasern, och öppna PROGRAMVARAN STORM.Tillsätt en halv droppe nedsänkning olja på toppen av linsen. Ladda kammaren, se till att objektivet är att få kontakt med coverslip. Och undersöka signalen med en 750-nanometerlaser.Identifiera ett provområde som innehåller både celler och fiducialmarkörer. Starta sedan programvaran för provdriftningskorrigering. Förvärva en bred arkiverad bilder som referens, med kameran elektron multiplikation vinst på 300 och en exponeringstid på 30 millisekunder.Öka 750-nanometer excitation laser intensitet till cirka 4,5 kilowatt per kvadratcentimeter. När fluoroforerna har övergått till ett glest blinkande mönster, förvärva en super-upplösning bild genom att samla 10, 000 bilder på 33 hertz. Rekonstruera sedan superupplösningsbilderna från rådata som de beskrivs i textprotokollet.I denna studie används STORM för att uppnå super-upplösning imaging genom att aktivera enskilda foto-switchable fluoroforer stokastiskt. Platsen för varje fluorofor registreras, och en super-upplösning bild konstrueras sedan baserat på dessa platser. Medan absorptionsspektra av Prochlorococcus toppar på 447 och 680 nanometer och har minsta absorption över 700 nanometer, Prochlorococcus MED4 celler fortfarande avger hög autofluorescens när de utsätts för en extremt hög intensitet av 750-nanometer laser, som krävs för STORM imaging.Efter att ha använt metoden photobleaching som beskrivs här i 30 minuter, cellerna'autofluorescens ses minska, även om flera celler med autofluorescens fortfarande upptäcks. Avlånga fotobleaching till 60 minuter resulterar i majoriteten av cellerna förlorar sin autofluorescens. Dessa resultat indikerar att den utvecklade fotobleaching metoden är kapabel att kraftigt minska autofluorescensen av fotosyntetiska organismer.Efter fotoblekning används STORM för att visualisera celldelningsproteinet, FtsZ, i cellerna. Med hjälp av STORM avslöjas en detaljerad morfologi av FtsZ-ringen. Genom att rotera 3D STORM-bilderna identifierades fyra olika typer av morfologier, kluster, en ofullständig ring, en komplett ring och dubbla ringar.Det är viktigt att komma ihåg att fotobleachens ljusintensitet och varaktighet kan skilja sig åt för olika organismer. Efter dess utveckling banar denna metod vägen för forskare som vill studera proteinorganisation och potentiell funktion i fotosyntetiska celler i detalj.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo avbildning av Transgena Leishmania parasiter i ett Live-värd

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Använda Bioluminescent Imaging för att undersöka synergi mellan Streptococcus pneumoniae Och influensa A-virus i modersmjölksersättning Möss

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live avbildning av T-cellsignalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Övervakning dendritceller Migration hjälp<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Super-upplösning avbildning av Natural Killer Cell Immunologisk Synapse på en Glass-stött Planar lipidbiskiktet

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Imaging CD4 T-cell Interstitial Migration i Inflammerade Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ och kvantitativ analys av immun synapsen i det mänskliga systemet använder Imaging flödescytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Mycket multiplexerad, superupplösning av T-celler med hjälp av madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Hög genomströmning mätning av plasmamembranet återförslutning effektivitet i däggdjursceller

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Utvärdering av värd-patogen svaren och vaccinets effekt hos möss

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...