Name: photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus
Uploaded: 2018-11-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Yazarlar Daiying Xu onun teknik yardım ve el yazması üzerine yorum için teşekkür ederiz. Bu çalışmada, Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı, Çin'den (proje numarası 41476147) hibe ve araştırma hibe Konseyi, Hong Kong özel idari bölgesi, Çin (proje numaraları 689813 ve 16103414) tarafından desteklenir.

1. örnek hazırlama ve fiksasyon
<ol><li>Deniz suyu tabanlı Pro99 orta125 ml axenic Prochlorococcus MED4 1 mL aşılamak. Prochlorococcus kültür ışığı altında 23 ° C'de 35 µmol fotonlar/m2s. bir yoğunluk ile beş gün sonra büyümek, kültür 1 mL 1.5 mL tüp içine toplamak. Not: Beş gün sonra aşılama ile yaklaşık 108 hücre/mL, geç log fazı olan fırtına görüntüleme için uygun olduğu Prochlorococcus MED4 ulaşacak....

<ol>
	<li>Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+barrier:+Super-resolution+imaging+of+cells.">Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells.</a> Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Wave+of+Cellular+Imaging.">A New Wave of Cellular Imaging.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).</li><li>Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Komis, G., &#352;amajov&#225;, O., Ove&#269;ka, M., &#352;amaj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+in+Plant+Cell+Imaging.">Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging.</a> Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).</li><li>Schubert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+Microscopy+-+Applications+in+Plant+Cell+Research.">Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Superresolution+Imaging+of+the+FtsZ+Ring+during+Cell+Division+of+the+Cyanobacterium+Prochlorococcus.">Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus.</a> mbio. 8 (6), e00657 (2017).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division:+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E.+coli+cell+fission.">Advances in understanding E. coli cell fission.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).</li><li>Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+different+nitrogen+sources+by+the+marine+cyanobacteria+Prochlorococcus+and+Synechococcus.">Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus.</a> Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).</li><li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user-friendly+two-color+super-resolution+localization+microscope.">A user-friendly two-color super-resolution localization microscope.</a> Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).</li><li>Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuickPALM:+3D+real-time+photoactivation+nanoscopy+image+processing+in+ImageJ.">QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ.</a> Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+photosynthesis+in+the+oceans:+The+origins+and+significance+of+divergent+light-harvesting+strategies.">Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies.</a> Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).</li><li>Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus:+The+structure+and+function+of+collective+diversity.">Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).</li><li>Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prochlorococcus+and+Synechococcus+-+a+Comparative-Study+of+Their+Optical-Properties+in+Relation+To+Their+Size+and+Pigmentation.">Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation.</a> Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).</li><li>Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+3D+super-resolution+microscopy+reveals+Caulobacter+crescentusin+vivo+Z-ring+organization.">High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).</li><li>Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+multiple+biomarkers+in+captured+rare+cells+by+sequential+immunostaining+and+photobleaching.">Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching.</a> Methods. 64 (2), 108-113 (2013).</li><li>Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+photobleaching+necessary+for+Raman+imaging+of+bone+tissue+using+a+green+laser?.">Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).</li><li>Haxo, F. T., Blinks, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+Action+Spectra+of+Marine+Algae.">Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae.</a> The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).</li><li>Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoerythrocyanin+and+Phycoerythrin:+Properties+and+Occurrence+in+Cyanobacteria.">Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria.</a> Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).</li></ol>

Bu protokol için biz cyanobacterium Prochlorococcus (Şekil 3 c) autofluorescence önemli ölçüde azaltmak için bir prosedür açıklanan ve daha sonra immunostain 3-b FtsZ çalışmaya fırtına kullanmak için bize etkin hücre proteinleri Yüzük türleri morfoloji olarak Prochlorococcus (Şekil 4). Bu iletişim kuralı için süper kararlılık düşsel fotosentetik diğer organizmalarda kabul.
Fotosentetik c...

Süper çözünürlük microscopies ışığın kırınım sınırını kırmak ve alt kırınım çözünürlükleri (< 200 nm) içinde görüntüler sunar. Bunlar yaygın birçok organizmalarda protein yerelleştirme ve hücre altı yapıları incelemek için kullanılmıştır. Binbaşı Süper çözünürlük mikroskobu yöntemleri arasında yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), uyarılmış emisyonu tükenmesi mikroskobu (STED), fırtına ve photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM). Mekanizmaları ve mikroskoplar olmuştur bu süper çözünürlük uygulamaları başka bir yerde1,2gözden geçirdim.
FIRTINA 10'a kadar yüksek bir çözünürlük elde edebilirsiniz nm uzaysal ayırma3,4. FIRTINA, bir kırınım-sınırlı bölge içinde tek bir molekül ("on") etkinleştirilir ve molekülleri kalan ("uzak") Inaktif tutulur. Bir birikimi hızlı geçiş on ve - off tek moleküller tarafından oluşturulan3"kırınım-sınırsız" bir görüntü olabilir. Bu arada, birçok türde organik boya ve floresan proteinler yüksek çözünürlüklü mikroskobu5,6düzenli floresans mikroskobu kolay bir yükseltme izin fırtınada tabidir.
FIRTINA geniş Siyanobakteriler, yosun, gibi fotosentetik hücrelerdeki uygulanmamış ve bitki hücreleri ile kloroplast7,ki...... fırtına nedeni olan8, sürücü photoswitching için yüksek lazer yoğunluğu gerektirir. Yüksek yoğunluktaki lazer olumsuz ve güçlü autofluorescence arka planda fotosentetik hücreleri heyecanlandıran tek molekül yerelleştirme fırtına görüntülemede etkilemektedir. FIRTINA hücre altı yapıları veya protein etkileşimleri fotosentetik hücrelerdeki araştırmak için kullanmak için arka plan autofluorescence sinyalleri9gidermek için photobleaching iletişim kuralı geliştirilmiştir. Rutin bir immünfloresan boyama işlem içinde numuneler fotosentetik hücrelerinin fırtına gereksinimlerini autofluorescence düşürür engelleme adım sırasında yüksek yoğunluklu beyaz ışığa maruz kalır. Böylece, bu iletişim kuralını fırtına ile pigmentli organizmalar araştırmak için uygun yapar.
Burada, tek hücreli picocyanobacterium ProchlorococcusFtsZ yüzük kuruluşta görüntüye fırtına kullanılacak protokol açıklayın. FtsZ hücre10 çevresi halka yapısının (Z halka) oluşturmak için polymerizes ve hücre bölünmesi11için gerekli olan bir son derece korunmuş tübülin benzeri hücre iskeleti proteindir. Prochlorococcus korunmuş hücrelerdir autofluorescent arka plan ve immunostained bir birincil anti-FtsZ antikor ile azaltmak için ilk photobleached ve sonra ikincil bir anti-tavşan (H + L) IgG antikor fluorophore ile Birleşik (Örneğin , Alexa Fluor 750). Sonunda, fırtına Prochlorococcus detaylı FtsZ yüzük kuruluşlarda farklı hücre döngüsü aşamaları sırasında gözlemlemek için kullanılır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene particles</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-20-10</td>
			<td>2.0-2.4 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0111580</td>
			<td>18 mm &#8709;, Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9155</td>
			<td>mol wt 70,000-150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 50%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>340855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, 2-hydrate</td>
			<td>Gold biotechnology</td>
			<td>E-210-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Anabaena FtsZ antibody</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS07217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21039</td>
			<td>conjugated with Alexa Fluor 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Viologen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>856177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclooctatetraene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>138924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XD-300 Xenon light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STORM microscope</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rohdea</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for imaging acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna</td>
			<td>NBI</td>
			<td>SRiS 3.0</td>
			<td>software for drifting correction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickPALM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Viewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&#38;category=Home</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photobleaching enables super-resolution imaging of the ftsz ring in the cyanobacterium prochlorococcus

Süper çözünürlük mikroskobu protein etkileşimleri ve çoğu canlıda hücre altı yapıları incelemek için yaygın olarak kullanılmış. Fotosentetik canlılar arasında süper kararlılık düşsel yanal çözünürlük sadece 100 ~ be nm. Düşük çözünürlük çok yüksek autofluorescence hücrelerin arka planını Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına) gibi süper kararlılık düşsel için gerekli olan yüksek yoğunluklu lazerler neden fotosentetik kaynaklanmaktadır. Burada, deniz picocyanobacterium Prochlorococcusgörüntüleme için son zamanlarda geliştirilen bir photobleaching destekli fırtına yöntemi açıklanmaktadır. O fırtına ~ 10 yanal çözünürlük ile yapılabilir böylece photobleaching sonra etkili bir şekilde Prochlorococcus autofluorescence azalır nm. Bu yöntemi kullanarak, biz vivo içinde üç boyutlu (3-D) organizasyon FtsZ protein elde etmek ve Prochlorococcushücre döngüsü sırasında dört farklı FtsZ yüzük türleri morfoloji karakterize. Biz burada tarif yöntemi fotosentetik diğer organizmaların süper kararlılık düşsel için kabul edilebilir.

FIRTINA süper kararlılık düşsel bireysel photoswitchable fluorophores stochastically harekete geçirerek elde eder. Her fluorophore konumunu kaydedilir ve bir süper çözünürlüklü görüntü sonra bu mekanlar4üzerinde dayalı inşa edilmiştir. Bu nedenle, fluorophore konumu duyarlığını Süper çözünürlük görüntü yeniden yapılanma için önemlidir. Prochlorococcus emme spectra zirve 447 nm ve 680 nmve Prochlorococcus dalga b...

Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus at JoVE.com

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Burada Siyanobakteriler autofluorescence azaltmak için photobleaching yöntemi açıklanmaktadır. Photobleaching sonra Stokastik optik imar mikroskobu siyanobakteriyel FtsZ ringin üç boyutlu Süper çözünürlük fotoğraf elde etmek için kullanılır.

Photobleaching Cyanobacterium Prochlorococcus FtsZ ringde Süper çözünürlük görüntüleme sağlar

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...

Bu yöntem, protein lokalizasyonu ve fotosentetik organizmaların dinamiği ile ilgili anahtar soruların cevaplandırılmasına yardımcı olabilir. Fotobeyaztma yöntemini süper çözünürlüklü mikroskopla birleştirerek, fotosentetik organizmaların protein dinamiklerini dikkate değer bir ayrıntıyla tespit edebiliyoruz. Bu yöntem sadece Prochlorococcus'un protein dinamikleri hakkında bilgi sağlar.Ayrıca radyo-re-dop-sing ve bakteriyoklorofil içeren diğer birçok organizmaya uygulanabilir. Bu prosedürü gösteren Yanxin Liu, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak. Başlamak için, bir kültür şişesine beş mililitre deniz suyu bazlı Pro99 ortamı ekleyin ve bir mililitre Prochlorococcus MED4 ile aşılamak.Metrekare başına 35 mikromol foton yoğunluğu ile bir ışık altında 23 santigrat derece Prochlorococcus büyümek. Beş gün sonra, 1.5 mililitrelik bir tüp içine kültür bir mililitre toplamak. Kültürü düzeltmek için tüpe 100 mikrolitre taze hazırlanmış formaldehit ekleyin.20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. Daha sonra, bir dakika için 13, 500 kez G örnek aşağı spin. Supernatant çıkarın ve Pro99 orta 100 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.İmmünoboyama yapmaya hazır olana kadar numuneyi karanlıkta dört derecede saklayın. İlk olarak, polistiren boncuk şişe girdap. %50 etanol kullanarak, çalışan bir bulamaç olarak bir-20, 000 seyreltme hazırlayın.Ocaktabelasını açın ve sıcaklığı 120 dereceye ayarlayın. Daha sonra, kapaklar sıcak plaka üzerine yerleştirin. Her bir kapak kapağına 100 mikrolitre iş bulamacı yükleyin ve kapak dudaklarını 10 dakika boyunca ocakta kuluçkaya yatırın.Daha sonra kapaklarını oda sıcaklığında saklanmak üzere dikkatlice Petri yemeklerine ad-side aktarın. Kapakları kaplamaya hazır olduğunuzda, boncuk tarafı yukarı olduğundan emin olmak için bir tane alın. Kapak kaymamerkezi mililitre poli-L-lizin çözeltisi başına bir miligram 100 mikrolitre ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında oturup bekleyin.Bundan sonra, herhangi bir bekar poli-L-lizin dikkatle aspire ve 1.5 mililitrelik bir tüp aktarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra kullanmak üzere bu poli-L-lizini dört santigrat derecede saklayın. 60 milimetrelik petri kabında 10 mililitre ultra filtrelenmiş su yla kapağı durulayın ve kağıt havluyla kısa bir süre kurulayın.Kaplamalı kapak kapağını alt kısmında Parafilm olan yeni bir Petri kabına aktarın ve bu kabı boyama kabı olarak kullanılacaktır. Sabit numunenin 100 mikrolitresini coverslip'e yükleyin ve hücre ekine izin vermek için 30 dakika boyunca oturun. Daha sonra, kalan çözeltiyi emmek için bir kağıt havlu kullanın ve daha sonra yıkama için 12 kuyulu bir tabakta bir kuyuya kapak kayma aktarın.Kapak kaymayı yıkamak için kuyuya bir mililitre PBS tampon ekleyin. Sonra PBS çıkarın ve ikinci kez coverslip yıkamak için taze PBS bir mililitre ekleyin. PBS kaldırmak ve taze hazırlanmış permeabilizasyon tampon bir mililitre ile değiştirmek için bir pipet kullanın.Çamaşır kabını 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra permeabilization tampon kaldırın. Bir mililitre taze PBS tampon u ekleyerek yıkama işlemine başlayın.Yavaşça beş dakika boyunca çanak ajite bir shaker üzerine yıkama çanak yerleştirin. Bundan sonra, PBS çıkarın ve yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Yıkanmış kapak kaymasını boyama kabına aktarın.Coverslip üstüne engelleme tampon 50 mikrolitre ekleyin. Buz üzerine tüm boyama çanak yerleştirin ve sonra en az 60 dakika fotobeyazrlama için xenon ışık kaynağı altında hareket ettirin. Fotobeyaztma ve engelleme den sonra, engelleme tamponu kaldırmak için kağıt havlu kenarını kullanın.İlk olarak, bir mikrolitre anti-FtsZ antikorını 99 mikrolitre lik tampon tamponu seyreltin. Seyreltilmiş primer antikordan 50 mikrolitreyi kapak kaymasıüzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kapak kapağını bulaşık kabının kuyuya aktarın.Yıkamaya başlamak için bir mililitre PBS ekleyin. Sonra bir shaker için yıkama çanak aktarın ve yavaşça beş dakika sallayın. PBS'yi çıkarın ve tüm yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.Daha sonra, örtüyü boyama kabına aktarın. Seyreltilmiş sekonder antikordan 50 mikrolitreyi kapağın üzerine yerleştirin ve 30 dakika boyunca karanlıkta ve oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Kapak kapağını yıkama kabına geri aktarın.Yıkamaya başlamak için bir mililitre PBS ekleyin. Çamaşır kabını ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın. Plakayı çalkalayıcıya aktarın ve beş dakika hafifçe sallayın.PBS'yi çıkarın ve tüm yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. STORM görüntülemeden hemen önce, metin protokolünde belirtildiği gibi bir mililitre görüntüleme arabelleği hazırlayın. Kapak kapağını yükleme odasına yükleyin.Siyanobakteriyel hücrelerin yıkanmasını önlemek için nazik olmak, taze hazırlanmış görüntüleme tampon ekleyin. Bundan sonra, havadaki oksijenle tepkimesini önlemek için görüntüleme tamponunun üzerine dikdörtgen bir kapak kaydırın. Kamerayı, LED ışığını ve lazeri açın ve STORM yazılımını açın.Lensin üzerine yarım damla daldırma yağı ekleyin. Objektif lensin kapak kayması ile temas yaptığından emin olmak için hazneyi yükleyin. Ve sinyali 750 nanometrelazerle inceleyin.Hem hücreleri hem de güvenilir işaretleri içeren bir örnek alan tanımlayın. Sonra örnek sürüklenen düzeltme için yazılım başlatın. 300'de kamera elektron çarpımı kazancı ve 30 milisaniyelik pozlama süresiyle referans olarak geniş dosyalanmış bir görüntü elde edin.750 nanometre uyarma lazer yoğunluğunu santimetre kare başına yaklaşık 4,5 kilowatt'a yükseltin. Florofore'ler seyrek yanıp sönen bir desene dönüştükten sonra, 33 hertz'de 10.000 kare toplayarak bir süper çözünürlüklü görüntü elde edin. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi ham verilerden süper çözünürlüklü görüntüleri yeniden oluşturun.Bu çalışmada, STORM stochastically bireysel fotoğraf değiştirilebilir floroforlar aktive ederek süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için kullanılır. Her floroforun konumu kaydedilir ve bu konumlara göre bir süper çözünürlüklü görüntü oluşturulur. Prochlorococcus'un emilim spektrumları 447 ve 680 nanometrede zirve yaparken ve minimum emilime 700 nanometrenin üzerinde yken, Prochlorococcus MED4 hücreleri STORM görüntüleme için gerekli olan 750 nanometrelazerin son derece yüksek yoğunluğuna maruz kaldığında hala yüksek otofloresans yakımını sağlar.Burada 30 dakika boyunca açıklanan fotobeyazrlama yöntemini kullandıktan sonra, otofloresansa sahip çeşitli hücreler hala tespit edilebilse de hücrelerin otofloresansının azaldığı görülmektedir. Fotobeyaztma işleminin 60 dakikaya uzaması, hücrelerin çoğunun otofloresansını kaybetmesine neden olur. Bu sonuçlar, geliştirilen fotobeyazlatma yönteminin fotosentetik organizmaların otofloresansını büyük ölçüde azaltabileceğini göstermektedir.Fotobeyaztma sonra, STORM hücrelerde hücre bölünmesi protein, FtsZ, görselleştirmek için kullanılır. STORM kullanılarak FtsZ halkasının ayrıntılı morfolojisi ortaya çıktı. 3D STORM görüntülerini döndürerek, dört farklı morfoloji türü, kümeler, tamamlanmamış bir halka, tam bir halka ve çift halka lar tanımlanmıştı.Bu ışık yoğunluğu ve fotobleach süresi farklı organizmalar için farklı olabilir hatırlamak önemlidir. Bu yöntem, geliştirildikten sonra fotosentetik hücrelerde protein organizasyonu ve potansiyel işlevini ayrıntılı olarak incelemek isteyen araştırmacıların önünü açıyor.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Kullanarak İzleme Dendritik Hücre Göç<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Manyetik Rezonans Görüntüleme

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Madstorm kullanarak T hücrelerinin çok yönlü, süper çözünürlüklü görüntüsü

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...