Name: orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad
Uploaded: 2019-01-20T13:00:00
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著者は中国の国家自然科学基金 (グラント号 81873111、81673924、81774039、81503517) を感謝したい北京自然科学財団 (グラント号 7172095、7162084、7162083) との北京病院の徐夏財団伝統的な中国医学 (付与なし、xx201701)。中国医学専攻、生物発光イメージの実験的研究センター、中国アカデミーの教授張鎮劉に感謝いたします。

動物実験規定および中国の実験動物管理法の一般的な推奨事項に従って実施され、動物医療の機関と使用首都医科大学委員会によって承認されました (Ref ないです。AEEI-2014-052)。6 〜 8 週間を高齢者女性の Balb/c マウスが使用されました。
1. 細胞や動物の準備
<ol><li>操作の前に 1 日は、動作領域を公開する 4 番目の乳首の周りの毛を剃る。<ol>
<li>マウスがないに自由に移...

<ol>
	<li>Torre, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics.">Global cancer statistics.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 65 (2), 87-108 (2012).</li><li>Rashid, O. M., Takabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+exploring+the+pharmacokinetics+of+breast+cancer+therapies.">Animal models for exploring the pharmacokinetics of breast cancer therapies.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism &amp; Toxicology. 11 (2), 221-230 (2015).</li><li>Wagner, K. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Yano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-targeting+adenovirus+OBP-401+inhibits+primary+and+metastatic+tumor+growth+of+triple-negative+breast+cancer+in+orthotopic+nude-mouse+models.">Tumor-targeting adenovirus OBP-401 inhibits primary and metastatic tumor growth of triple-negative breast cancer in orthotopic nude-mouse models.</a> Oncotarget. 7 (51), 85273-85282 (2016).</li><li>Kocaturk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth.">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).</li><li>Tavera-Mendoza, L. 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S., Lee, K. S., Chun, S. Y., Jang, T. J., Nam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressive+effects+of+a+proton+beam+on+tumor+growth+and+lung+metastasis+through+the+inhibition+of+metastatic+gene+expression+in+4T1+orthotopic+breast+cancer+model.">Suppressive effects of a proton beam on tumor growth and lung metastasis through the inhibition of metastatic gene expression in 4T1 orthotopic breast cancer model.</a> International Journal of Oncology. 49 (1), 336-342 (2016).</li><li>Kalra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+the+use+of+a+luciferase+labeled+breast+cancer+cell+line,+MDA435LCC6,+as+a+means+to+monitor+tumor+progression+and+to+assess+the+therapeutic+activity+of+an+established+anticancer+drug,+docetaxel+(Dt)+alone+or+in+combination+with+the+ILK+inhibitor,+QLT0267.">Validating the use of a luciferase labeled breast cancer cell line, MDA435LCC6, as a means to monitor tumor progression and to assess the therapeutic activity of an established anticancer drug, docetaxel (Dt) alone or in combination with the ILK inhibitor, QLT0267.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 11 (9), 826-838 (2011).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+metastatic+mouse+models+for+anticancer+drug+discovery+and+evaluation:+a+bridge+to+the+clinic.">Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic.</a> Investigational New Drugs. 17 (4), 343-359 (1999).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+orthotopic+xenografts:+better+mimic+of+metastasis+than+subcutaneous+xenografts.">Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 15, 451 (2015).</li></ol>

本研究で使用される細胞は 4T1-luc2 のための非常に侵略的性質2,19 薬剤の抗腫瘍および抗転移効果を投資のための有用なツールであるルシフェラーゼ付けマウスのトリプル ネガティブ乳がんの癌細胞.ルシフェラーゼ、携帯世代に安定を使用して示しますリビング腫瘍細胞、乳腺、その他の遠隔臓器20両方。いくつかのケースで低酸?...

乳がんは、世界中の女性の死亡率の主要な原因です。その徐々 に増加率で乳癌公衆衛生1深刻な課題となっています。マウス癌モデルの臨床および臨床研究の良い架け橋、良い模倣マウス疾患モデルが病気や薬に関する研究の精度を向上させます。
原発腫瘍の成長は、転移と合併症死と癌患者のほとんどで貧しい生活資質の主な原因では、悪性疾患の進行状況を開始します。いくつかのマウス モデルはひと乳癌癌2,3,4の病理学を模倣する使用されます。異種移植モデル用画面薬、病理学的文字を理解する癌研究のための安全性と有効性5,6,7。遺伝子組み換えマウス (宝石) は、特定の遺伝子または腫瘍のサプレッサー遺伝子8対象にひと乳癌を模倣するように生成されます。宝石癌進行の遺伝子の役割を理解する比較的単純な制服を着た背景があります。ただし、人工環境と背景が転移の病理学の調査に限られた治療9等。ひと癌細胞人間の病理学的機能とすることができますのみに注入される免疫不全マウスと腫瘍ホストの免疫の相互作用の不全が偏った結果10につながる可能性があります。
病気11,12,13の生物学的および病理学的文字に直接影響している固形腫瘍が開始されます。癌の進行状況は、腫瘍細胞、間質細胞、免疫細胞、炎症細胞、成長因子、およびプロテアーゼ間の相互作用の複雑な結果は、上皮内腫瘍移植よりよい洞察力を提供する、模倣、癌プロセスは化学薬品または皮下腫瘍による腫瘍よりもより正確に細胞します。腫瘍を誘発する化学薬品は、研究者や環境に有害な場合があり、さらにいくつかの国で禁止されます。乳腺の脂肪パッド環境の不在のため皮下注射の病理学的進行状況は、実際の乳がん患者でが、がん発生し、乳腺の脂肪パッドから刺激すると異なる場合があります。皮下注射の欠点は、腫瘍の成長を研究する直交異方性モデルの使用をお勧めします。以前の研究では、7 つの同所性同種移植後開発、転移性の高い MDA MB 231 腫瘍は、注入場所14の重要性を示されます。最近では、手術で乳腺脂肪パッドに乳癌細胞の同所性同種移植報告15,16歳だった。乳腺パッド環境、腫瘍成長と病理関連サイトで乳がんの遠隔臓器カバー全体のプロセスに移行、ミニチュアの人間の病気の進行状況をこのモデルになります。ただし、手術後皮膚は自動的に通常の乳房癌発生との干渉の潜在的なリスクをもたらす可能性があります、結果をバイアス自体を癒すためにされます。
いくつかの乳房癌モデルを比較し、乳房癌進行17,18日薬の潜在的な影響を調査するための低侵襲の実験モデルを確立しました。この研究では、がんについてビデオ プロトコル シンプルで乳腺の脂肪パッドに乳癌細胞を注入、少ない侵襲的方法を提示します。手術をせずこの同所性同種注入法は多くの方法で有利であります。まず、操作が簡便・迅速なマウス当たり約 1 分です。第二に、原発巣は右病理学的サイトから始まる、全体性を研究するため実験動物モデルの良いを提供しています他の臓器転移腫瘍の成長から乳癌進行過程をカバー、腫瘍細胞と腫瘍微小環境との相互作用。その上、乳房癌のすべての段階で治療の効果を推定するための貴重なモデルをすることができますそれ。このメソッドの目的は、キャビンの模倣ひと乳癌進行する動物モデルを提供することです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:652px;" width="653">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:49px;width:149px;">anesthesia machine</td>
			<td style="width:235px;">Midmark Corporation, Dayton, OH, USA</td>
			<td style="width:96px;">Matrx VMS</td>
			<td style="width:172px;">anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:149px;">In-Vivo Imaging System</td>
			<td style="width:235px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:96px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:172px;">used for bioluminescence detecion</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:149px;">&#160;isoflurane</td>
			<td style="width:235px;">Hebei yipin chemical reagents&#160; company</td>
			<td style="width:96px;">O21400</td>
			<td style="width:172px;">anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:235px;">Becton,Dickinson and&#160; Company</td>
			<td style="width:96px;">A257</td>
			<td style="width:172px;">cell injection</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:49px;width:149px;">digital caliper</td>
			<td style="width:235px;">Shang Hai Shen Han Measuring Tools Co., Ltd.</td>
			<td style="width:96px;">S-H</td>
			<td style="width:172px;">volume measurement</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">tramadol</td>
			<td style="width:235px;">Mundipharma company</td>
			<td style="width:96px;">-</td>
			<td style="width:172px;">pain killer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">D-luciferin</td>
			<td style="width:235px;">Gold Biotechnology Inc.</td>
			<td style="width:96px;">LUCK-1G</td>
			<td style="width:172px;">used for bioluminescence detecion</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:52px;width:149px;">The primary antibody against cluster of differentiation (CD) 31</td>
			<td style="width:235px;">Abcam</td>
			<td style="width:96px;">&#160;ab28364</td>
			<td style="width:172px;">used for MVD detection</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:149px;">hematoxylin and eosin staining kit</td>
			<td style="width:235px;">&#160;Beijing Zhong Shan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td style="width:96px;">ZLI-9615</td>
			<td style="width:172px;">histology&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:149px;">hair removal cream</td>
			<td style="width:235px;">Veet</td>
			<td style="width:96px;">-</td>
			<td style="width:172px;">hair removal cream</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:149px;">Carbomer Eye Gel</td>
			<td style="width:235px;">Dr.GerhardMannChem-Pharm.FabrikGmbH</td>
			<td style="width:96px;">-</td>
			<td style="width:172px;">ophthalmic ointment</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;">sewing needle</td>
			<td style="width:235px;">Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.&#160;</td>
			<td>17U0302J</td>
			<td style="width:172px;">suture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad

適切な動物モデルは、疾患の理解を深めるために重要です。動物(皮下注射、異種移植片、遺伝子操作、化学試薬誘導等)別の方法で確立されたモデルは、様々 な病的な文字の特定の側面の調査に重要な役割を果たす病気。単一のモデル模倣することが全くない全体の人間の病気の進行、病気を理解し、潜在的な薬剤のスクリーニングでかけがえのない役割を果たす適切な間質環境と同所性同種臓器疾患モデル。この記事では単純なより少ない侵襲型とハンドル簡単方法で乳腺の脂肪パッドに乳がん細胞を注入し、遠隔臓器に転移に従う方法をについて説明します。原発腫瘍の成長、乳房と乳首の病理学的変化の適切な機能と他の臓器の転移の頻度が高い、このモデルのキャビンはひと乳癌進行を模倣します。原発腫瘍の成長その場観察、長い遠隔転移、乳癌の腫瘍微小環境は、このモデルを使用して調べることができます。

成功した注入として乳首の 1 つ白い透明フラット球後、外表面のラウンド センター (図 1) を観察することができます。腫瘍容積と生きている腫瘍で原発腫瘍の成長を測定ことができるセルの発光 (図 2)。腫瘍体積と全光束は、切除前に実験中に増加。初期段階で二次腫瘍はなかったがあったり、原発腫瘍の強力な発光信号?...

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ここでは、侵襲性、ハンドル簡単方法は、以下の単純な乳腺の脂肪パッドに乳がん細胞を注入するためのプロトコルを提案して適切な乳腺脂肪パッド環境とこのマウス実験乳房のがんモデルはの様々 な側面を調査する使用ことができます。がん。

マウス乳腺の脂肪パッドに乳癌細胞の同所性同種注入

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

この方法は、微小環境が腫瘍の成長をどのようにサポートするか、または特定の薬物が乳癌の進行を効果的に阻害できるかどうかについて、がん分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。腫瘍誘導技術の主な利点は、手術が必要なく、その場で乳癌を確立するための侵襲性の低い方法であるということです。この技術を用いて、腫瘍細胞は乳腺脂肪パッド内で増殖し、適切な組織環境において、マウス細胞への皮下注射または異種移植よりもヒト乳癌の進行をより密接に模倣する。技術者のKe-Xin Caoと私は、この手順をデモンストレーションする際に、ガンリン・ザンを支援します。手術の前日に、手動でレシピエントマウスを拘束し、動物の腹側を毛皮に向けて4番目の乳首の周りに剃ります。脱毛クリームの薄い層で毛皮を拭きます。蒸留水を使用して30〜60秒後にクリームを取り除き、柔らかいペーパータオルでマウスを乾かします。手術当日、マウス乳癌細胞懸濁液を、PBS濃度のミリリットル当たり5番目の細胞を氷上の滅菌マイクロ遠心分離管で20倍から5番目の細胞に希釈する。各注射の前に、1つのマウスにつき50マイクロリットルの細胞を備えた1ミリリットルの注射器を45%16針で装着した。そして、各鎮静動物のつま先ピンチに対する応答の欠如を確認してください。動物の目に軟膏を塗布し、ピンセットを使用して最初のマウスの4番目の乳首の周りに皮膚をテントに入れ、シリンジが従うトンネルを作ります。ベベルを上向きにして注射器を持ち、針先が乳首に届きそうになるまでトンネルに続いて、乳首から5〜10ミリメートルで皮に皮を皮下に入ります。ピンセットを使用して最初の乳首の周りの皮膚をテントに入れるので、注射器が続くトンネルが作られます。針はピンシーツチップの間に入る必要があり、組織に落ち込むのではなく上げる必要があります。ベベルが乳首の下になるまで針の先端を乳腺脂肪パッドに慎重に上げ、皮膚テントを離して癌細胞のゆっくりとした注射を可能にする。挿入時に、ベベルが乳首の下になるまで慎重に針先を乳腺脂肪パッドに上に移動します。そして、あなたは正しい場所に細胞の配信を確実にするために抵抗を感じるでしょう。すべての細胞が注入されたら、針を少し横に回し、注射器をゆっくりと引き込みます。綿棒を使用して針の傷口に10〜20秒間圧力をかけ、流体の浸透をなくします。注入されたニップルは、中央に乳首を持つ透明、白、平らな球として表示される必要があります。腫瘍の容積を確立するには、マウス腹側を拘束し、キャリパーを使用して腫瘍の長さと幅を測定する。腫瘍の生物発光を捕捉するために、画像化の10分前にマウスの首の後ろに1キログラム当たり150ミリグラムのD-ルシフェリンを注入する。そして、適切な生物発光イメージングパラメータの下で原発腫瘍および転移の生物発光画像を捕捉する。適切な実験時点で、はさみを使用して皮膚から腫瘍を収穫する。そして、手術後の痛みを和らげるために、鎮痛液を外科部位に塗布する。その後、標準的なプロトコルに従って外科縫合糸で皮膚を閉じます。完全な回復まで監視と温暖化ランプの下で動物が回復することを許可します。メスを使って原発腫瘍を2つの等しい部分に切り分けます。その後のヘマトキシリンおよびエオシン染色および免疫組織化学のために、組織の半分を4%パラホルムアルデヒドに保存する。残りの半分を液体窒素で凍結し、ウェスタンブロッティングまたはRNAi分離を行います。適切な実験エンドポイントでは、標準的な解剖プロトコルに従って肺を収穫し、PBSで臓器を洗浄する。その後、4%パラホルムアルデヒドで肺を固定し、ヘマトキシリンとエオシン染色による転移を確認します。原発性腫瘍の増殖は、実証されるように、腫瘍量および生細胞生物発光によって測定することができる。転移は、二次腫瘍が確立されていないか、または原発性腫瘍の強い生物発光シグナルが弱いシグナルを有する小さな転移性病巣の検出を妨げるかのいずれかとして、接種の初期段階では観察されない。切除後、遠くの器官の転移性病巣からの生物発光シグナルを検出し、分析することができる。ヘマトキシリンおよびエオシン染色による原発性乳房腫瘍および肺切片の両方の形態の分析は、抗CD31マイクロ血管マーカー染色によって証明されるように腫瘍細胞接種動物における血管新生の増加を明らかにする。この手順を試みる場合は、腫瘍細胞を送達する前に針先が正しい位置にあることを覚えておくことが重要です。この手順に従って、アトマイザーは、動物の超音波のような、生体内の原発性腫瘍の膀胱補充に関する追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、腫瘍形成の分野の研究者のための道を開き、マウス動物モデルにおける腫瘍形成に関与する重要な要因と経路および抗癌薬のメカニズムを探求する薬の開発。isofluraneまたは他のガス麻酔での作業は、非常に投与が困難であり、活性炭マスクを使用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行しながら取られるべきであることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures (Video) | JoVE 

癌細胞スフェロイド培養における潜在的に新規薬剤標的を同定するためのスクリーニング機能ゲノミクスを利用

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer (Video) | JoVE 

乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish (Video) | JoVE 

胚ゼブラフィッシュにおけるヒト乳癌細胞の浸潤挙動

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal (Video) | JoVE 

アポトーシス反転後新しく形成された乳癌幹細胞様細胞の流れフローサイトメトリー法による検出

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland (Video) | JoVE 

マウス乳腺へのクレオンゲンデノウイルスの誘導注射による乳癌のモデル化

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model (Video) | JoVE 

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad (Video) | JoVE 

間肩甲膜白脂肪パッドへのラット乳腺上皮細胞移植

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer (Video) | JoVE 

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells (Video) | JoVE 

炎症性乳癌細胞の尾静脈注射による脳転移のモデル化

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research (Video) | JoVE 

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...