Name: quasi-metagenomic analysis of salmonella from food and environmental samples
Uploaded: 2018-10-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples at JoVE.com

المؤلف يود أن يشكر مارك هاريسون وهيرش جوين من جامعة جورجيا لتقديم يرجى الضغط البكتيرية وغيرها من أشكال الدعم لهذه الدراسة.

1. إعداد نموذج
ملاحظة: تعد العينات الغذائية لتخصيب اليورانيوم قبل وفقا لدليل مختبر الميكروبيولوجيا (MLG) من "الإدارة الأميركية لسلامة الأغذية الزراعة" و "دائرة التفتيش" (وزارة الزراعة-فوزية)11 ودليل التحليل البكتريولوجي (BAM) من "الولايات المتحدة للأغذية" و المخدرات ا...

<ol>
	<li>Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercially+Available+Rapid+Methods+for+Detection+of+Selected+Food-borne+Pathogens.">Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).</li><li>Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+metagenomic+sequencing+to+food+safety:+detection+of+Shiga+Toxin-producing+Escherichia+coli+on+fresh+bagged+spinach.">Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).</li><li>Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-Level+Discrimination+of+Shiga+Toxin-Producing+Escherichia+coli+in+Spinach+Using+Metagenomic+Sequencing.">Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing.</a> PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).</li><li>Hyeon, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-metagenomics+and+realtime+sequencing+aided+detection+and+subtyping+of+Salmonella+enterica+from+food+samples.">Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Hyeon, J. Y., Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Salmonella+in+raw+chicken+breast+using+real-time+PCR+combined+with+immunomagnetic+separation+and+whole+genome+amplification.">Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification.</a> Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).</li><li>Hosono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+whole-genome+amplification+directly+from+clinical+samples.">Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples.</a> Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).</li><li>Seth-Smith, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture.">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).</li><li>Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., Hammack, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methods+to+prepare+samples+of+leafy+green+vegetables+for+preenrichment+with+the+Bacteriological+Analytical+Manual+Salmonella+culture+method.">Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method.</a> Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).</li><li>Jacobson, A. P., Hammack, T. S., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+the+isolation+of+Salmonella+from+alfalfa+and+mung+bean+seeds+with+the+Bacteriological+Analytical+Manual's+Salmonella+culture+method.">Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method.</a> Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).</li><li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+subtyping+methods+against+a+whole-genome-sequencing+standard+for+Salmonella+enterica+serotype+Enteritidis.">Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).</li><li>. Microbiology Laboratory Guidebook Available from: <a target="_blank" href="https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook">https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook</a> (2018)</li><li>. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm">https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm</a> (2018)</li><li>Malorny, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+real-time+PCR+for+detection+of+Salmonella+in+food.">Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).</li><li>June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+effectiveness+of+selenite+cystine+broth,+tetrathionate+broth,+and+Rappaport-Vassiliadis+medium+for+the+recovery+of+Salmonella+from+raw+flesh+and+other+highly+contaminated+foods:+precollaborative+study.">Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study.</a> Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).</li><li>Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+effectiveness+of+selenite+cystine+broth,+tetrathionate+broth,+and+Rappaport-Vassiliadis+medium+for+the+recovery+of+Salmonella+spp.+from+foods+with+a+low+microbial+load.">Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load.</a> Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).</li><li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kraken:+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments.">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).</li><li>Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFSAN+SNP+Pipeline:+an+automated+method+for+constructing+SNP+matrices+from+next-generation+sequence+data.">CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data.</a> PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+serotype+determination+utilizing+high-throughput+genome+sequencing+data.">Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).</li><li>Rodrigue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+amplification+and+de+novo+assembly+of+single+bacterial+cells.">Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells.</a> PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).</li><li>Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Perspectives+on+Viable+but+Non-Culturable+(VBNC)+Pathogenic+Bacteria.">Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria.</a> Front Public Health. 2, 103 (2014).</li></ol>

بسبب وفرة منخفضة كثيرا ومتجانسة في وجود السالمونيلا في الغذاء والعينات البيئية، إثراء الثقافة أمام جمعية نجمة داود الحمراء--نظام الرصد الدولي ما زال ضروريا للكشف عن السالمونيلا و subtyping؛ ولذلك خطوة حاسمة للبروتوكول. تحديد الشروط المثلى لزيادة الوفرة من السالمونيلا بالنسبة ...

نظرياً يسمح تسلسل Metagenomics كشف متضافرة و subtyping من مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية. ومع ذلك، عينات المواد الغذائية تحديات لتحليل العوامل الممرضة حسب التسلسل مباشرة من ميكروبيومي الغذائية. أولاً، مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية غالباً ما تكون الحالي عند مستويات منخفضة في عينات المواد الغذائية. تتطلب معظم الأساليب المتاحة تجارياً الكشف السريع لا يزال ح 8 – 48 استزراع لإثراء الممرض الخلايا إلى مستوى الاكتشاف1. ثانيا، الكثير من الأطعمة تحتوي على خلايا النبت وفيرة و/أو الطعام الحمض النووي، مما يجعل DNA مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية نسبة ضئيلة من المواد الغذائية ميتاجينومي وهدفا بعيد المنال عن الكشف و subtyping مباشرة التسلسل الجينومية.
تم الإبلاغ عن تعديل للمواد الغذائية ميكروبيوميس السماح بتركيز كبير من مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية الحمض النووي لتسهيل الكشف على أساس تسلسل شيغا السمية المنتجة الإشريكيّة القولونية2،3 و انتيريكا السالمونيلا4. نظراً لأن تعديل المواد الغذائية ميكروبيوميس لا يزال مخاليط أنواع الميكروبية المختلفة، ويطلق على تسلسل شبه الجينومية تحليل4. يمكن إجراء تعديل ميكروبيومي بإثراء الثقافة وحدها2،3 ، أو في تركيبة مع فصل إيمونوماجنيتيك (IMS) ومتعددة التشرد التضخيم (MDA)4،5. يمكن التقاط نظام الرصد الدولي بشكل انتقائي خلايا الممرض من ثقافة الإثراء عن طريق الخرز المغناطيسي المغلفة بالأجسام المضادة. نجمة داود الحمراء يمكن أن تولد كميات كافية من الحمض النووي للتسلسل عن طريق بوليميراز الدنا ɸ29 ذات كفاءة عالية6. نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء أتاح كشف الممرض ثقافة مستقلة من7من العينات السريرية، وتقصير لإثراء الثقافة لكشف شبه الجينومية و subtyping السالمونيلا في الغذاء عينات4.
والهدف العام لهذا الأسلوب إعداد شبه ميتاجينوميك الحمض النووي من عينات الأغذية للسماح بتركيز المستهدفة السالمونيلا المجينية الحمض النووي والكشف عن اللاحقة و subtyping الملوث السالمونيلا بالتسلسل. مقارنة بالأساليب القياسية للكشف عن السالمونيلا 8،9 subtyping10، ونهج كواسيميتاجينوميك يمكن اختصار إلى حد كبير الزمنية اللازمة من الأغذية الملوثة، والعينات البيئية إلى الأنواع الفرعية الجزيئية لمسببات المرض بتوحيد البلدين عادة فصل التحليلات إلى سير عمل واحد. هذا الأسلوب مفيد بشكل خاص للتطبيقات مثل الاستجابة لمقتضيات الفاشية المنقولة وأخرى تتبع التحقيقات مرة أخرى حيث subtyping الممرض قوية مطلوب بالإضافة إلى الكشف عن العوامل الممرضة والتداول التحليلية السريع المهم.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Laboratory blender bag w/filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10048-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered peptone water</td>
			<td>Oxoid Micorbiology Products</td>
			<td>CM0509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rappaport Vassiliadis broth</td>
			<td>Neogen Acumedia</td>
			<td>7730A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stomacher blender</td>
			<td>Seward&#160;</td>
			<td>30010108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75005194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Techne Prime</td>
			<td>EW-93945-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Real-Time Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4.76357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>PCR purification beads; mix well before use; store at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT library prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Store at -80C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinIon library prep kit</td>
			<td>Oxford Nanopore</td>
			<td>SQK-LSK108</td>
			<td>Store at -80C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabead Anti-Salmonella beads</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>71002</td>
			<td>Vortex well prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) 
			-Sample buffer 
			-Reaction buffer 
			-Enzyme mix</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>25-6600-30</td>
			<td>Store at -80C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15920D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR mastermix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4304437</td>
			<td>Mix well before use; store at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quasi-metagenomic analysis of salmonella from food and environmental samples

التسلسل ظاهرياً-ميتاجينوميكس يشير إلى تحليل على أساس التسلسل ميكروبيوميس المعدلة للغذاء والعينات البيئية. ويهدف تعديل ميكروبيومي في هذا البروتوكول، تركيز الحمض النووي من ملوث مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية المستهدفة تيسير الكشف عن و subtyping من مسببات المرض في سير عمل واحد. نشرح هنا، وإظهار خطوات إعداد نموذج لتحليل شبه ميتاجينوميكس انتيريكا السالمونيلا من التمثيل الغذائي والعينات البيئية بما في ذلك براعم البرسيم، فلفل أسود مطحون، الأرض لحوم البقر، الدجاج الثدي ومسحات البيئية. وتخضع عينات أولاً في إثراء الثقافة السالمونيلا لمدة أقصر وقابل للتعديل (ح 4 – 24). ثم بشكل انتقائي خلايا السالمونيلا يتم التقاطها من ثقافة الإثراء بفصل إيمونوماجنيتيك (IMS). وأخيراً، يتم التضخيم التشرد متعددة (MDA) لتضخيم الحمض النووي من الخلايا التي تم الاستيلاء عليها نظام الرصد الدولي. يمكن تسلسل إخراج الحمض النووي لهذا البروتوكول بمنصات تسلسل إنتاجية عالية. يمكن إجراء تحليل PCR كمي اختياري لاستبدال تسلسل للكشف عن السالمونيلا أو تقييم تركيز السالمونيلا الحمض النووي قبل التسلسل.

قبل التسلسل كواسيميتاجينوميك، يمكن تقييم مجمل كمية ونقاء المنتجات نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء التي فلوروسبيكتروميتير (الجدول 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>وقت التخصيب (ح)</td>
			<td>قيمة الأشعة ال...

Watch this Scientific Journal Video about Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples at JoVE.com

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

تحليل شبه الجينومية السالمونيلا من غذاء والعينات البيئية

نقدم هنا، وضع بروتوكول لإعداد عينات من الحمض النووي من المواد الغذائية والبيئية ميكروبيوميس لكشف متضافرة و subtyping السالمونيلا عن طريق التسلسل كواسيميتاجينوميك. الاستخدام المشترك لإثراء الثقافة والفصل إيمونوماجنيتيك (IMS) والتشرد متعددة يسمح التضخيم (MDA) فعالية تركيز الحمض النووي السالمونيلا من غذاء والعينات البيئية.

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

ويمكن استخدام هذه الطريقة للكشف عن السالمونيلا من عينات الطعام وتحديد الممرض إلى مستوى السلالة من خلال البصمات الجينية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يجمع بين اكتشاف السالمونيلا و subtyping في سير عمل واحد ويقصر بشكل كبير الوقت من تحول عينة الطعام الملوثة السالمونيلا لبصمات أصابع الممرض. للبدء، ضع بشكل مُهكَم عينة 25 غرامًا من الطعام داخل كيس خلاط مختبر معقمة مع فلتر مدمج أو أعد مسحة بيئية اختياريًا عن طريق ترطيب اسفنجة مع مرق الإثراء، وسحبها عبر سطح محدد مسبقًا ووضعها داخل كيس الخلاط.باستخدام خلاط مختبر، اخلط كل عينة بدقة مع 225 ملليلتر من مرق إثراء RV. ثم احتضان الخليط في 42 درجة مئوية لمدة أربع إلى 21 ساعة. بعد ذلك، جمع 50 ملليلتر subsample من مرق إثراء من الجانب تمت تصفيتها من الحقيبة.ثم الطرد المركزي على سبيل المثال الفرعي في 100 مرة ز لمدة 10 دقائق. نقل بعناية فائقة إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر الطرد المركزي والطرد المركزي في 3،000 إلى 6،000 مرات ز لمدة 10 دقائق. تجاهل عظمى وغسل بيليه في خمسة ملليلتر من BPW.Resuspend بيليه في خمسة ملليلتر من BPW. أولاً، ذاب المخزن المؤقت العينة ومخزن التفاعل من عدة MDA على الجليد. ضع ملليلتر واحد من الخلايا التي يتم تعليقها في BPW و 20 ميكرولترات من الخرز المضاد لسالمونيلا في أنبوب microcentrifuge.ضع أنبوب microcentrifuge على خلاط دوار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لمدة ثلاث دقائق. عكس رف المغناطيسي عدة مرات لتركيز الخرز في بيليه.الحفاظ على أنبوب على رف المغناطيسي، وpirate وتجاهل ناضح. بعد ذلك، إضافة ملليلتر واحد من مخزن الغسيل إلى الأنبوب. إزالة حامل أنبوب من الرف وعكس حامل أنبوب عدة مرات لإزالة أي بكتيريا غير ملزمة خصيصا من المجمع.بعد الغسيل الثالث ، يُشعّر المُنطَع من الأنبوب ويتخلص منه. ثم إزالة أنبوب من الرف المغناطيسي والطرد المركزي لثانية واحدة. ثم ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي لمدة ثلاث دقائق قبل إزالة أي عازلة الغسيل المتبقية.Resuspend المجمعات السالمونيلا حبة في تسعة ميكرولترات من عينة العازلة واحتضان الأنبوب في 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد تبريد المجمعات على الجليد، إضافة تسعة ميكرولترات من العازلة رد فعل وميكر واحد من مزيج انزيم. احتضان الأنبوب في دورة حرارية وفقا لبروتوكول النص وتبريد الأنبوب على الجليد.بعد ذلك، استخدم جهاز الفلوروسم وبيكترومتر لقياس تركيز الحمض النووي ونقاء العينة. تخزين المنتجات النهائية في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية للتجارب المستقبلية. إعداد 18 ميكرولترات من خليط PCR لكل عينة وفقا لبروتوكول النص.ثم اخلطي منتج MDA عن طريق الخفقان بلطف لأعلى ولون. إضافة اثنين microliters من تعليق المنتج MDA إلى خليط PCR. باستخدام بروتوكول PCR في الوقت الحقيقي الأمثل، قم بتشغيل PCR في الوقت الحقيقي وفقًا لبروتوكول النص.إضافة حلول العازلة والكواشف إلى المنتج MDA كما هو محدد في بروتوكول النص ونقل الناتجة 40 microliters من المنتج MDA تسلسل تستعد إلى لوحة جديدة وإضافة 20 ميكرولترات من الخرز تنقية PCR إلى كل بئر. بعد ذلك، احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. ثم غسل الخرز مع 80٪ الإيثانول وتجفيفها لمدة 12 دقيقة.Resuspend الخرز المجفف في 53 ميكرولترات من العازلة resuspension واحتضان الخرز لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، تمييع والمكتبات تجمع وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وفي هذا البروتوكول، تم إجراء تقييم كمية مستهدفة للحمض النووي السالمونيلا بواسطة PCR في الوقت الحقيقي.وتراوحت النتائج التمثيلية لعلامتين من صدور الدجاج الملوثة بالسلمونيلا بين 701.54 إلى 945.86 نانوغرام لكل ميكرولتر مما يشير إلى أن عينة الحمض النووي تم تضخيمها بشكل فعال. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن يغسل والتعامل مع الخرز IMS بعناية، والحفاظ على الكواشف MDA والمنتجات خالية من الملوثات والحفاظ على غطاء محرك السيارة نظيفة. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال سلامة الأغذية والصحة العامة لاستكشاف التتبع السريع والعالي الدقة لملوثات السالمونيلا في عينات الأغذية وبيئات المنتجات وسلاسل التوريد.لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض المنقولة بالأغذية يمكن أن يكون خطيرا للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية واتباع الممارسات المختبرية الجيدة عند تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Biology

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

تحليل الجينات من المجتمعات الميكروبية البحرية باستخدام Transcriptomics البيئية

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage ...

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

مزمن السالمونيلا نموذج الفأر المصاب

The bacterial infected mouse model is a powerful model system for studying areas such as infection, inflammation, immunology, signal transduction, and ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

عالية الإنتاجية قياس وتصنيف ف العضوية في العينات البيئية

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

خطوة واحدة تنقية البروتينات التوأم بكتيريا الموسومة ومجمعات منها على بكتيريا-Tactin الراتنج عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

تحليل Phosphopeptide من القوارض بربخي المني

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

تحديد الأحماض السياليك في الكبد وعينات الحليب من البرية من نوع و<em&gt; CMAH</em&gt; خروج المغلوب الفئران.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

بروتوكول مختبر لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية ماكروينفيرتيبراتيس المائية استخدام مجموعة محددة المتاشب كبسولة تفجير

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

تحليل دقيق والفائق للنمو البكتيري

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

ليزر التقاط ميكروديسيكشن من ميشوورك ترابيكولار نقية جداً من عيون الماوس لتحليل التعبير الجيني

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

التحقيق الإنبات تيليوسبوري باستخدام تحليل ميكروريسبيريشن وميكروديسيكشن

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...