Name: optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af Merck investigator Studies program (#54843), en KAKENHI-støtte til videnskabelig forskning i innovative områder, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.), og en KAKENHI-støtte til sonderende forskning i innovative områder (T.S.) (18H02595).

Alle eksperimenter her blev godkendt af dyret eksperiment og brug komité af universitetet i Tsukuba, der opfylder NIH retningslinjer.
1. dyre kirurgi, virus indsprøjtning, elektrode til EEG/EMG og optisk fiber implantation
Forsigtig: Der bør vælges passende beskyttelses-og håndteringsteknikker baseret på biosikkerheds niveauet for den virus, som skal anvendes. AAV skal anvendes i et isoleret P1A klassificeret rum til injektion, og røret...

<ol>
	<li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder:+Secondary+symptom+or+core+feature?.">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?.</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li><li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity.">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li><li>Mellman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+anxiety+disorders.">Sleep and anxiety disorders.</a> Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).</li><li>Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuitry+of+wakefulness+and+sleep.">Neural circuitry of wakefulness and sleep.</a> Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).</li><li>Chemelli, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Narcolepsy+in+orexin+knockout+mice:+Molecular+genetics+of+sleep+regulation.">Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation.</a> Cell. 98 (4), 437-451 (1999).</li><li>Borb&#233;ly, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two-process+model+of+sleep+regulation:+A+reappraisal.">The two-process model of sleep regulation: A reappraisal.</a> Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).</li><li>Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+human+sleep:+recovery+process+gated+by+a+circadian+pacemaker.">Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).</li><li>Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic,+circadian,+and+emotional+regulation+of+sleep.">Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep.</a> Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).</li><li>Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+state+switching.">Sleep state switching.</a> Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).</li><li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li><li>Tovote, P., Fadok, J. P., L&#252;thi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuits+for+fear+and+anxiety.">Neuronal circuits for fear and anxiety.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).</li><li>Lebow, M. A., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overshadowed+by+the+amygdala:+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+emerges+as+key+to+psychiatric+disorders.">Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders.</a> Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+and+proliferation+of+intermediate+progenitors+of+GABAergic+neurons+in+the+mouse+telencephalon.">Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon.</a> Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+light+on+wakefulness+and+arousal.">Shining light on wakefulness and arousal.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).</li><li>Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+hypocretin-mediated+sleep-to-wake+transitions.">Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).</li><li>Weber, F., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit-based+interrogation+of+sleep+control.">Circuit-based interrogation of sleep control.</a> Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).</li><li>Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+REM+sleep+by+ventral+medulla+GABAergic+neurons.">Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons.</a> Nature. 526, 435-438 (2015).</li><li>Oishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-wave+sleep+is+controlled+by+a+subset+of+nucleus+accumbens+core+neurons+in+mice.">Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).</li><li>Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optogenetics+with+complementary+methodologies+in+systems+neuroscience.">Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).</li><li>Saito, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+in+the+preoptic+area+send+direct+inhibitory+projections+to+orexin+neurons.">GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li><li>Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+GABAergic+neurons+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+triggers+immediate+transition+from+non-rapid+eye+movement+sleep+to+wakefulness+in+mice.">Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice.</a> Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).</li><li>Lin, F., Pichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+neurons:+tools,+applications,+and+experimental+constraints.">Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints.</a> Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O&#8217;Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li></ol>

Vi her præsenterede en metode til at evaluere effekten af optogenetisk stimulering af neuroner med særlige kemiske identiteter på tilstandsovergange af søvn/vågenhed og gav et eksempel på manipulation af GABABnst neuroner. Vores data viste, at optogenetisk excitation af GABABnst neuroner resulterer i umiddelbar overgang fra NREM søvn til vågenhed.
Forskellige eksperimentelle designs er tilgængelige på grund af udviklingen af talrige typer af optogenetiske værkt...

Søvn er afgørende for optimal kognitiv funktion. Nylige fund tyder også på, at søvnforstyrrelser er forbundet med en lang række sygdomme1,2,3. Selv om funktionerne i søvn er endnu stort set uløste, er der gjort betydelige fremskridt for nylig i forståelsen af neurale kredsløb og mekanismer, der styrer søvn/vågenhed stater4. I pattedyr, der er tre tilstande af årvågenhed: vågenhed, ikke-hurtig øjenbevægelse (NREM) søvn, og hurtig øjenbevægelse (REM) søvn. Vågenhed er karakteriseret ved hurtige EEG svingninger (5-12 Hz) af lav amplitude med målbevidst og vedvarende motorisk aktivitet. NREM Sleep er defineret ved langsomme svingninger (1-4 Hz) af høj amplitude (Delta bølger), med manglende bevidsthed og målbevidst motorisk aktivitet. REM søvn er karakteriseret ved relativt hurtige svingninger (6-12 Hz) af lav amplitude og næsten komplet bilateral muskel atoni5.
Borbely foreslog en teori om søvn-vågenhed forordning kendt som de to procesmodel6,7. En homeostatisk proces, også kaldet proces S, repræsenterer søvn tryk, der akkumuleres under vågenhed og spredes under søvn. En anden proces, kaldet proces C, er en cirkadisk proces, hvilket forklarer, hvorfor årvågenhed niveauer svinger i 24 h cyklus. Ud over disse to processer, allostatic faktorer er også vigtigt for regulering af søvn/vågenhed8,9. Allostatiske faktorer omfatter ernæringsmæssige tilstande og følelser. Frygt og angst er normalt ledsaget af en stigning i ophidselse sammen med autonome og neuroendokrine svar10,11,12. Det limbiske system menes at spille en rolle i reguleringen af frygt og angst, og mekanismer underliggende autonome og neuroendokrine reaktioner er blevet undersøgt udførligt, men den vej, hvormed det limbiske system påvirker søvn/vågenhed stater har ikke endnu ikke blevet afsløret. Et stort antal nylige undersøgelser ved hjælp af opto-og farmakogenetik har antydet, at neuroner og neuronal kredsløb, der regulerer søvn/vågenhed stater er fordelt i hele hjernen, herunder cortices, basal forhjernen, thalamus, hypothalamus, og hjernestammen. Især har de seneste fremskridt inden for optogenetik gjort det muligt for os at stimulere eller hæmme specifikke neurale kredsløb in vivo med høje rumlige og tidsmæssige opløsninger. Denne teknik vil give fremskridt i vores forståelse af de neurale substrater af søvn og vågenhed, og hvordan søvn/vågenhed stater er reguleret af døgnrytmen processer, søvn tryk, og allostatiske faktorer, herunder følelser. Dette papir har til formål at introducere, hvordan man bruger optogenetisk manipulation kombineret med søvn/Wake optagelse, som kunne have potentialet til at opdatere vores forståelse af de connectomes og mekanismer i hjernen, der spiller en rolle i reguleringen af NREM søvn, REM søvn, og vågenhed. Forståelse af denne mekanisme, hvormed limbiske systemet regulerer søvn/vågenhed stater er af afgørende betydning for sundhed, fordi søvnløshed er normalt forbundet med angst eller frygt for at være i stand til at sove (somniphobia).
BNST menes at spille en væsentlig rolle i angst og frygt. Gad 67-udtrykker GABAergic neuroner er en stor population af bnst12,13. Vi undersøgte effekten af optogenetisk manipulation af disse neuroner (GABABnst) på søvn/vågenhed stater. En af de største fremskridt inden for neurovidenskab i de seneste år har været metoder, der muliggør manipulation af neuroner med særlige kemiske identiteter in vivo, med høje rumlige og tidsmæssige resolutioner. Optogenetics er meget nyttigt for at demonstrere årsagssammenhæng mellem neurale aktivitet og specifikke adfærdsmæssige responser14. Vi beskriver optogenetics som en metode til at undersøge den funktionelle konnektivitet af definerede neurale kredsløb i reguleringen af søvn/vågenhed stater. Ved at udnytte denne teknik, er store fremskridt opnået i forståelsen af neuronal kredsløb, der regulerer søvn/vågenhed stater15,16,17,18,19 . I mange tilfælde introduceres opsynder specifikt i neuroner med særlige kemiske identiteter i selektive hjerneområder ved en kombination af CRE-driver-mus og CRE-inducerbar AAV-medieret genoverførsel. Yderligere, fokal ekspression af foto-følsomme opsynder såsom channelrhodopsin 2 (ChR2)20 eller archaerhodopsin (archt)21 kombineret med en CRE-Loxp eller FLP-FRT system giver os mulighed for at manipulere en selektiv neuronal population og specifikke neurale pathway22.
Vi beskriver her eksperimenter på GABAergic neuroner i BNST som et eksempel. For at udtrykke opsynder i en udpeget neuronal population, passende CRE driver mus og CRE-afhængige virus vektorer anvendes hyppigst. Transgene eller Knock-in linjer, hvor opsynder er udtrykt i særlige neuronal populationer er også nyttige. I de følgende eksperimenter, brugte vi GAD67-CRE Knock-in mus23 , hvor kun GABAergic neuroner Express CRE rekombinase med en C57BL/6j genetisk baggrund, og en AAV vektor, som indeholder ChR2 (hChR2 H134R) smeltet med eyfp eller eyfp som en kontrol med en "FLEx (flip-excision) switch"24. Proceduren beskriver specifikt optogenetisk excitation af GABAergic neuroner i BNST under overvågning af søvn/vågenhed stater25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1180px;" width="1180">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">1x1 Fiber-optic Rotary Joints</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td style="width:177px;">FRJ 1x1 FC-FC</td>
			<td style="width:437px;">for optogenetics</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin header</td>
			<td style="width:191px;">KEL corporation</td>
			<td style="width:177px;">DSP02-006-431G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin socket</td>
			<td style="width:191px;">Hirose</td>
			<td style="width:177px;">21602X3GSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">A/D converter</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>3.70&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>5.82&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Fuji film</td>
			<td style="width:177px;">014-23302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Amplifier</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Muromachi</td>
			<td style="width:177px;">MK-AT-210D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Automatic injecter</td>
			<td style="width:191px;">KD scientific</td>
			<td style="width:177px;">780311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Carbide cutter</td>
			<td style="width:191px;">Minitor</td>
			<td style="width:177px;">B1055</td>
			<td>&#966;0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Cyanoacrylate adhesion&#160; (Aron alpha A) and acceleration</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#30533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Dental curing light</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">Elipar S10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Epoxy adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#04888</td>
			<td>insulation around the solder of 6-pin and shielded cable</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Fiber optic patch cord (branching)</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Gad67-Cre mice</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Kenji Sakimura</td>
			<td></td>
			<td>Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>65461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:191px;">FOREDOM</td>
			<td style="width:177px;">K.1070</td>
			<td>Used with carbide cutter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Interconnecting sleeve</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>ADAF1</td>
			<td>&#966;2.5 mm Ceramic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:191px;">Pfizer</td>
			<td>871119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Rapp OptoElectronic</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>473nm wave length</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser intesity checker</td>
			<td style="width:191px;">COHERENT</td>
			<td style="width:177px;">1098293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser stimulator</td>
			<td style="width:191px;">Bio research center</td>
			<td style="width:177px;">STO2</td>
			<td>reffered as pulse generator in text</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Optic fiber with ferrule&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV2-rh10</td>
			<td style="width:191px;">provided by PennVector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">Addgene</td>
			<td>plasimid # 20296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Karl Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Patch cord</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>D202-9089-0.4</td>
			<td>0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pHelper</td>
			<td style="width:191px;">Stratagene</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Photocurable dental cement</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">56846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Serafin clamp</td>
			<td style="width:191px;">Stoelting</td>
			<td style="width:177px;">52120-43P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Shielded cable</td>
			<td style="width:191px;">mogami</td>
			<td style="width:177px;">W2780</td>
			<td>Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep recording chamber</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td style="width:437px;">Custum-made (21cm&#215; 29cm &#215; 19cm) with water tank holder</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep sign software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Slip ring</td>
			<td style="width:191px;">neuroscience,inc</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless screw</td>
			<td style="width:191px;">Yamazaki</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>&#966;1.0 x 2.0</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless wire</td>
			<td style="width:191px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:177px;">AS633</td>
			<td>&#160;0.0130 inch diameter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stereotaxic frame with digital console</td>
			<td style="width:191px;">Koph</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Model 940</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Vital recorder software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice

I de seneste år, optogenetics har været meget udbredt i mange områder af neurovidenskabelig forskning. I mange tilfælde, en opsin, såsom kanal rhodopsin 2 (ChR2), udtrykkes ved en virus vektor i en bestemt type af neuronal celler i forskellige CRE-driver mus. Aktivering af disse opsynder udløses ved anvendelse af lysimpulser, som leveres af laser eller LED gennem optiske kabler, og effekten af aktivering observeres med meget høj tidsopløsning. Eksperimenteres er i stand til akut stimulere neuroner, mens overvågning adfærd eller et andet fysiologisk resultat i mus. Optogenetics kan gøre det muligt for nyttige strategier til at evaluere funktionen af neuronal kredsløb i reguleringen af søvn/vågenhed stater i mus. Her beskriver vi en teknik til at undersøge effekten af optogenetisk manipulation af neuroner med en specifik kemisk identitet under elektro encephalogram (EEG) og elektromyogram (EMG) overvågning for at evaluere søvn stadiet af mus. Som et eksempel beskriver vi manipulation af Gabaerge neuroner i sengen kernen af Stria terminalis (BNST). Akut optogenetisk excitation af disse neuroner udløser en hurtig overgang til vågenhed, når de anvendes under NREM søvn. Optogenetisk manipulation sammen med EEG/EMG optagelse kan anvendes til at dechifrere de neuronal kredsløb, der regulerer søvn/vågenhed stater.

Den nuværende undersøgelse viste effekten af optogenetisk excitation af GABABnst neuroner på søvntilstand overgang. ChR2-EYFP blev foisk udtrykt i GABA neuroner i BNST. En in situ hybridiseringhistokemisk undersøgelse viste, at ChR2-EYFP var colokaliseret i neuroner, der udtrykker GAD 67 mRNA-signaler, hvilket indikerer, at disse er Gabaerge neuroner. Immunohistokemiske skive prøver bekræftede positionen af den optiske fiber, hvis spids var lige over BNST<sup class="xref...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

Optogenetisk manipulation af neurale kredsløb under overvågning søvn/vågenhed stater i mus

Her beskriver vi metoder til optogenetisk manipulation af bestemte typer af neuroner under overvågning af søvn/vågenhed stater i mus, præsenterer vores seneste arbejde på sengen kernen af Stria terminalis som et eksempel.

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Denne procedure kan hjælpe os med at identificere funktionen af specifikke neuro kredsløb, der er involveret i søvn vågenhed regulering med mindre invasive manipulation og høj tidsmæssig opløsning. Denne metode giver os overvågningsoverfladeN EEG i realtid sammen med manipulation af et bestemt neurokredsløb for at undersøge årsagssammenhængen mellem kredsløb og søvnlædelighedsstater. Shota Kodani vil demonstrere proceduren.Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids, anvende salve på dyrets øjne og bruge ørestænger og næse pin til stereotaktiske apparat til at stabilisere hovedet af bedøvet mus på en absorberende pad. Når hovedet er fastgjort i position, foretage en mid-sagittal snit i hovedbunden for at bekræfte, at skæringspunktet mellem sutura sagittalis og sutura coronalis eller sutura lambdoidea er i en vandret linje på samme niveau. For at undgå et positionshul skal du justere næseknæen og ørestængerne efter behov.Derefter ved hjælp af serafin klemmer til at holde huden åbne desinficere den udsatte overflade af kraniet for at gøre det muligt kraniel suturer, der skal visualiseres mere klart. For at indsprøjte den adeno-associerede virusvektor skal en ethanolsteriliseret 10 millilitersprøjte med to mikroliter mineralsk olie, efterfulgt af den eksperimentelle virusmængde, der skal injiceres. Brug mikroinjektionspumpen til at justere spidsen af mikroinjektionsnålen på bregmaen og noter koordinaterne som oprindelsessted.Flyt derefter spidsen til det udpegede injektionssted, og placer spidsen af nålen på positionen. Marker kraniet på injektionsstedet og bruge en dental boremaskine udstyret med en 0,7 millimeter hårdmetal cutter til at bore en cirka to millimeter diameter hul i kraniet. Efter fjernelse af blod fra omkring hullet med en vatpind, langsomt flytte nålen til sengen kernen af stria terminalis eller BSNT og langsomt injicere den udpegede mængde virus opløsning.Lad derefter nålen være på plads i fem minutter, så opløsningen kan infiltrere BNST-vævet tilstrækkeligt, før nålen trækkes tilbage. For elektroencefalogram, eller EEG, og elektromyogram, eller EMG, elektrode implantation, første lodde to rustfrit stål ledninger, hvorfra en millimeter isolering er blevet strippet fra begge ender til EMG elektroder og placere midten af elektroderne på bregma. Marker derefter positionen for hver EEG-elektrode.For at bestemme placeringen af det optiske fiberimplantat, fastgør en optisk fiber ferrule til manipulator og rotere manipulator armen til et plus eller minus 30 graders vinkel mod en vandret linje. Sæt fiberspidsen på bregma og optag koordinaterne. Flyt spidsen til den målrettede indsætningslinje, og markér positionen på kraniet og placeringen af ankerskruen ved siden af indsætningsstedet.Brug dental boremaskine til at bore kraniet på hvert sted og bruge manipulator til forsigtigt at indsætte den optiske fiber, indtil den når over BNST. Ferrule bør hvile på det resterende kranium. Fastgør fiberen til kraniet med en ankerskrue, og pas på ikke at bryde duraen eller beskadige væv.Derefter dække fiber og skrue med foto-helbredes dental cement. Derefter bores huller til EEG/EMG-elektroder, og spidsen af den første elektrode indsættes i et hul. Hold implantatet med den ene hånd, anvende cyanoacrylat lim til rummet mellem kraniet og elektroden og indsætte elektroden resten af vejen, passe på ikke at beskadige noget væv.Når alle elektroderne er placeret, dække omkredsen af elektroderne og de optiske fibre med yderligere cyanoacrylat klæbemiddel og cyanoacrylat accelerant for at undgå at forårsage nogen afbrydelse på ferrule til optisk kabel og elektrode til bly tråd forbindelseszoner. Udsæt nu nakkemusklerne, og indsæt ledningerne til EMG-elektroden under musklen. Juster længden af EMG-elektroden, så den passer lige under nakkemusklerne, og fyld implantaterne med mere cyanoacrylatklæbemiddel og accelerant.Placer derefter musen på en varmepude med overvågning, indtil fuld kompensation. For EEG / EMG overvågning under foto-excitation af målrettede neuroner, skal du først bruge en skalar til at justere laser intensitet og bruge en ferrule til at binde spidsen af laserkablet til en ubrugt optisk fiber. Bekræft, at der ikke er plads ved krydset mellem fiberen og kablet.Efter 20 minutter udsender den varmede laser til intensitetskontrollen og justerer intensiteten til 10 milliwatt pr. millimeter kvadreret. Indstil lyspulsvarigheden til 10 millisekunder, hvileperioden til 40 millisekunder, cyklussen til 20 og gentagelsen til 20. Skift lasertilstand til transistorlogik og bekræft, at lysimpulser udsendes fra den fiber, der styres af mønsterregulatoren.Tilslut den implanterede elektrode og kabeladapteren, og dæk derefter krydset med let uigennemtrængeligt materiale for at forhindre laserlækage. Og når laseren er klar, skal du flytte musene til forsøgskammeret til EEG/EMG-optagelse. For at vurdere ventetiden til vågenhed fra ikke hurtige øjenbevægelser eller hurtig øjenbevægelses søvn, begræns optagetheden og optimeret tid til at få tid til at få tid til at vinde på stedet, og lad musene bevæge sig frit i forsøgskammeret i mindst en time.I forsøgsperioden overvåges EEG- og EMG-signalerne på samme optageskærm. Vurder musens tilstand som vågenhed, ikke hurtig øjenbevægelse søvn, eller hurtig øjenbevægelse søvn ved hjælp af gevinst kontrol for hver bølge for at lette at skelne hver tilstand. Til måling af den ikke hurtige øjenbevægelse søvn til vågenhed latenstid, observere stabil ikke hurtig øjenbevægelse søvn i 40 sekunder, derefter tænde mønster generator for foto stimulation og bekræfte laser emission til de implanterede optiske fibre.Optag derefter EEG/EMG-signalerne, indtil søvntilstanden ændres til vågenhed. Her repræsenterede EEG/EMG spor før og efter foto stimulation under ikke hurtig øjenbevægelse søvn er vist. En høj spænding og langsom frekvens EEG uden EMG signaler, repræsenterer ikke hurtig øjenbevægelse søvn.Foto stimulation udløste en akut overgang til vågenhed omkring to sekunder efter stimulation i channelrhodopsin-2 udtrykke mus, mens kontrol mus ikke demonstrere denne overgang, hvilket tyder på, at excitation af BNST GABA neuroner under ikke hurtig øjenbevægelse søvn udløser en hurtig induktion af vågenhed. Omvendt, foto stimulation under hurtige øjenbevægelser søvn havde ingen effekt, så en overgangseffekt kun opstod i ikke hurtig øjenbevægelse søvn. Det er vigtigt at passe på præcise koordineringer for virus injektion og optisk fiber implantation trin.EEG/EMG-spor, der er fanget under søvnanalysen, kan bruges til at vurdere konsekvenserne af fotomanipulationen på de forskellige årvågne tilstande hos mus. Denne teknik vil også hjælpe os med at identificere andre komponenter og kredsløb, der er involveret i reguleringen af søvn vågenhed stater. Brug beskyttelsesbriller for at undgå laserskader på øjet og sørg for altid at autoklave sterilisere den adeno-associerede virus vektor beholder efter brug.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Extinction Træning Under Efterpakning Window Forhindrer Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Elektroencefalografi, Real-time måling af laktat Koncentration og Optogenetic Manipulation af neuronale aktivitet i Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-unit Optagelse metoder til karakterisering af neurale aktivitet i Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Lugtesansen Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo to-foton billedbehandling af oplevelsesbaseret afhængige molekylære ændringer i kortikal neuroner

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic forstyrrelse af neurale aktivitet med laserbelysning i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Dissektion af Frygt Kredsløb i Brain Skiver

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic medrivning af hippocampus Theta svingninger i opfører sig mus

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Disruption of Frontal Lobe Neural Synchrony During Cognitive Control by Alcohol Intoxication

Afbrydelse af frontallappen neurale Synchrony under Kognitiv kontrol af alkoholforgiftning

Decision making relies on dynamic interactions of distributed, primarily frontal brain regions. Extensive evidence from functional magnetic resonance ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Påvisning af 5-Hydroxymethylcytosin i neurale stamceller og hjerner af mus

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Measuring Neural Mechanisms Underlying Sleep-Dependent Memory Consolidation During Naps in Early Childhood

Måling af neurale mekanismer underliggende søvn afhængig hukommelse konsolidering under lur i den tidlige barndom

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less ...