Name: optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door het Merck Investigator studies-programma (#54843), een KAKENHI-subsidie voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.), en een KAKENHI-subsidie voor verkennend onderzoek naar innovatieve gebieden (T.S.) (18H02595).

Alle experimenten hier werden goedgekeurd door het dier experiment en het gebruik Comité van de Universiteit van Tsukuba, die voldoen aan de NIH richtlijnen.
1. dieren chirurgie, virus injectie, elektrode voor EEG/EMG en implantatie van optische vezels
Let op: Er moeten passende beschermings-en behandelingstechnieken worden gekozen op basis van het bioveiligheidsniveau van het te gebruiken virus. AAV moet worden gebruikt in een geïsoleerde P...

<ol>
	<li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder:+Secondary+symptom+or+core+feature?.">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?.</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li><li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity.">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li><li>Mellman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+anxiety+disorders.">Sleep and anxiety disorders.</a> Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).</li><li>Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuitry+of+wakefulness+and+sleep.">Neural circuitry of wakefulness and sleep.</a> Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).</li><li>Chemelli, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Narcolepsy+in+orexin+knockout+mice:+Molecular+genetics+of+sleep+regulation.">Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation.</a> Cell. 98 (4), 437-451 (1999).</li><li>Borb&#233;ly, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two-process+model+of+sleep+regulation:+A+reappraisal.">The two-process model of sleep regulation: A reappraisal.</a> Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).</li><li>Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+human+sleep:+recovery+process+gated+by+a+circadian+pacemaker.">Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).</li><li>Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic,+circadian,+and+emotional+regulation+of+sleep.">Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep.</a> Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).</li><li>Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+state+switching.">Sleep state switching.</a> Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).</li><li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li><li>Tovote, P., Fadok, J. P., L&#252;thi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuits+for+fear+and+anxiety.">Neuronal circuits for fear and anxiety.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).</li><li>Lebow, M. A., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overshadowed+by+the+amygdala:+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+emerges+as+key+to+psychiatric+disorders.">Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders.</a> Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+and+proliferation+of+intermediate+progenitors+of+GABAergic+neurons+in+the+mouse+telencephalon.">Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon.</a> Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+light+on+wakefulness+and+arousal.">Shining light on wakefulness and arousal.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).</li><li>Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+hypocretin-mediated+sleep-to-wake+transitions.">Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).</li><li>Weber, F., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit-based+interrogation+of+sleep+control.">Circuit-based interrogation of sleep control.</a> Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).</li><li>Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+REM+sleep+by+ventral+medulla+GABAergic+neurons.">Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons.</a> Nature. 526, 435-438 (2015).</li><li>Oishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-wave+sleep+is+controlled+by+a+subset+of+nucleus+accumbens+core+neurons+in+mice.">Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).</li><li>Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optogenetics+with+complementary+methodologies+in+systems+neuroscience.">Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).</li><li>Saito, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+in+the+preoptic+area+send+direct+inhibitory+projections+to+orexin+neurons.">GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li><li>Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+GABAergic+neurons+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+triggers+immediate+transition+from+non-rapid+eye+movement+sleep+to+wakefulness+in+mice.">Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice.</a> Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).</li><li>Lin, F., Pichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+neurons:+tools,+applications,+and+experimental+constraints.">Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints.</a> Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O&#8217;Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li></ol>

We hier presenteerde een methode voor het evalueren van het effect van optogenetische stimulatie van neuronen met bepaalde chemische identiteiten op staat overgangen van slaap/wakkerheid en gaf een voorbeeld van manipulatie van GABABnst neuronen. Onze gegevens toonden aan dat optogenetische excitatie van GABABnst neuronen resulteert in onmiddellijke overgang van NREM slaap naar wakkerheid.
Verschillende experimentele ontwerpen zijn beschikbaar vanwege de ontwikkeling van ...

Slaap is essentieel voor een optimale cognitieve functie. Recente bevindingen suggereren ook dat verstoringen in de slaap worden geassocieerd met een breed scala aan ziekten1,2,3. Hoewel de functies van de slaap zijn nog grotendeels onopgeloste, substantiële vooruitgang is onlangs gemaakt in het begrijpen van de neurale circuits en mechanismen die controle slaap/wakkerheid Staten4. In zoogdieren, er zijn drie staten van waakzaamheid: wakkerheid, non-Rapid Eye Movement (NREM) slaap, en Rapid Eye Movement (REM) slaap. Wakkerheid wordt gekenmerkt door snelle EEG-oscillaties (5-12 Hz) van lage amplitude met doelbewuste en aanhoudende motorische activiteit. NREM-slaap wordt gedefinieerd door langzame oscillaties (1-4 Hz) van hoge amplitude (delta golven), met gebrek aan bewustzijn en doelbewuste motorische activiteit. REM-slaap wordt gekenmerkt door relatief snelle oscillaties (6-12 Hz) van lage amplitude en bijna volledige bilaterale spier atonia5.
Borbely stelde een theorie van slaap-wakkerheid verordening voor, bekend als de twee procesmodel6,7. Een homeostatisch proces, ook wel proces S genoemd, vertegenwoordigt slaap druk die zich ophoteert tijdens wakkerheid en verdwijnt tijdens de slaap. Een ander proces, aangeduid als proces C, is een circadiane proces, die verklaart waarom waakzaamheid niveaus fluctueren in de 24 h cyclus. Naast deze twee processen, allostatische factoren zijn ook belangrijk voor de regulering van de slaap/wakkerheid8,9. Allostatische factoren omvatten voedings toestanden en emotie. Angst en angst gaan meestal gepaard met een toename van de opwinding samen met autonome en neuro-endocriene reacties10,11,12. Het limbisch systeem wordt verondersteld om een rol te spelen in de regulering van angst en angst, en mechanismen die onderliggende autonome en neuro-endocriene reacties zijn uitgebreid bestudeerd, maar het pad waardoor het limbisch systeem beïnvloedt slaap/wakkerheid Staten heeft niet nog niet is onthuld. Een groot aantal recente studies met behulp van opto-en farmacogenetica hebben gesuggereerd dat neuronen en neuronale circuits die reguleren van slaap/wakkerheid Staten zijn verdeeld over de hersenen, met inbegrip van de cortices, basale forebrain, thalamus, hypothalamus, en hersenstam. In het bijzonder, recente ontwikkelingen in optogenetics hebben ons toegestaan om te stimuleren of te remmen specifieke neurale circuits in vivo met hoge ruimtelijke en tijdelijke resoluties. Deze techniek zal leiden tot vooruitgang in ons begrip van de neurale substraten van slaap en wakkerheid, en hoe slaap/wakkerheid Staten worden gereguleerd door circadiane processen, slaap druk, en allostatische factoren, met inbegrip van emotie. Dit artikel is bedoeld om te introduceren hoe optogenetische manipulatie gecombineerd met slaap/waak opname, die het potentieel hebben om ons begrip van de connectomes en mechanismen in de hersenen die een rol spelen in de regulering van NREM slaap, REM slaap, en wakkerheid. Begrip van dit mechanisme waardoor het limbisch systeem slaap/wakkerheid regelt is van het allergrootste belang voor de gezondheid, omdat slapeloosheid meestal wordt geassocieerd met angst of angst om niet in staat om te slapen (somniphobia).
De BNST wordt verondersteld een essentiële rol te spelen in angst en vrees. Gad 67-het uitdrukken van GABAergic neuronen zijn een grote populatie van de bnst12,13. We onderzochten het effect van optogenetische manipulatie van deze neuronen (GABABnst) op slaap/wakkerheid Staten. Een van de grootste vooruitgang in de neurowetenschappen in de afgelopen jaren is methoden die manipulatie van neuronen met bepaalde chemische identiteiten in vivo mogelijk maken, met hoge ruimtelijke en temporele resoluties. Optogenetics is zeer nuttig voor het aantonen van causale verbanden tussen neurale activiteit en specifieke gedrags responsen14. We beschrijven optogenetics als een methode voor het onderzoeken van de functionele connectiviteit van gedefinieerde neurale circuits in de regulering van de slaap/wakkerheid Staten. Door gebruik te maken van deze techniek, grote vooruitgang is bereikt in het begrijpen van de neuronale circuits die slaap/wakkerheid staten reguleren15,16,17,18,19 . In veel gevallen worden opsins specifiek geïntroduceerd in neuronen met specifieke chemische identiteiten in selectieve hersengebieden door een combinatie van CRE-driver muizen en CRE-inducible AAV-gemedieerde genoverdracht. Verder, focale uitdrukking van foto-gevoelige opsins zoals channelrhodopsin 2 (ChR2)20 of archaerhodopsin (archt)21 in combinatie met een CRE-Loxp of FLP-FRT-systeem stelt ons in staat om een selectieve neuronale populatie te manipuleren en specifieke Neural pathway22.
We beschrijven hier experimenten op GABAergic neuronen in de BNST als voorbeeld. Om opzonden in een aangewezen neuronale populatie uit te drukken, worden geschikte CRE driver muizen en CRE-afhankelijke virus vectoren het vaakst gebruikt. Transgene of knock-in lijnen waarin opsins worden uitgedrukt in het bijzonder neuronale populaties zijn ook nuttig. In de volgende experimenten gebruikten we GAD67-CRE knock-in muizen23 waarin alleen GABAergic neuronen Express CRE of met een C57BL/6j genetische achtergrond, en een Aav vector die CHR2 bevat (hChR2 H134R) gesmolten met eyfp of eyfp als een controle met een "FLEx (Flip-excision) schakelaar"24. De procedure specifiek beschrijft optogenetische excitatie van GABAergic neuronen in de BNST tijdens het monitoren van de slaap/wakkerheid Staten25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1180px;" width="1180">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">1x1 Fiber-optic Rotary Joints</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td style="width:177px;">FRJ 1x1 FC-FC</td>
			<td style="width:437px;">for optogenetics</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin header</td>
			<td style="width:191px;">KEL corporation</td>
			<td style="width:177px;">DSP02-006-431G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin socket</td>
			<td style="width:191px;">Hirose</td>
			<td style="width:177px;">21602X3GSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">A/D converter</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>3.70&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>5.82&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Fuji film</td>
			<td style="width:177px;">014-23302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Amplifier</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Muromachi</td>
			<td style="width:177px;">MK-AT-210D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Automatic injecter</td>
			<td style="width:191px;">KD scientific</td>
			<td style="width:177px;">780311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Carbide cutter</td>
			<td style="width:191px;">Minitor</td>
			<td style="width:177px;">B1055</td>
			<td>&#966;0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Cyanoacrylate adhesion&#160; (Aron alpha A) and acceleration</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#30533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Dental curing light</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">Elipar S10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Epoxy adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#04888</td>
			<td>insulation around the solder of 6-pin and shielded cable</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Fiber optic patch cord (branching)</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Gad67-Cre mice</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Kenji Sakimura</td>
			<td></td>
			<td>Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>65461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:191px;">FOREDOM</td>
			<td style="width:177px;">K.1070</td>
			<td>Used with carbide cutter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Interconnecting sleeve</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>ADAF1</td>
			<td>&#966;2.5 mm Ceramic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:191px;">Pfizer</td>
			<td>871119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Rapp OptoElectronic</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>473nm wave length</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser intesity checker</td>
			<td style="width:191px;">COHERENT</td>
			<td style="width:177px;">1098293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser stimulator</td>
			<td style="width:191px;">Bio research center</td>
			<td style="width:177px;">STO2</td>
			<td>reffered as pulse generator in text</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Optic fiber with ferrule&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV2-rh10</td>
			<td style="width:191px;">provided by PennVector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">Addgene</td>
			<td>plasimid # 20296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Karl Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Patch cord</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>D202-9089-0.4</td>
			<td>0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pHelper</td>
			<td style="width:191px;">Stratagene</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Photocurable dental cement</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">56846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Serafin clamp</td>
			<td style="width:191px;">Stoelting</td>
			<td style="width:177px;">52120-43P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Shielded cable</td>
			<td style="width:191px;">mogami</td>
			<td style="width:177px;">W2780</td>
			<td>Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep recording chamber</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td style="width:437px;">Custum-made (21cm&#215; 29cm &#215; 19cm) with water tank holder</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep sign software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Slip ring</td>
			<td style="width:191px;">neuroscience,inc</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless screw</td>
			<td style="width:191px;">Yamazaki</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>&#966;1.0 x 2.0</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless wire</td>
			<td style="width:191px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:177px;">AS633</td>
			<td>&#160;0.0130 inch diameter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stereotaxic frame with digital console</td>
			<td style="width:191px;">Koph</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Model 940</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Vital recorder software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice

In de afgelopen jaren, optogenetics is op grote schaal gebruikt in vele gebieden van neurowetenschappelijk onderzoek. In veel gevallen, een opsin, zoals kanaal rhodopsine 2 (ChR2), wordt uitgedrukt door een virus vector in een bepaald type van neuronale cellen in verschillende CRE-driver muizen. Activering van deze opsins wordt veroorzaakt door de toepassing van lichtflitsen die worden geleverd door laser of geleid door optische kabels, en het effect van activering wordt waargenomen met zeer hoge tijdresolutie. Experimenteurs zijn in staat om acuut neuronen te stimuleren tijdens het monitoren van gedrag of een andere fysiologische uitkomst bij muizen. Optogenetics kan nuttige strategieën om te evalueren van de functie van neuronale circuits in de regulering van de slaap/wakkerheid toestanden in muizen mogelijk te maken. Hier beschrijven we een techniek voor het onderzoeken van het effect van optogenetische manipulatie van neuronen met een specifieke chemische identiteit tijdens elektro-encefalogram (EEG) en electromyogram (EMG) monitoring om de slaap fase van muizen te evalueren. Als voorbeeld beschrijven we manipulatie van GABAergic neuronen in de bed kern van de Stria terminalis (BNST). Acute optogenetische excitatie van deze neuronen activeert een snelle overgang naar wakkerheid wanneer toegepast tijdens de NREM-slaap. Optogenetische manipulatie samen met EEG/EMG opname kan worden toegepast om te ontcijferen van de neuronale circuits die slaap/wakkerheid staten reguleren.

De huidige studie toonde het effect van optogenetische excitatie van GABABnst neuronen op slaaptoestand overgang. ChR2-EYFP werd focaal uitgedrukt in GABA neuronen in de BNST. Een in situ hybridisatie histochemische studie toonde aan dat ChR2-EYFP werd gelokaliseerd in neuronen die de GAD 67 mRNA signalen uitdrukken, wat aangeeft dat dit GABAergic neuronen zijn. Immunohistochemical slice samples bevestigden de positie van de optische vezel, waarvan de punt net boven de BNST<sup...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

Optogenetische manipulatie van neurale circuits tijdens het monitoren van slaap/wakkerheid toestanden in muizen

Hier beschrijven we methoden van optogenetische manipulatie van bepaalde soorten neuronen tijdens het monitoren van de slaap/wakkerheid toestanden in muizen, het presenteren van onze recente werk op de bed kern van de Stria terminalis als voorbeeld.

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Deze procedure kan ons helpen bij het identificeren van de functie van specifieke neuro-circuit die betrokken zijn bij de slaap wakkerheid verordening met minder invasieve manipulatie en hoge temporele resolutie. Deze methode stelt ons in staat de monitoring oppervlak EEG in real time in combinatie met manipulatie van een specifieke neuro-circuit om de causale relatie tussen circuits en slaap wakkerheid staten te onderzoeken. Shota Kodani gaat de procedure demonstreren.Na bevestiging van een gebrek aan respons op teensnuifje, breng zalf aan op de ogen van het dier en gebruik de oorspen en neuspen op het stereotactische apparaat om het hoofd van de verdoofde muis op een absorberend pad te stabiliseren. Wanneer het hoofd is vastgesteld in positie, maak een mid-sagittale incisie in de hoofdhuid om te bevestigen dat de kruising tussen de sutura sagittalis en sutura coronalis of sutura lambdoidea zijn in een horizontale lijn op hetzelfde niveau. Om een positioneringsgat te voorkomen, stelt u de neussneus en de oorbalken zo nodig aan.Dan met behulp van serafin klemmen aan het houden van de huid open desinfecteren het blootgestelde oppervlak van de schedel om de craniale hechtingen te visualiseersen duidelijker. Om de adeno-geassocieerde virusvector te injecteren, laadt u een ethanol gesteriliseerd 10 milliliter spuit met twee microliter minerale olie, gevolgd door het experimentele volume van het virus te injecteren. Gebruik de microinjectiepomp om de punt van de microinjectienaald op de bregma aan te passen en noteer de coördinaten als punt van oorsprong.Verplaats vervolgens de punt naar de aangewezen injectieplaats en plaats de punt van de naald op de positie. Markeer de schedel op de injectieplaats en gebruik een tandboor uitgerust met een 0,7 millimeter carbidsnijder om een gat met een diameter van ongeveer twee millimeter in de schedel te boren. Na het verwijderen van bloed uit de buurt van het gat met een wattenstaafje, langzaam verplaatsen van de naald naar het bed kern van de stria terminalis of BSNT en langzaam injecteren van de aangewezen volume van het virus oplossing.Laat de naald vervolgens vijf minuten op zijn plaats staan om de oplossing voldoende te laten infiltreren in het BNST-weefsel voordat u de naald zorgvuldig intrekt. Voor elektro-encefalogram, of EEG, en elektromyogram, of EMG, elektrode implantatie, eerst soldeer twee roestvrijstalen draden waaruit een millimeter isolatie is ontdaan van beide uiteinden aan de EMG-elektroden en plaats het centrum van de elektroden op de bregma. Markeer vervolgens de positie voor elke EEG-elektrode.Om de positie van het optische vezelimplantaat te bepalen, bevestigt u een optische vezel ferrule aan de manipulator en draait u de manipulatorarm naar een plus- of min 30 graden hoek tegen een horizontale lijn. Zet de vezeltip op de bregma en leg de coördinaten vast. Verplaats de tip naar de beoogde invoeglijn en markeer de positie op de schedel en de positie voor de ankerschroef naast de invoegplaats.Gebruik de tandheelkundige boor om de schedel te boren op elke site en gebruik de manipulator om voorzichtig invoegen van de optische vezel totdat het boven de BNST. De ferrule moet rusten op de resterende schedel. Zet de vezel vast aan de schedel met een ankerschroef, waarbij u ervoor zorgt dat de dura niet wordt gebroken of weefsel wordt beschadigd.Bedek vervolgens de vezel en schroef met foto-geneesbaar tandcement. Boor vervolgens gaten voor EEG/EMG-elektroden en steek de punt van de eerste elektrode in één gat. Houd het implantaat met één hand vast, breng cyanoacrylaatlijm aan op de ruimte tussen de schedel en de elektrode en steek de elektrode de rest van de weg in, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er geen weefsel wordt beschadigd.Wanneer alle elektroden zijn geplaatst, bedek dan de omtrek van de elektroden en de optische vezels met extra cyanoacrylaatlijm en cyanoacrylaatversneller om te voorkomen dat er onderbrekingen in de ferrule tot optische kabel en elektrode naar looddraad verbindingszones. Stel nu de nekspieren bloot en steek de draden voor de EMG-elektrode onder de spier. Pas de lengte van de EMG-elektrode zo aan dat deze net onder de nuchal-spieren past en vul de implantaten met meer cyanoacrylaatlijm en brandversneller.Plaats vervolgens de muis op een warmtekussen met controle tot volledige recompensy. Voor EEG/EMG monitoring tijdens de foto-excitatie van gerichte neuronen, eerst gebruik maken van een scalar om de laser intensiteit aan te passen en gebruik een ferrule om de punt van de laserkabel tether aan een ongebruikte optische vezel. Bevestig dat er geen ruimte is op de kruising tussen de vezel en de kabel.Na 20 minuten, stoot de opgewarmde laser aan de intensiteitscontrole uit en pas de intensiteit aan 10 milliwatt per millimeter kwadraat. Stel de lichtpulsduur in op 10 milliseconden, de rusttijd op 40 milliseconden, de cyclus op 20 en de herhaling op 20. Verander de lasermodus in transistorlogica en bevestig dat lichtpulsen worden uitgezonden door de vezel die wordt aangestuurd door de patroonregelaar.Sluit de geïmplanteerde elektrode en kabeladapter aan en bedek de verbinding met licht ondoordringbaar materiaal om laserlekkage te voorkomen. En wanneer de laser klaar is, verplaats de muizen naar de experimentele kamer voor EEG / EMG opname. Om de latentie te beoordelen op wakkerheid van niet-snelle oogbeweging of snelle oogbeweging slaap, beperk de opnametijd en geoptimaliseerde site tijd winnen en laat de muizen vrij bewegen in de experimentele kamer voor ten minste een uur.Tijdens de experimentele periode, monitor de EEG en EMG signalen in hetzelfde opnamescherm. Evalueer de toestand van de muis als wakkerheid, niet-snelle slaap van oogbewegingen of snelle slaap van oogbewegingen met behulp van de gain control voor elke golf voor het gemak van het onderscheiden van elke toestand. Voor het meten van de niet-snelle slaap van de oogbeweging naar wakkerheid latentie, observeren stabiele niet-snelle oogbeweging slaap gedurende 40 seconden, zet dan de patroon generator voor foto stimulatie en bevestigen laser emissie aan de geïmplanteerde optische vezels.Neem vervolgens de EEG/EMG-signalen op totdat de slaaptoestand verandert in wakkerheid. Hier vertegenwoordigde EEG/EMG worden de sporen vóór en na fotostimulatie tijdens niet snelle slaap van de oogbeweging getoond. Een hoge spanning en langzame frequentie EEG zonder EMG signalen, vertegenwoordigt niet snelle oogbeweging slaap.Foto stimulatie leidde tot een acute overgang naar wakkerheid ongeveer twee seconden na stimulatie in channelrhodopsine-2 uitdrukken muizen, terwijl de controle muizen niet aantonen deze overgang, wat suggereert dat de opwinding van BNST GABA neuronen tijdens niet-snelle oogbeweging slaap triggers een snelle inductie van wakkerheid. Omgekeerd, foto stimulatie tijdens snelle oogbeweging slaap had geen effect, zodat een overgangseffect alleen ontstaan in niet-snelle oogbeweging slaap. Het is belangrijk om te zorgen voor nauwkeurige coördinaties voor de virusinjectie en optische vezel implantatie stappen.De EEG/EMG sporen die tijdens de slaapanalyse zijn vastgelegd, kunnen worden gebruikt om de gevolgen van de fotomanipulatie op de verschillende waakzame toestanden bij muizen te beoordelen. Deze techniek zal ons ook helpen bij het identificeren van andere componenten en circuits die betrokken zijn bij het reguleren van de slaap wakkerheid staten. Gebruik een veiligheidsbril om laserschade aan het oog te voorkomen en zorg ervoor dat u de adeno-geassocieerde virusvector container na gebruik altijd autoclave steriliseert.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Uitsterven Training Tijdens de verdichting Window Voorkomt Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Gelijktijdig Elektro, Real-time meting van lactaatconcentratie en Optogenetic Manipulatie van neuronale activiteit in de Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-unit Opname Methoden om neurale activiteit karakteriseren in de Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactorische Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation van neurale activiteit met Laser Verlichting in Semi-intacte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic meevoeren van Hippocampal Theta oscillaties in het gedrag van muizen

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Disruption of Frontal Lobe Neural Synchrony During Cognitive Control by Alcohol Intoxication

Verstoring van de frontale kwab neurale Synchrony tijdens cognitieve controle door Alcohol Intoxication

Decision making relies on dynamic interactions of distributed, primarily frontal brain regions. Extensive evidence from functional magnetic resonance ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

De detectie van 5-Hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en hersenen van muizen

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Measuring Neural Mechanisms Underlying Sleep-Dependent Memory Consolidation During Naps in Early Childhood

Het meten van neurale mechanismen onderliggende slaap-afhankelijke geheugen consolidatie tijdens Nap's in de vroege kindertijd

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less ...