Name: optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Cette étude a été appuyée par le Merck Investigator Studies Program (#54843), un KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas, «WillDynamics» (16H06401) (T.S.), et un KAKENHI Grant-in-Aid for Exploratory Research on Innovative Areas (T.S.) (18H02595).

Toutes les expériences ici ont été approuvées par le Comité d'expérimentation et d'utilisation des animaux de l'Université de Tsukuba, conformément aux directives des NIH.
1. Chirurgie animale, injection de virus, électrode pour EEG/EMG, et implantation optique de fibre
MISE EN GARDE: Les techniques appropriées de protection et de manipulation devraient être choisies en fonction du niveau de biosécurité du virus à utiliser. AAV d...

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	<li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder:+Secondary+symptom+or+core+feature?.">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?.</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li><li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity.">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li><li>Mellman, T. 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S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).</li><li>Kim, C. 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S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+neurons:+tools,+applications,+and+experimental+constraints.">Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints.</a> Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O&#8217;Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li></ol>

Nous avons présenté ici une méthode pour évaluer l'effet de la stimulation optogénétique des neurones avec des identités chimiques particulières sur les transitions d'état du sommeil/éveil et avons donné un exemple de manipulation des neurones DE BNST de GABA. Nos données ont prouvé que l'excitation optogénétique des neurones deBNST de GABA a comme conséquence la transition immédiate du sommeil de NREM à l'éveil.
Diverses conceptions expérimentales son...

Le sommeil est essentiel pour une fonction cognitive optimale. Des résultats récents suggèrent également que les perturbations dans le sommeil sont associées à un large éventail de maladies1,2,3. Bien que les fonctions du sommeil ne soient pas encore encore en grande partie résolues, des progrès substantiels ont été réalisés récemment dans la compréhension des circuits neuronaux et des mécanismes qui contrôlent les états de sommeil/éveil4. Chez les mammifères, il y a trois états de vigilance : l'éveil, le sommeil non rapide des mouvements oculaires (NREM) et le sommeil rapide des yeux (REM). L'éveil est caractérisé par des oscillations rapides d'EEG (5-12 Hz) de basse amplitude avec l'activité motrice intentionnelle et soutenue. Le sommeil NREM est défini par des oscillations lentes (1-4 Hz) de haute amplitude (ondes delta), avec un manque de conscience et une activité motrice ciblée. Le sommeil paradoxal est caractérisé par des oscillations relativement rapides (6-12 Hz) de faible amplitude et presque complète atonia musculaire bilatérale5.
Borbely a proposé une théorie de la régulation de l'éveil du sommeil connue sous le nom de modèle à deux processus6,7. Un processus homéostatique, également appelé processus S, représente la pression du sommeil qui s'accumule pendant l'éveil et se dissipe pendant le sommeil. Un autre processus, appelé processus C, est un processus circadien, ce qui explique pourquoi les niveaux de vigilance fluctuent dans le cycle de 24 h. En plus de ces deux processus, les facteurs allostatiques sont également importants pour la régulation du sommeil / éveil8,9. Les facteurs allostatiques incluent les états nutritionnels et l'émotion. La peur et l'anxiété sont généralement accompagnées d'une augmentation de l'excitation ainsi que des réponses autonomes et neuroendocrines10,11,12. Le système limbique est censé jouer un rôle dans la régulation de la peur et de l'anxiété, et les mécanismes sous-jacents aux réponses autonomes et neuroendocrines ont été étudiés en profondeur, mais la voie par laquelle le système limbique influence le sommeil / état d'éveil n'a pas encore été révélé. Un grand nombre d'études récentes utilisant l'opto- et la pharmacogénétique ont suggéré que les neurones et les circuits neuronaux qui régulent les états de sommeil/éveil sont distribués dans tout le cerveau, y compris les cortices, le cerveau avant basal, le thalamus, l'hypothalamus, et le tronc cérébral. En particulier, les progrès récents dans l'optogénétique nous ont permis de stimuler ou d'inhiber des circuits neuronaux spécifiques in vivo avec des résolutions spatiales et temporelles élevées. Cette technique permettra de progresser dans notre compréhension des substrats neuronaux du sommeil et de l'éveil, et comment les états de sommeil/éveil sont réglés par les processus circadiens, la pression du sommeil et les facteurs allostatiques, y compris l'émotion. Cet article vise à introduire comment utiliser la manipulation optogénétique combinée avec l'enregistrement du sommeil / veille, qui pourrait avoir le potentiel de mettre à jour notre compréhension des connectomes et des mécanismes dans le cerveau qui jouent un rôle dans la régulation du sommeil NREM, sommeil paradoxal, et l'éveil. La compréhension de ce mécanisme par lequel le système limbique régule les états de sommeil/éveil est d'une importance primordiale pour la santé, parce que l'insomnie est habituellement associée à l'anxiété ou à la peur d'être incapable de dormir (somniphobie).
On pense que le BNST joue un rôle essentiel dans l'anxiété et la peur. GAD 67-exprimant les neurones GABAergic sont une population importante de la BNST12,13. Nous avons examiné l'effet de la manipulation optogénétique de ces neurones (GABABNST) sur les états de sommeil/éveil. L'une des plus grandes avancées en neurosciences ces dernières années a été des méthodes qui permettent la manipulation de neurones avec des identités chimiques particulières in vivo, avec des résolutions spatiales et temporelles élevées. L'optogénétique est très utile pour démontrer les liens de causalité entre l'activité neuronale et les réponses comportementales spécifiques14. Nous décrivons l'optogénétique comme méthode pour examiner la connectivité fonctionnelle des circuits neuronaux définis dans la régulation des états de sommeil/éveil. En utilisant cette technique, de grands progrès ont été réalisés dans la compréhension des circuits neuronaux qui régulent le sommeil / éveil états15,16,17,18,19 . Dans de nombreux cas, les opsines sont spécifiquement introduites dans les neurones avec des identités chimiques particulières dans les régions sélectives du cerveau par une combinaison de souris Cre-driver et Cre-inductible AAV-négocié le transfert de gène. En outre, l'expression focale d'opsines photosensibles telles que la canalrhodopsine 2 (ChR2)20 ou l'archaerhodopsine (ArchT)21 combinée à un système Cre-loxP ou Flp-FRT nous permet de manipuler une population neuronale sélective et spécifique voie neuronale22.
Nous décrivons ici des expériences sur des neurones GABAergic dans le BNST comme exemple. Pour exprimer des opsines dans une population neuronale désignée, des souris de conducteur de Cre appropriées et des vecteurs de virus Cre-dépendants sont le plus fréquemment utilisés. Les lignes transgéniques ou knock-in dans lesquelles les opsines sont exprimées en particulier les populations neuronales sont également utiles. Dans les expériences suivantes, nous avons utilisé GAD67-Cre knock-in souris23 dans lequel seuls les neurones GABAergic exprimer Cre recombinase avec un fond génétique C57BL/6J, et un vecteur AAV qui contient ChR2 (hChR2 H134R) fusionné avec EYFP ou EYFP comme un contrôle avec un commutateur "FLEx (Flip-excision)"24. La procédure décrit spécifiquement l'excitation optogénétique des neurones GABAergic dans le BNST pendant la surveillance des états de sommeil/éveil25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1180px;" width="1180">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">1x1 Fiber-optic Rotary Joints</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td style="width:177px;">FRJ 1x1 FC-FC</td>
			<td style="width:437px;">for optogenetics</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin header</td>
			<td style="width:191px;">KEL corporation</td>
			<td style="width:177px;">DSP02-006-431G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin socket</td>
			<td style="width:191px;">Hirose</td>
			<td style="width:177px;">21602X3GSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">A/D converter</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>3.70&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>5.82&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Fuji film</td>
			<td style="width:177px;">014-23302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Amplifier</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Muromachi</td>
			<td style="width:177px;">MK-AT-210D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Automatic injecter</td>
			<td style="width:191px;">KD scientific</td>
			<td style="width:177px;">780311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Carbide cutter</td>
			<td style="width:191px;">Minitor</td>
			<td style="width:177px;">B1055</td>
			<td>&#966;0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Cyanoacrylate adhesion&#160; (Aron alpha A) and acceleration</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#30533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Dental curing light</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">Elipar S10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Epoxy adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#04888</td>
			<td>insulation around the solder of 6-pin and shielded cable</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Fiber optic patch cord (branching)</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Gad67-Cre mice</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Kenji Sakimura</td>
			<td></td>
			<td>Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>65461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:191px;">FOREDOM</td>
			<td style="width:177px;">K.1070</td>
			<td>Used with carbide cutter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Interconnecting sleeve</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>ADAF1</td>
			<td>&#966;2.5 mm Ceramic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:191px;">Pfizer</td>
			<td>871119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Rapp OptoElectronic</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>473nm wave length</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser intesity checker</td>
			<td style="width:191px;">COHERENT</td>
			<td style="width:177px;">1098293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser stimulator</td>
			<td style="width:191px;">Bio research center</td>
			<td style="width:177px;">STO2</td>
			<td>reffered as pulse generator in text</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Optic fiber with ferrule&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV2-rh10</td>
			<td style="width:191px;">provided by PennVector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">Addgene</td>
			<td>plasimid # 20296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Karl Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Patch cord</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>D202-9089-0.4</td>
			<td>0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pHelper</td>
			<td style="width:191px;">Stratagene</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Photocurable dental cement</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">56846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Serafin clamp</td>
			<td style="width:191px;">Stoelting</td>
			<td style="width:177px;">52120-43P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Shielded cable</td>
			<td style="width:191px;">mogami</td>
			<td style="width:177px;">W2780</td>
			<td>Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep recording chamber</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td style="width:437px;">Custum-made (21cm&#215; 29cm &#215; 19cm) with water tank holder</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep sign software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Slip ring</td>
			<td style="width:191px;">neuroscience,inc</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless screw</td>
			<td style="width:191px;">Yamazaki</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>&#966;1.0 x 2.0</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless wire</td>
			<td style="width:191px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:177px;">AS633</td>
			<td>&#160;0.0130 inch diameter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stereotaxic frame with digital console</td>
			<td style="width:191px;">Koph</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Model 940</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Vital recorder software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice

Ces dernières années, l'optogénétique a été largement utilisée dans de nombreux domaines de la recherche neuroscientifique. Dans de nombreux cas, une opsine, comme la rhodopsine 2 (ChR2), est exprimée par un vecteur de virus dans un type particulier de cellules neuronales chez diverses souris Cre-driver. L'activation de ces opsines est déclenchée par l'application d'impulsions lumineuses qui sont délivrées par laser ou LED par des câbles optiques, et l'effet de l'activation est observé avec une résolution de temps très élevée. Les expérimentateurs sont en mesure de stimuler les neurones de façon aigue tout en surveillant le comportement ou un autre résultat physiologique chez la souris. L'optogénétique peut permettre des stratégies utiles pour évaluer la fonction des circuits neuronaux dans la régulation des états de sommeil/éveil chez la souris. Ici nous décrivons une technique pour examiner l'effet de la manipulation optogénétique des neurones avec une identité chimique spécifique pendant la surveillance d'électroencéphalogramme (EEG) et d'électromyogramme (EMG) pour évaluer le stade de sommeil des souris. Par exemple, nous décrivons la manipulation des neurones GABAergic dans le noyau de lit du terminalis de stria (BNST). L'excitation optogénétique aigue de ces neurones déclenche une transition rapide à l'éveil une fois appliqué pendant le sommeil de NREM. La manipulation optogénétique ainsi que l'enregistrement EEG/EMG peuvent être appliqués pour déchiffrer les circuits neuronaux qui régulent les états de sommeil/éveil.

La présente étude a montré l'effet de l'excitation optogénétique des neurones GABABNST sur la transition de l'état du sommeil. ChR2-EYFP a été exprimée au centre dans les neurones GABA dans le BNST. Une étude histochimique d'hybridation in situ a prouvé que ChR2-EYFP a été colocalisé dans les neurones exprimant des signaux d'ARNm de GAD 67, indiquant que ce sont des neurones GABAergic. Des échantillons de tranches immunohistochimiques ont confirmé la position de...

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Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

Manipulation optogénétique des circuits neuronaux pendant la surveillance des états de sommeil/éveil chez les souris

Ici, nous décrivons des méthodes de manipulation optogénétique de types particuliers de neurones pendant la surveillance des états de sommeil/éveil chez les souris, présentant nos travaux récents sur le noyau de lit de la stria terminalis comme exemple.

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Cette procédure peut nous aider à identifier la fonction du circuit neuro spécifique qui sont impliqués dans la régulation de l’éveil du sommeil avec une manipulation moins invasive et une résolution temporelle élevée. Cette méthode nous permet de surveiller l’EEG de surface en temps réel en conjonction avec la manipulation d’un circuit neuro spécifique pour examiner la relation causale entre les circuits et les états d’éveil du sommeil. Shota Kodani va démontrer la procédure.Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils, appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal et utilisez les barres d’oreille et la goupille du nez à l’appareil stéréotaxique pour stabiliser la tête de la souris anesthésiée sur un coussin absorbant. Lorsque la tête est fixée en position, faire une incision mi-sagittale dans le cuir chevelu pour confirmer que l’intersection entre la sutura sagittalis et sutura coronalis ou sutura lambdoidea sont dans une ligne horizontale au même niveau. Pour éviter un écart de positionnement, ajustez le pincement du nez et les barres d’oreille au besoin.Ensuite, l’utilisation de pinces de sérafin pour maintenir la peau ouverte désinfecte la surface exposée du crâne pour permettre aux sutures crâniens d’être visualisées plus clairement. Pour injecter le vecteur du virus associé à l’adéno, chargez une seringue stérilisée à l’éthanol de 10 millilitres avec deux microlitres d’huile minérale, suivie du volume expérimental de virus à injecter. Utilisez la pompe à microinjection pour régler la pointe de l’aiguille de microinjection sur la brème et notez les coordonnées comme point d’origine.Déplacez ensuite la pointe vers le site d’injection désigné et placez le bout de l’aiguille sur la position. Marquez le crâne au site d’injection et utilisez une perceuse dentaire munie d’un cutter carbure de 0,7 millimètre pour percer un trou d’environ deux millimètres de diamètre dans le crâne. Après avoir retiré le sang autour du trou à l’aide d’un coton-tige, déplacez lentement l’aiguille vers le noyau du lit de la stria terminalis ou BSNT et injectez lentement le volume désigné de solution virale.Laissez ensuite l’aiguille en place pendant cinq minutes pour permettre à la solution de s’infiltrer suffisamment dans le tissu BNST avant de retirer soigneusement l’aiguille. Pour l’électroencéphalogramme, ou EEG, et l’électromyogramme, ou EMG, implantation d’électrodes, d’abord soudeur deux fils en acier inoxydable à partir de laquelle un millimètre d’isolation a été dépouillé des deux extrémités aux électrodes EMG et placer le centre des électrodes sur le bregma. Marquez ensuite la position de chaque électrode EEG.Pour déterminer la position de l’implant de fibre optique, fixez une fibre optique ferrule au manipulateur et faites pivoter le bras manipulateur à un angle de plus ou moins 30 degrés contre une ligne horizontale. Mettez la pointe de fibre sur le bregma et enregistrez les coordonnées. Déplacez la pointe vers la ligne d’insertion ciblée et marquez la position sur le crâne et la position de la vis d’ancrage à côté du site d’insertion.Utilisez la perceuse dentaire pour percer le crâne à chaque emplacement et utilisez le manipulateur pour insérer doucement la fibre optique jusqu’à ce qu’elle atteigne au-dessus du BNST. La ferrule doit reposer sur le crâne restant. Fixez la fibre au crâne avec une vis d’ancrage, en prenant soin de ne pas casser le dura ou endommager les tissus.Couvrez ensuite la fibre et vissez avec du ciment dentaire photo-curable. Ensuite, percer des trous pour les électrodes EEG/EMG et insérer la pointe de la première électrode dans un trou. En tenant l’implant d’une main, appliquez l’adhésif cyanoacrylate sur l’espace entre le crâne et l’électrode et insérez l’électrode le reste du chemin, en prenant soin de ne pas endommager les tissus.Lorsque toutes les électrodes ont été placées, couvrir la circonférence des électrodes et des fibres optiques d’adhésifs cyanoacrylates supplémentaires et d’accélérant cyanoacrylate afin d’éviter de causer une interruption à la ferrule du câble optique et de l’électrode pour diriger les zones de raccordement des fils. Maintenant exposer les muscles du cou, et insérer les fils pour l’électrode EMG sous le muscle. Ajustez la longueur de l’électrode EMG de sorte qu’elle s’adapte juste sous les muscles nuchal et remplissez les implants avec plus d’adhésif cyanoacrylate et d’accélérant.Ensuite, placez la souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à la pleine récompense. Pour la surveillance eEG/EMG pendant la photo-excitation des neurones ciblés, utilisez d’abord un scalaire pour ajuster l’intensité laser et utiliser un ferrule pour attacher la pointe du câble laser à une fibre optique inutilisée. Confirmez qu’il n’y a pas d’espace à la jonction entre la fibre et le câble.Après 20 minutes, émettre le laser réchauffé au contrôle d’intensité et ajuster l’intensité à 10 milliwatts par millimètre au carré. Réglez la durée de l’impulsion lumineuse à 10 millisecondes, la période de repos à 40 millisecondes, le cycle à 20, et la répétition à 20. Changez le mode laser en logique transistor et confirmez que les impulsions lumineuses sont émises par la fibre contrôlée par le régulateur de motifs.Connectez l’électrode implantée et l’adaptateur de câble, puis couvrez la jonction avec le matériel imperméable à la lumière pour empêcher la fuite de laser. Et lorsque le laser est prêt, déplacez les souris vers la chambre expérimentale pour l’enregistrement EEG/EMG. Pour évaluer la latence à l’éveil du mouvement oculaire non rapide ou du sommeil rapide de mouvement d’oeil, limitez le temps d’enregistrement et le temps optimisé de gain de site et laissez les souris se déplacer librement dans la chambre expérimentale pendant au moins une heure.Pendant la période expérimentale, surveillez les signaux EEG et EMG dans le même écran d’enregistrement. Évaluez l’état de la souris comme l’éveil, le sommeil non rapide de mouvement d’oeil, ou le sommeil rapide de mouvement d’oeil utilisant le contrôle de gain pour chaque vague pour la facilité de distinguer chaque état. Pour mesurer le sommeil non rapide de mouvement d’oeil à la latence d’éveil, observez le sommeil stable non rapide de mouvement d’oeil pendant 40 secondes, puis allumez le générateur de modèle pour la stimulation de photo et confirmez l’émission de laser aux fibres optiques implantées.Enregistrez ensuite les signaux EEG/EMG jusqu’à ce que l’état du sommeil change en éveil. Ici, des traces d’EEG/EMG représentées avant et après la stimulation de photo pendant le sommeil non rapide de mouvement d’oeil sont montrées. Un EEG à haute tension et à fréquence lente, sans signaux EMG, représente un sommeil non rapide du mouvement oculaire.La stimulation photo a déclenché une transition aiguë à l’éveil environ deux secondes après stimulation dans channelrhodopsin-2 exprimant des souris tandis que les souris témoins n’ont pas démontré cette transition, suggérant que l’excitation des neurones de GABA de BNST pendant le sommeil non rapide de mouvement d’oeil déclenche une induction rapide de l’éveil. Inversement, la stimulation photo pendant le sommeil rapide de mouvement d’oeil n’a eu aucun effet ainsi un effet de transition a seulement émergé dans le sommeil non rapide de mouvement d’oeil. Il est important de prendre soin de coordinations précises pour les étapes d’injection de virus et d’implantation de fibres optiques.Les traces EEG/EMG capturées au cours de l’analyse du sommeil peuvent être utilisées pour évaluer les conséquences de la manipulation de la photo sur les différents états vigilants chez la souris. Cette technique nous aidera également à identifier d’autres composants et circuits impliqués dans la régulation des états d’éveil du sommeil. Utilisez des lunettes de protection pour éviter les dommages au laser à l’œil et assurez-vous de toujours autoclave stériliser le récipient vecteur de virus associé à l’adéno après utilisation.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Formation extinction pendant la fenêtre Reconsolidation empêche la récupération de la peur

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Recherche

Neurosciences

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l&#39;activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Méthodes d&#39;enregistrement multi-unités pour caractériser l&#39;activité neuronale dans le Criquet (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt; Circuits olfactifs)

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation de l&#39;activité neuronale avec illumination laser à semi-intactes<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogénétiques Dissection de circuits Peur en tranches cérébrales

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic entraînement des Oscillations thêta hippocampique en comportement des souris

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Disruption of Frontal Lobe Neural Synchrony During Cognitive Control by Alcohol Intoxication

Perturbation du Lobe Frontal synchronie neuronale au cours du contrôle cognitif par l’intoxication alcoolique

Decision making relies on dynamic interactions of distributed, primarily frontal brain regions. Extensive evidence from functional magnetic resonance ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

La détection de 5-Hydroxymethylcytosine dans les cellules souches neurales et le cerveau des souris

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Measuring Neural Mechanisms Underlying Sleep-Dependent Memory Consolidation During Naps in Early Childhood

Mesure des mécanismes neuronaux sous-jacents à la consolidation de la mémoire dépendante du sommeil pendant les naps dans la petite enfance

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less ...