Name: optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dal Merck Investigator Studies Program (#54843), da un KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.) e da un KAKENHI Grant-in-Aid for Exploratory Research on Innovative Areas (T.S.) (18H02595).

Tutti gli esperimenti qui sono stati approvati dal Comitato per l'esperimento e l'uso degli animali dell'Università di Tsukuba, nel rispetto delle linee guida NIH.
1. Chirurgia animale, iniezione di virus, elettrodo per EEG/EMG e impianto in fibra ottica
ATTENZIONE: Occorre selezionare adeguate tecniche di protezione e manipolazione in base al livello di biosicurezza del virus da utilizzare. AAV deve essere utilizzato in una stanza isolata co...

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	<li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder:+Secondary+symptom+or+core+feature?.">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?.</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li><li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity.">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li><li>Mellman, T. 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A., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overshadowed+by+the+amygdala:+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+emerges+as+key+to+psychiatric+disorders.">Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders.</a> Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+and+proliferation+of+intermediate+progenitors+of+GABAergic+neurons+in+the+mouse+telencephalon.">Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon.</a> Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).</li><li>Tye, K. 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S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).</li><li>Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optogenetics+with+complementary+methodologies+in+systems+neuroscience.">Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).</li><li>Saito, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+in+the+preoptic+area+send+direct+inhibitory+projections+to+orexin+neurons.">GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li><li>Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+GABAergic+neurons+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+triggers+immediate+transition+from+non-rapid+eye+movement+sleep+to+wakefulness+in+mice.">Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice.</a> Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).</li><li>Lin, F., Pichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+neurons:+tools,+applications,+and+experimental+constraints.">Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints.</a> Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O&#8217;Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li></ol>

Abbiamo presentato un metodo per valutare l'effetto della stimolazione optogenetica dei neuroni con particolari identità chimiche sulle transizioni di stato del sonno / veglia e ha dato un esempio di manipolazione dei neuroni GABABNST. I nostri dati hanno mostrato che l'eccitazione optogenetica dei neuroni GABABNST si traduce in transizione immediata dal sonno NREM alla veglia.
Vari progetti sperimentali sono disponibili a causa dello sviluppo di numerosi tipi di strumen...

Il sonno è essenziale per una funzione cognitiva ottimale. Recenti scoperte suggeriscono anche che i disturbi nel sonno sono associati a una vasta gamma di malattie1,2,3. Anche se le funzioni del sonno sono ancora in gran parte irrisolte, progressi sostanziali sono stati fatti di recente nella comprensione dei circuiti neurali e dei meccanismi che controllano il sonno / veglia stati4. Nei mammiferi, ci sono tre stati di vigilanza: veglia, sonno non rapido degli occhi (NREM), e rapido movimento degli occhi (REM) sonno. La Veglia è caratterizzata da oscillazioni EEG veloci (5-12 Hz) di bassa ampiezza con un'attività motoria mirata e sostenuta. Il sonno NREM è definito da oscillazioni lente (1-4 Hz) di alta ampiezza (onde delta), con mancanza di coscienza e attività motoria mirata. Il sonno REM è caratterizzato da oscillazioni relativamente veloci (6-12 Hz) di bassa ampiezza e atonia muscolare bilaterale quasi completa5.
Borbely ha proposto una teoria della regolazione della veglia del sonno nota come il modello di processo a due6,7. Un processo omeostatico, indicato anche come processo S, rappresenta la pressione del sonno che si accumula durante la veglia e si dissipa durante il sonno. Un altro processo, indicato come processo C, è un processo circadiano, che spiega perché i livelli di vigilanza fluttuano nel ciclo di 24 h. Oltre a questi due processi, fattori allostatici sono anche importanti per la regolazione del sonno/ veglia8,9. I fattori allostatici includono stati nutrizionali ed emozioni. La paura e l'ansia sono di solito accompagnate da un aumento dell'eccitazione insieme alle risposte autonomiche e neuroendocrine10,11,12. Si ritiene che il sistema limbico svolgi un ruolo nella regolazione della paura e dell'ansia, e i meccanismi alla base delle risposte autonome e neuroendocrine sono stati studiati ampiamente, ma il percorso attraverso il quale il sistema limbico influenza gli stati di sonno/veglia non ancora rivelato. Un gran numero di studi recenti che utilizzano opto e farmacogenetica hanno suggerito che i neuroni e i circuiti neuronali che regolano gli stati di sonno/veglia sono distribuiti in tutto il cervello, tra cui cortice, prosencefalo basale, talamo, ipotalamo, e il tronco encefalico. In particolare, i recenti progressi nell'optogenetica ci hanno permesso di stimolare o inibire specifici circuiti neurali in vivo con elevate risoluzioni spaziali e temporali. Questa tecnica permetterà di progredire nella nostra comprensione dei substrati neurali di sonno e veglia, e come gli stati di sonno / veglia sono regolati da processi circadiani, pressione del sonno, e fattori allostatici, tra cui l'emozione. Questo documento ha lo scopo di introdurre come utilizzare la manipolazione optogenetica combinata con la registrazione sonno/veglia, che potrebbe avere il potenziale per aggiornare la nostra comprensione dei connettomi e dei meccanismi nel cervello che svolgono un ruolo nella regolazione del sonno NREM, del sonno REM, e la veglia. La comprensione di questo meccanismo con cui il sistema limbico regola gli stati di sonno/veglia è di fondamentale importanza per la salute, perché l'insonnia è di solito associata all'ansia o alla paura di non riuscire a dormire (somnifobia).
Si ritiene che il BNST svolgga un ruolo essenziale nell'ansia e nella paura. GAD 67-esprimendo neuroni GABAergic sono una popolazione maggiore del BNST12,13. Abbiamo esaminato l'effetto della manipolazione optogenetica di questi neuroni (GABABNST) sugli stati di sonno/ veglia. Uno dei più grandi progressi nelle neuroscienze negli ultimi anni sono stati i metodi che consentono la manipolazione di neuroni con particolari identità chimiche in vivo, con alte risoluzioni spaziali e temporali. L'optogenetica è molto utile per dimostrare i collegamenti causali tra l'attività neurale e le risposte comportamentali specifiche14. Descriviamo l'optogenetica come un metodo per esaminare la connettività funzionale dei circuiti neurali definiti nella regolazione degli stati di sonno/veglia. Utilizzando questa tecnica, sono stati compiuti grandi progressi nella comprensione dei circuiti neuronali che regolano gli stati di sonno/veglia15,16,17,18,19 . In molti casi, gli opsin sono specificamente introdotti nei neuroni con particolari identità chimiche nelle regioni cerebrali selettive da una combinazione di topi Cre-driver e trasferimento genico mediato da Cre-inducible AAV. Inoltre, l'espressione focale di opsine fotosensibili come la channelrhodopsin 2 (ChR2)20 o l'archeerhodopsin (ArchT)21 combinata con un sistema Cre-loxP o Flp-FRT ci permette di manipolare una popolazione neuronale selettiva e specifica percorso neurale22.
Descriviamo qui esperimenti sui neuroni GABAergici nel BNST come esempio. Per esprimere le operazioni in una popolazione neuronale designata, i topi del conducente Cre appropriati e i vettori del virus dipendenti dal Cre sono più frequentemente utilizzati. Sono utili anche linee transgeniche o knock-in in cui le opsine sono espresse in particolari popolazioni neuronali. Nei seguenti esperimenti, abbiamo usato i topi Knock-in GAD67-Cre 23 in cui solo i neuroni GABAergici esprimono la Ricombinani Cre con un background genetico C57BL/6J e un vettore AAV che contiene ChR2 (hChR2 H134R) fuso con EYFP o EYFP come controllo con un interruttore "FLEx (Flip-excision)"24. La procedura descrive specificamente l'eccitazione optogenetica dei neuroni GABAergici nel BNST durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1180px;" width="1180">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">1x1 Fiber-optic Rotary Joints</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td style="width:177px;">FRJ 1x1 FC-FC</td>
			<td style="width:437px;">for optogenetics</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin header</td>
			<td style="width:191px;">KEL corporation</td>
			<td style="width:177px;">DSP02-006-431G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin socket</td>
			<td style="width:191px;">Hirose</td>
			<td style="width:177px;">21602X3GSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">A/D converter</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>3.70&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>5.82&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Fuji film</td>
			<td style="width:177px;">014-23302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Amplifier</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Muromachi</td>
			<td style="width:177px;">MK-AT-210D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Automatic injecter</td>
			<td style="width:191px;">KD scientific</td>
			<td style="width:177px;">780311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Carbide cutter</td>
			<td style="width:191px;">Minitor</td>
			<td style="width:177px;">B1055</td>
			<td>&#966;0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Cyanoacrylate adhesion&#160; (Aron alpha A) and acceleration</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#30533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Dental curing light</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">Elipar S10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Epoxy adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#04888</td>
			<td>insulation around the solder of 6-pin and shielded cable</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Fiber optic patch cord (branching)</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Gad67-Cre mice</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Kenji Sakimura</td>
			<td></td>
			<td>Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>65461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:191px;">FOREDOM</td>
			<td style="width:177px;">K.1070</td>
			<td>Used with carbide cutter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Interconnecting sleeve</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>ADAF1</td>
			<td>&#966;2.5 mm Ceramic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:191px;">Pfizer</td>
			<td>871119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Rapp OptoElectronic</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>473nm wave length</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser intesity checker</td>
			<td style="width:191px;">COHERENT</td>
			<td style="width:177px;">1098293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser stimulator</td>
			<td style="width:191px;">Bio research center</td>
			<td style="width:177px;">STO2</td>
			<td>reffered as pulse generator in text</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Optic fiber with ferrule&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV2-rh10</td>
			<td style="width:191px;">provided by PennVector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">Addgene</td>
			<td>plasimid # 20296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Karl Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Patch cord</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>D202-9089-0.4</td>
			<td>0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pHelper</td>
			<td style="width:191px;">Stratagene</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Photocurable dental cement</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">56846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Serafin clamp</td>
			<td style="width:191px;">Stoelting</td>
			<td style="width:177px;">52120-43P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Shielded cable</td>
			<td style="width:191px;">mogami</td>
			<td style="width:177px;">W2780</td>
			<td>Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep recording chamber</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td style="width:437px;">Custum-made (21cm&#215; 29cm &#215; 19cm) with water tank holder</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep sign software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Slip ring</td>
			<td style="width:191px;">neuroscience,inc</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless screw</td>
			<td style="width:191px;">Yamazaki</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>&#966;1.0 x 2.0</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless wire</td>
			<td style="width:191px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:177px;">AS633</td>
			<td>&#160;0.0130 inch diameter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stereotaxic frame with digital console</td>
			<td style="width:191px;">Koph</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Model 940</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Vital recorder software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice

Negli ultimi anni, l'optogenetica è stata ampiamente utilizzata in molti campi della ricerca neuroscientifica. In molti casi, un'opsina, come la rodopsina di canale 2 (ChR2), è espressa da un vettore di virus in un particolare tipo di cellule neuronali in vari topi Cre-driver. L'attivazione di queste operazioni è innescata dall'applicazione di impulsi di luce che vengono forniti da laser o LED attraverso cavi ottici, e l'effetto dell'attivazione è osservato con una risoluzione temporale molto alta. Gli sperimentatori sono in grado di stimolare acutamente i neuroni durante il monitoraggio del comportamento o di un altro risultato fisiologico nei topi. L'optogenetica può consentire strategie utili per valutare la funzione dei circuiti neuronali nella regolazione degli stati di sonno/veglia nei topi. Qui descriviamo una tecnica per esaminare l'effetto della manipolazione optogenetica dei neuroni con una specifica identità chimica durante l'elettroencefalogramma (EEG) e il monitoraggio dell'elettromiogramma (EMG) per valutare lo stadio del sonno dei topi. Ad esempio, descriviamo la manipolazione dei neuroni GABAergici nel nucleo del letto della stria terminalis (BNST). L'eccitazione optogenetica acuta di questi neuroni innesca una rapida transizione alla veglia quando applicata durante il sonno NREM. La manipolazione optogenetica insieme alla registrazione EEG/EMG può essere applicata per decifrare i circuiti neuronali che regolano gli stati di sonno/ veglia.

Il presente studio ha mostrato l'effetto dell'eccitazione optogenetica dei neuroni GABABNST sulla transizione dello stato del sonno. ChR2-EYFP è stato espresso focalmente nei neuroni GABA nel BNST. Uno studio istochimico di ibridazione in situ ha mostrato che ChR2-EYFP è stato colocalizzato nei neuroni che esprimono segnali mRNA GAD 67, indicando che questi sono neuroni GABAergic. I campioni di fette immunoistochimiche hanno confermato la posizione della fibra ottica, la cui ...

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Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

Manipolazione optogenetica dei circuiti neurali durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi

Qui, descriviamo i metodi di manipolazione optogenetica di particolari tipi di neuroni durante il monitoraggio degli stati di sonno/veglia nei topi, presentando il nostro recente lavoro sul nucleo del letto della stria terminale come esempio.

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Questa procedura può aiutarci a identificare la funzione di specifico circuito neurologico che sono coinvolti nella regolazione della veglia del sonno con manipolazione meno invasiva e alta risoluzione temporale. Questo metodo ci consente la superficie di monitoraggio EEG in tempo reale in combinazione con la manipolazione di uno specifico circuito neurologico per esaminare la relazione causale tra circuiti e stati di veglia del sonno. Shota Kodani dimostrerà la procedura.Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi, applicare un unguento agli occhi dell'animale e utilizzare le barre dell'orecchio e il perno del naso all'apparato stereotattico per stabilizzare la testa del mouse anestetizzato su un cuscinetto assorbente. Quando la testa è fissata in posizione, fare un'incisione medio-sagittale nel cuoio capelluto per confermare che l'intersezione tra la sutura sagittalis e la sutura coronalis o sutura lambdoidea si trova in una linea orizzontale allo stesso livello. Per evitare uno spazio di posizionamento, regolare il pizzicamento del naso e le barre dell'orecchio in base alle esigenze.Quindi l'uso di morsetti serafin per tenere aperta la pelle disinfetta la superficie esposta del cranio per consentire una visualizzazione più chiara delle suture cranici. Per iniettare il vettore virale adeno-associato, caricare una siringa sterilizzata a etanolo da 10 millilitro con due microlitri di olio minerale, seguita dal volume sperimentale del virus da iniettare. Utilizzare la pompa di microiniezione per regolare la punta dell'ago di microiniezione sul bregma e annotare le coordinate come punto di origine.Quindi spostare la punta nel sito di iniezione designato e posizionare la punta dell'ago sulla posizione. Contrassegnare il cranio nel sito di iniezione e utilizzare un trapano dentale dotato di una fresa in carburo da 0,7 millimetri per praticare un foro di circa due millimetri di diametro nel cranio. Dopo aver rimosso il sangue da tutto il foro con un batuffolo di cotone, spostare lentamente l'ago nel nucleo del letto della stria terminalis o BSNT e iniettare lentamente il volume designato della soluzione virale.Quindi lasciare l'ago in posizione per cinque minuti per consentire alla soluzione di infiltrarsi sufficientemente nel tessuto BNST prima di ritrarre accuratamente l'ago. Per l'elettroencefalogramma, o EEG, e l'elettromiogramma, o EMG, impianto di elettrodi, prima saldare due fili di acciaio inossidabile da cui è stato rimosso un millimetro di isolamento da entrambe le estremità agli elettrodi EMG e posizionare il centro degli elettrodi sul bregma. Quindi contrassegnare la posizione per ogni elettrodo EEG.Per determinare la posizione dell'impianto in fibra ottica, attaccare un ferrule in fibra ottica al manipolatore e ruotare il braccio manipolatore su un angolo più o meno di 30 gradi rispetto a una linea orizzontale. Metti la punta della fibra sul bregma e registra le coordinate. Spostare la punta sulla linea di inserimento mirata e contrassegnare la posizione sul cranio e la posizione per la vite di ancoraggio accanto al sito di inserimento.Utilizzare il trapano dentale per forare il cranio in ogni sito e utilizzare il manipolatore per inserire delicatamente la fibra ottica fino a raggiungere il BNST. Il ferrule dovrebbe poggiare sul cranio rimanente. Fissare la fibra al cranio con una vite di ancoraggio, facendo attenzione a non rompere la dura o danneggiare alcun tessuto.Quindi coprire la fibra e avvitare con cemento dentale foto-polimerizzabile. Successivamente, praticare fori per elettrodi EEG/EMG e inserire la punta del primo elettrodo in un unico foro. Tenendo l'impianto con una mano, applicare l'adesivo cianoacrilato nello spazio tra il cranio e l'elettrodo e inserire l'elettrodo per il resto del percorso, facendo attenzione a non danneggiare alcun tessuto.Una volta posizionati tutti gli elettrodi, coprire la circonferenza degli elettrodi e delle fibre ottiche con adesivo cianoacrilato aggiuntivo e accelerante cianoacrilato per evitare di causare interruzioni al ferrule al cavo ottico e all'elettrodo per condurre zone di collegamento del filo. Ora esponi i muscoli del collo e inserisci i fili per l'elettrodo EMG sotto il muscolo. Regolare la lunghezza dell'elettrodo EMG in modo che si adatti appena sotto i muscoli nucali e riempire gli impianti con più adesivo cianoacrilato e accelerante.Quindi posizionare il mouse su un riscaldatore con monitoraggio fino a completa ricompensa. Per il monitoraggio EEG/EMG durante la foto-eccitazione di neuroni mirati, utilizzare prima uno scalare per regolare l'intensità del laser e utilizzare un ferrule per intere la punta del cavo laser a una fibra ottica inutilizzata. Verificare che non vi sia spazio alla giunzione tra la fibra e il cavo.Dopo 20 minuti, emetti il laser riscaldato al controllo dell'intensità e regola l'intensità a 10 milliwatt per millimetro al quadrato. Impostare la durata dell'impulso luminoso su 10 millisecondi, il periodo di riposo su 40 millisecondi, il ciclo su 20 e la ripetizione su 20. Cambiare la modalità laser in logica transistor e confermare che gli impulsi di luce vengono emessi dalla fibra controllata dal regolatore di pattern.Collegare l'elettrodo impiantato e l'adattatore per cavi, quindi coprire la giunzione con materiale impermeabile leggero per evitare perdite laser. E quando il laser è pronto, spostare i topi nella camera sperimentale per la registrazione EEG / EMG. Per valutare la latenza alla veglia da movimenti oculari non rapidi o sonno rapido del movimento degli occhi, limitare il tempo di registrazione e ottimizzare il tempo di guadagno del sito e lasciare che i topi si muovano liberamente nella camera sperimentale per almeno un'ora.Durante il periodo sperimentale, monitorare i segnali EEG ed EMG nella stessa schermata di registrazione. Valuta lo stato del mouse come veglia, sonno non rapido del movimento degli occhi o sonno rapido del movimento degli occhi usando il controllo del guadagno per ogni onda per facilitare la distinzione di ogni stato. Per la misurazione del sonno di movimento oculare non rapido alla latenza di veglia, osservare il sonno stabile non rapido del movimento degli occhi per 40 secondi, quindi accendere il generatore di modelli per la stimolazione fotografica e confermare l'emissione laser alle fibre ottiche impiantate.Quindi registrare i segnali EEG/EMG fino a quando lo stato di sospensione non cambia in veglia. Qui sono rappresentate tracce EEG / EMG prima e dopo la stimolazione fotografica durante il sonno non rapido del movimento degli occhi. Un EEG ad alta tensione e a bassa frequenza senza segnali EMG, rappresenta un sonno di movimento degli occhi non rapido.La stimolazione fotografica ha innescato una transizione acuta alla veglia circa due secondi dopo la stimolazione nei topi che esprimono la channelrhodopsin-2 mentre i topi di controllo non hanno dimostrato questa transizione, suggerendo che l'eccitazione dei neuroni BNST GABA durante il sonno non rapido del movimento degli occhi innesca una rapida induzione della veglia. Al contrario, la stimolazione fotografica durante il sonno rapido del movimento degli occhi non ha avuto alcun effetto, quindi un effetto di transizione è emerso solo nel sonno non rapido del movimento degli occhi. È importante prestare attenzione a coordinazioni precise per le fasi di iniezione del virus e impianto in fibra ottica.Le tracce EEG/EMG catturate durante l'analisi del sonno possono essere utilizzate per valutare le conseguenze della manipolazione fotografica sui diversi stati vigilanti nei topi. Questa tecnica ci aiuterà anche a identificare altri componenti e circuiti coinvolti nella regolazione degli stati di veglia del sonno. Utilizzare occhiali protettivi per evitare danni laser all'occhio e assicurarsi di sterilizzare sempre il contenitore vettoriale del virus adeno-associato dopo l'uso.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Formazione estinzione durante la finestra di riconsolidamento impedisce il recupero della paura

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Ricerca

Neuroscienze

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

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Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

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In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

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The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

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Optogenetica trascinamenti di teta Hippocampal oscillazioni nel comportarsi topi

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Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

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