Name: optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00
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本研究は、メルク研究者研究プログラム(#54843)、革新的分野に関する科学的研究のためのKAKENHI助成金、ウィルダイナミクス(16H06401)(T.S.)、および革新的分野に関する探索的研究のためのKAKENHI助成金(T.S.)によって支援されました。(18H02595)。

全ての実験は筑波大学動物実験利用委員会の承認を受け、NIHガイドラインに準拠しています。
1. 動物外科、ウイルス注射、脳波/EMG用電極、光ファイバ注入
注意:適切な保護および取り扱い技術は、使用するウイルスのバイオセーフティレベルに基づいて選択されるべきである。AAVは、注射のための隔離されたP1Aグレードの部屋で使?...

<ol>
	<li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder:+Secondary+symptom+or+core+feature?.">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?.</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li><li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity.">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li><li>Mellman, T. 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S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).</li><li>Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optogenetics+with+complementary+methodologies+in+systems+neuroscience.">Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).</li><li>Saito, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+in+the+preoptic+area+send+direct+inhibitory+projections+to+orexin+neurons.">GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. 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S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+neurons:+tools,+applications,+and+experimental+constraints.">Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints.</a> Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O&#8217;Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li></ol>

ここでは、睡眠/覚醒の状態遷移に対する特定の化学的アイデンティティを有するニューロンの光遺伝学的刺激の効果を評価する方法を提示し、GABABNSTニューロンの操作の例を示した。我々のデータは、GABABNSTニューロンの光遺伝学的興奮は、NREM睡眠から覚醒への即時移行をもたらすことを示した。
数多くのタイプの光遺伝学的ツールの開発により、様々?...

睡眠は最適な認知機能に不可欠です。最近の知見はまた、睡眠障害が1、2、3の広範な疾患に関連していることを示唆している。睡眠の機能はまだほとんど未解決ですが、睡眠/覚醒状態4を制御する神経回路とメカニズムを理解する上で、最近大きな進歩が見られます。哺乳類には、覚醒、非急速眼球運動(NREM)睡眠、急速眼球運動(レム)睡眠の3つの警戒状態があります。覚醒度は、目的と持続的な運動活動を有する低振幅の高速EEG振動(5-12 Hz)によって特徴付けられます。NREM睡眠は、意識と意図的な運動活動の欠如と高振幅(デルタ波)の遅い振動(1-4 Hz)によって定義されます。レム睡眠は、低振幅の比較的速い振動(6-12 Hz)とほぼ完全な両側筋アトニア5によって特徴付けられます。
Borbelyは、2つのプロセスモデル6、7として知られている睡眠覚醒調節の理論を提案した。恒静止プロセスは、プロセスSとも呼ばれ、覚醒中に蓄積し、睡眠中に消散する睡眠圧を表します。プロセス C と呼ばれる別のプロセスは概日プロセスであり、24 時間サイクルで警戒レベルが変動する理由を説明します。これら2つのプロセスに加えて、同種化因子は睡眠/覚醒8、9の調節にとっても重要である。同一性因子には栄養状態と感情が含まれる。恐怖と不安は、通常、自律神経および神経内分泌応答10、11、12と共に覚醒の増加を伴う。四肢系は恐怖と不安の調節に役割を果たすと考えられており、自律神経および神経内分泌応答の基礎となるメカニズムは広範囲に研究されているが、四肢系が睡眠/覚醒状態に影響を与える経路は、そうでない。まだ明らかにされていない。光と薬理遺伝学を用いた最近の研究の多くは、睡眠/覚醒状態を調節するニューロンおよびニューロン回路が、皮質、基底前脳、視床下部、視床下部を含む脳全体に分布していることを示唆している。そして脳幹。特に、光遺伝学の最近の進歩により、高い空間的および時間的分解能を持つ特定の神経回路in vivoを刺激または阻害することができました。この技術は、睡眠と覚醒の神経基板の理解の進歩を可能にし、睡眠/覚醒状態は概日プロセス、睡眠圧、感情を含む同種の要因によってどのように調節されるかを理解する。本論文は、NREM睡眠、レム睡眠の調節に役割を果たす脳内のコネクトームやメカニズムに対する理解を新しくする可能性のある、睡眠/覚醒記録と組み合わせた光遺伝学的操作の使用方法を紹介することを目的としています。そして覚醒。不眠症は通常、睡眠不足の不安や睡眠を取ることができない恐れ(ソムフォビア)に関連しているので、四肢系が睡眠/覚醒状態を調節するこのメカニズムの理解は、健康にとって最も重要です。
BNSTは、不安と恐怖に不可欠な役割を果たすと考えられています。GAD 67-発現GABAergicニューロンは、BNST12,13の主要集団である。これらのニューロン(GABABNST)が睡眠/覚醒状態に及ぼす影響を調べた。近年の神経科学の最大の進歩の一つは、高い空間的および時間的分解能を持つ生体内で特定の化学的アイデンティティを持つニューロンの操作を可能にする方法である。光遺伝学は、神経活動と特定の行動応答14との因果関係を実証するために非常に有用である。睡眠/覚醒状態の調節における定義された神経回路の機能的接続性を調べる方法として光遺伝学を説明する。この技術を利用することで、睡眠/覚醒状態を調節する神経回路の理解に大きな進歩が見られた15,16,17,18,19.多くの場合、オプシンは、Cre-driverマウスとクレ誘導性AAV媒介遺伝子伝達遺伝子の組み合わせによって選択的脳領域の特定の化学的アイデンティティを有するニューロンに特異的に導入される。さらに、チャネロドプシン2(ChR2)20またはアルカエルホドプシン(ArchT)21などの光感受性オプシンの焦点発現は、Cre-loxPまたはFlp-FRT系と組み合わせることで、選択的ニューロン集団および特異的な運動を操作することを可能にする。神経経路22.
BNSTにおけるGABAergicニューロンに関する実験を例として説明する.指定されたニューロン集団でオプシンを発現させるには、適切なCreドライバマウスおよびCre依存性ウイルスベクターが最も頻繁に使用される。オプシンが特に神経集団で発現されるトランスジェニックまたはノックインラインも有用である。以下の実験では、GABAergicニューロンのみがC57BL/6J遺伝的背景を有するクレレコンビナーゼを発現するGAD67-Creノックインマウス23と、EFPまたはEYFPと融合したChR2(hChR2 H134R)を含むAAVベクターを対照として用いた。「FLEx(フリップ切除)スイッチ」24を使用します。手順は、具体的に睡眠/覚醒状態25のモニタリング中にBNSTにおけるGABAergicニューロンの光遺伝学的興奮を説明する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1180px;" width="1180">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">1x1 Fiber-optic Rotary Joints</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td style="width:177px;">FRJ 1x1 FC-FC</td>
			<td style="width:437px;">for optogenetics</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin header</td>
			<td style="width:191px;">KEL corporation</td>
			<td style="width:177px;">DSP02-006-431G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin socket</td>
			<td style="width:191px;">Hirose</td>
			<td style="width:177px;">21602X3GSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">A/D converter</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>3.70&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>5.82&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Fuji film</td>
			<td style="width:177px;">014-23302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Amplifier</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Muromachi</td>
			<td style="width:177px;">MK-AT-210D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Automatic injecter</td>
			<td style="width:191px;">KD scientific</td>
			<td style="width:177px;">780311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Carbide cutter</td>
			<td style="width:191px;">Minitor</td>
			<td style="width:177px;">B1055</td>
			<td>&#966;0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Cyanoacrylate adhesion&#160; (Aron alpha A) and acceleration</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#30533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Dental curing light</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">Elipar S10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Epoxy adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#04888</td>
			<td>insulation around the solder of 6-pin and shielded cable</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Fiber optic patch cord (branching)</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Gad67-Cre mice</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Kenji Sakimura</td>
			<td></td>
			<td>Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>65461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:191px;">FOREDOM</td>
			<td style="width:177px;">K.1070</td>
			<td>Used with carbide cutter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Interconnecting sleeve</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>ADAF1</td>
			<td>&#966;2.5 mm Ceramic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:191px;">Pfizer</td>
			<td>871119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Rapp OptoElectronic</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>473nm wave length</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser intesity checker</td>
			<td style="width:191px;">COHERENT</td>
			<td style="width:177px;">1098293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser stimulator</td>
			<td style="width:191px;">Bio research center</td>
			<td style="width:177px;">STO2</td>
			<td>reffered as pulse generator in text</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Optic fiber with ferrule&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV2-rh10</td>
			<td style="width:191px;">provided by PennVector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">Addgene</td>
			<td>plasimid # 20296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Karl Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Patch cord</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>D202-9089-0.4</td>
			<td>0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pHelper</td>
			<td style="width:191px;">Stratagene</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Photocurable dental cement</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">56846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Serafin clamp</td>
			<td style="width:191px;">Stoelting</td>
			<td style="width:177px;">52120-43P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Shielded cable</td>
			<td style="width:191px;">mogami</td>
			<td style="width:177px;">W2780</td>
			<td>Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep recording chamber</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td style="width:437px;">Custum-made (21cm&#215; 29cm &#215; 19cm) with water tank holder</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep sign software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Slip ring</td>
			<td style="width:191px;">neuroscience,inc</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless screw</td>
			<td style="width:191px;">Yamazaki</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>&#966;1.0 x 2.0</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless wire</td>
			<td style="width:191px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:177px;">AS633</td>
			<td>&#160;0.0130 inch diameter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stereotaxic frame with digital console</td>
			<td style="width:191px;">Koph</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Model 940</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Vital recorder software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice

近年、光遺伝学は神経科学研究の多くの分野で広く使用されている。多くの場合、チャネルロドプシン2(ChR2)のようなオプシンは、様々なCreドライバマウスにおける特定のタイプの神経細胞におけるウイルスベクターによって発現される。これらのオプシンの活性化は、光学ケーブルを介してレーザーまたはLEDによって送達される光パルスの適用によって引き起こされ、活性化の効果は非常に高い時間分解能で観察される。実験者は、マウスの行動や他の生理学的結果を監視しながら、ニューロンを急性刺激することができる。光遺伝学は、マウスの睡眠/覚醒状態の調節における神経回路の機能を評価するのに有用な戦略を可能にすることができる。ここでは、マウスの睡眠段階を評価するために、脳波計(EEG)および筋電図(EMG)モニタリング中に特定の化学的同一性を有するニューロンの光遺伝学的操作の効果を調べる技術について説明する。一例として、ストリア末端子(BNST)のベッド核におけるGABAergicニューロンの操作について説明する。これらのニューロンの急性光遺伝学的興奮は、NREM睡眠中に適用されたときに覚醒への急速な移行をトリガーします。EEG/EMG記録と共に光遺伝学的操作は、睡眠/覚醒状態を調節する神経回路を解読するために適用することができます。

本研究は、GABABNSTニューロンの光遺伝学的興奮が睡眠状態遷移に及ぼす影響を示した。ChR2-EYFPは、BNSTにおけるGABAニューロンにおいて焦点的に発現した。その中のハイブリダイゼーションヒストケミカル研究では、ChR2-EYFPがGAD 67 mRNAシグナルを発現するニューロンにコローカライズされ、これらはGABAergicニューロンであることを示した。免疫組織化学スライス?...

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Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中の神経回路の光遺伝学的操作

ここでは、マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中に特定のタイプのニューロンを光遺伝学的に操作する方法を説明し、ストリア末端のベッド核に関する最近の研究を例に挙げる。

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

この手順は、侵襲性の低い操作と高い時間分解能で睡眠覚醒調節に関与する特定の神経回路の機能を特定するのに役立ちます。この方法により、特定の神経回路の操作と連携して、モニタリング面EEGをリアルタイムで行い、回路と睡眠覚醒状態の因果関係を調べることができます。コダニ翔太は、この手順を実演する予定です。足の指のピンチに対する応答の欠如を確認した後、動物の目に軟膏を適用し、吸収パッド上の麻酔マウスの頭部を安定させるために立体戦術装置に耳の棒と鼻ピンを使用します。頭部が固定されている場合、頭皮に中矢状切開を行い、縫合性矢状とスチュラ・コロナリスまたはスチュラ・ラムドイエードの交差が同じレベルの水平線であることを確認します。位置ギャップを避けるには、必要に応じて鼻のピンチとイヤーバーを調整します。次にセラフィンクランプを使用して皮膚を開いたホールドに使用して、頭蓋骨の露出面を消毒し、頭蓋縫合をより明確に視覚化できるようにします。アデノ関連ウイルスベクターを注入するには、エタノール殺菌した10ミリリットルのシリンジに2マイクロリットルのミネラルオイルを投入し、続いて注入するウイルスの実験量をロードする。マイクロインジェクションポンプを使用して、マイクロインジェクションニードルの先端をブレグマに調整し、座標を原点としてメモします。次に、指定された注射部位に先端を移動し、針の先端を位置に置きます。注射部位で頭蓋骨をマークし、0.7ミリメートルの炭化カッターを装備した歯科ドリルを使用して、直径約2ミリメートルの穴を頭蓋骨にドリルします。綿棒で穴の周りから血液を除去した後、ゆっくりとストリア末端部またはBSNTのベッド核に針を移動し、ゆっくりとウイルス溶液の指定された量を注入する。その後、慎重に針を引き込む前に、溶液がBNST組織に十分に浸透できるように針を5分間所定の位置に残します。脳波、または脳波、およびEMG、またはEMG、電極注入、最初は、絶縁の1ミリメートルがEMG電極の両端から剥がされ、電極の中心をブレグマに置いた最初の2本のステンレス鋼線をはんだ付けする。次に、各EEG電極の位置をマークします。光ファイバーインプラントの位置を決定するには、マニピュレータに光ファイバーフェルールを取り付け、マニピュレータアームを水平線に対してプラスマイナス30度の角度に回転させます。繊維先端をブレグマに置き、座標を記録します。先端をターゲット挿入行に移動し、頭蓋骨の位置と挿入場所の横にあるアンカーねじの位置をマークします。歯科ドリルを使用して各部位で頭蓋骨を掘削し、マニピュレータを使用して、BNSTの上に達するまで光ファイバーを静かに挿入します。フェルールは残りの頭蓋骨に置く必要があります。繊維をアンカースクリューで頭蓋骨に固定し、硬膜を壊したり、組織を損傷しないように注意してください。その後、光硬化性歯科セメントで繊維とネジをカバーします。次に、EEG/EMG電極用のドリル穴を開け、最初の電極の先端を1つの穴に挿入します。片手でインプラントを保持し、頭蓋骨と電極の間のスペースにシアノクリレート接着剤を塗布し、任意の組織を損傷しないように注意して、残りの方法で電極を挿入します。すべての電極が配置されたら、電極と光ファイバーの周囲を追加のシアノクリレート接着剤とシアノアクリル酸加速剤で覆い、フェルールで光ケーブルと電極に中断を引き起こしてワイヤ接続ゾーンをリードすることを避けます。今度は首の筋肉を露出させ、筋肉の下にEMG電極のためのワイヤーを挿入する。EMG電極の長さを調整して、ニューカル筋肉のすぐ下にフィットし、よりシアノアクリレート接着剤と加速剤でインプラントを満たします。その後、完全な補償まで監視とヒートパッド上にマウスを置きます。標的ニューロンの光励起中の脳脳/EMGモニタリングでは、まずスカラーを使用してレーザー強度を調整し、フェルールを使用してレーザーケーブルの先端を未使用の光ファイバーにつなげます。ファイバとケーブルの接合部にスペースがないことを確認します。20分後、温められたレーザーを強度チェッカーに放出し、1ミリメートルあたり10ミリワットに強度を2乗に調整します。光パルスの持続時間を 10 ミリ秒、残りの期間を 40 ミリ秒、サイクルを 20 に、繰り返しを 20 に設定します。レーザーモードをトランジスタロジックに変更し、パターンレギュレータによって制御されるファイバから光パルスが放出されることを確認します。埋め込まれた電極とケーブルアダプタを接続し、レーザー漏れを防ぐために、光不透過性材料で接合部を覆います。そして、レーザーの準備ができたら、マウスをEEG/EMG記録用の実験室に移動します。非急速眼球運動または急速眼球運動睡眠からの覚醒までの待ち時間を評価するために、記録時間を制限し、最適化された部位の利得時間を制限し、マウスが実験室で少なくとも1時間自由に動くようにする。実験期間中、同じ記録画面でEEGおよびEMG信号を監視します。各状態を区別しやすくするために、各波のゲインコントロールを使用して、マウスの状態を覚醒、非急速な眼球運動睡眠、または急速な眼球運動睡眠として評価します。覚醒遅延に非急速な眼球運動睡眠の測定のために、40秒間、安定した非急速な眼球運動睡眠を観察し、その後、光刺激のためのパターンジェネレータをオンにし、埋め込まれた光ファイバへのレーザー発光を確認します。次に、睡眠状態が覚醒状態に変わるまで、EEG/EMG 信号を記録します。ここでは、非急速眼球運動睡眠中の写真刺激前後のEEG/EMGトレースを示した。EMG信号のない高電圧および低速周波数EEGは、眼球運動睡眠を表す。写真刺激は、コントロールマウスがこの移行を実証していない間にマウスを発現するチャネロドプシン-2の刺激の約2秒後に覚醒への急性移行を引き起こし、非急速な眼球運動睡眠中のBNST GABAニューロンの興奮が覚醒の急速な誘導を引き起こすことを示唆した。逆に、急速な眼球運動睡眠中の写真刺激は効果がなかったので、遷移効果は非急速な眼球運動睡眠でのみ出現した。ウイルス注入と光ファイバー注入のステップのための正確な調整に注意することが重要です。睡眠分析中にキャプチャされたEEG/EMGトレースを使用して、マウスの異なる警戒状態における写真操作の結果を評価することができます。この技術は、睡眠覚醒状態の調節に関与する他のコンポーネントや回路を特定するのにも役立ちます。保護ゴーグルを使用して眼へのレーザー損傷を避け、使用後は常にアデノ関連ウイルスベクター容器を殺菌してください。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

再固定ウィンドウの間に絶滅の訓練は恐怖の回復を防ぎ

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

半無傷でレーザー照射による神経活動のOptogeneticの摂動<em&gt;ショウジョウバエ</emイン·モーション&gt;幼虫

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

行動するマウスにおける海馬シータ振動の光同調

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Disruption of Frontal Lobe Neural Synchrony During Cognitive Control by Alcohol Intoxication

アルコール中毒による認知制御期間前頭葉神経同期の中断

Decision making relies on dynamic interactions of distributed, primarily frontal brain regions. Extensive evidence from functional magnetic resonance ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

マウスの神経幹細胞と脳における5-ヒドロキシメチルシトシンの検出

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Measuring Neural Mechanisms Underlying Sleep-Dependent Memory Consolidation During Naps in Early Childhood

幼児期の昼寝中の睡眠依存性記憶統合の基礎となる神経機構の測定

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less ...