Name: optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00
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이 연구는 머크 조사자 연구 프로그램 (#54843), 혁신적인 영역에 대한 과학적 연구를위한 KAKENHI 보조금 지원, "윌다이내믹스"(16H06401) (T.S.), 그리고 혁신적인 영역에 대한 탐사 연구를위한 KAKENHI 그랜트 인 에이드 (T.S.) (18H02595).

이 곳의 모든 실험은 NIH 지침을 준수하여 츠쿠바 대학의 동물 실험 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물 수술, 바이러스 주입, EEG /EMG용 전극 및 광섬유 이식
주의 사항: 적절한 보호 및 취급 기술은 사용할 바이러스의 생체 안전 수준에 따라 선택되어야 합니다. AAV는 주입을 위해 격리된 P1A 등급의 방에서 사용해야 하며, AAV를 운?...

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	<li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder:+Secondary+symptom+or+core+feature?.">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?.</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li><li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity.">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li><li>Mellman, T. 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K., Adhikari, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optogenetics+with+complementary+methodologies+in+systems+neuroscience.">Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).</li><li>Saito, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+in+the+preoptic+area+send+direct+inhibitory+projections+to+orexin+neurons.">GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li><li>Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+GABAergic+neurons+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+triggers+immediate+transition+from+non-rapid+eye+movement+sleep+to+wakefulness+in+mice.">Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice.</a> Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).</li><li>Lin, F., Pichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).</li><li>Wiegert, J. 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우리는 여기에서 잠/각성의 국가 전환에 특정 화학 정체성을 가진 뉴런의 광유전학 자극의 효력을 평가하는 방법을 제시하고 GABABNST 뉴런의 조작의 보기를 주었습니다. 우리의 데이터는 GABABNST 뉴런의 광유전학 적 흥분은 NREM 수면에서 깨어있는 즉각적인 전환을 초래한다는 것을 보여주었습니다.
다양한 실험 설계는 광유전학 적 도구의 수많은 유형의 개발로 ...

수면은 최적의 인지 기능에 필수적입니다. 최근 연구 결과는 또한 수면 장애가 광범위한 질병 1,2,3과관련이 있음을 시사합니다. 수면의 기능은 아직 크게 해결되지 않았지만, 수면/각성 상태를 제어하는 신경 회로 및 메커니즘을 이해하는 데 상당한진전이 최근 이루어졌다 4. 포유류에서는, 경계의 3개의 국가가 있습니다: 깨어, 비 급속한 눈 운동 (NREM) 잠 및 급속한 눈 운동 (REM) 잠. 깨어있는 것은 의도적이고 지속적인 운동 활동과 낮은 진폭의 빠른 EEG 진동 (5-12 Hz)을 특징으로합니다. NREM 수면은 의식 부족과 의도적인 운동 활동으로 높은 진폭 (델타 파)의 느린 진동 (1-4 Hz)에 의해 정의됩니다. REM 수면은 낮은 진폭과 거의 완전한 양측 근육 원반5의 비교적 빠른 진동 (6-12 Hz)을 특징으로합니다.
Borbely는 두 개의 프로세스 모델6,7로알려진 수면 - 깨어 조절의 이론을 제안했다. 프로세스 S라고도 하는 시간성 과정은 깨어 있는 동안 축적되고 수면 중에 사라지는 수면 압력을 나타냅니다. 프로세스 C라고 도하는 또 다른 프로세스는 circadian 프로세스로, 경계 수준이 24 시간 주기에서 변동하는 이유를 설명합니다. 이 두 가지 과정 이외에, 종전성 요인은 또한 수면/각성 조절에 중요하다8,9. 전압적 요인은 영양 상태와 감정을 포함한다. 공포와 불안은 일반적으로 자율 및 신경 내분비 반응과함께 각성의 증가를 동반10,11,12. 변연계는 공포와 불안의 규칙에 있는 역할을 하기 위하여 믿어지고, 자율 및 신경 내분비 반응의 근본적인 기계장치는 광범위하게 공부되었습니다, 그러나 변연계가 잠/각성 상태에 영향을 미치는 통로는 아닙니다 아직 밝혀지지 않았습니다. 광유전학 및 약리유전학을 이용한 최근 연구의 많은 수의 뉴런과 수면/깨어 상태를 조절하는 뉴런 회로가 코르티칼, 기저 전뇌, 시상 하부, 시상 하부, 뇌간. 특히, 광유전학의 최근 발전은 우리가 높은 공간 및 시간적 해상도로 특정 신경 회로 in vivo를 자극하거나 억제할 수 있게 해 주었으며, 그 중에서도 이러한 발전은 우리가 자극하거나 억제할 수 있게 해 주었으며, 그 중에서도 이러한 광유전학은 우리가 자극하거나 억제할 수 있게 해 주어있다. 이 기술은 수 면과 깨어의 신경 기판의 우리의 이해에 진행을 허용 합니다., 그리고 어떻게 수 면/깨어 상태 circadian 프로세스에 의해 조절 됩니다., 수 면 압력, 그리고 감정을 포함 하 여 allostatic 요인. 이 논문은 NREM 수면, REM 수면의 조절에 역할을하는 뇌의 커토머스 및 메커니즘에 대한 우리의 이해를 업데이트 할 수있는 수면 / 각성 기록과 결합 된 광유전학 적 조작을 사용하는 방법을 소개하는 것을 목표로합니다. 그리고 깨어. 불면증은 일반적으로 불안 또는 잠을 잘 수 없는의 두려움과 관련 되어 있기 때문에 변연 성 시스템 수 면/각 성 상태를 조절 하는이 메커니즘의 이해는 건강에 가장 중요 한, (somniphobia).
BNST는 불안과 두려움에 필수적인 역할을 할 것으로 생각됩니다. GAD67-발현 GABAergic 뉴런은 BNST12,13의주요 인구이다. 우리는 수면 / 깨어 상태에 이러한 뉴런 (GABABNST)의광유전학 적 조작의 효과를 조사했다. 최근 몇 년 동안 신경 과학에서 가장 큰 발전 중 하나는 생체 내에서 특정 화학 정체성을 가진 뉴런의 조작을 가능하게하는 방법이었다, 높은 공간 및 시간 적 해상도. 광유전학은 신경 활동과 특정 행동 반응 사이의 인과 관계를 입증하는 데 매우 유용합니다14. 우리는 수면/깨어 상태의 조절에 정의된 신경 회로의 기능적 연결을 검사하는 방법으로 광유전학을 기술합니다. 이 기술을 활용하여 수면/각성 상태를 조절하는 신경 회로를 이해하는 데 큰 진전이 이루어졌습니다15,16,17,18,19 . 많은 경우에, opsins는 Cre-driver 마우스와 Cre-유도성 AAV 매개 유전자 전송의 조합에 의해 선택적 두뇌 지구에 있는 특정 화학 정체성을 가진 뉴런에서 특히 소개됩니다. 또한, 채널로정형신 2(ChR2)20 또는 아카호도신(ArchT)21과 같은 광에 민감한 옵신의 초점 발현을 Cre-loxP 또는 Flp-FRT 시스템과 결합하여 선택적 뉴런 집단 및 특정을 조작할 수 있습니다. 신경 통로22.
우리는 예를 들어 BNST에서 GABAergic 뉴런에 여기 실험을 설명. 지정된 뉴런 집단에서 opsins를 발현하기 위해, 적절한 Cre 드라이버 마우스 및 Cre 의존성 바이러스 벡터가 가장 자주 사용된다. opsins가 특히 신경 인구에서 표현되는 형질 전환 또는 노크 인 선은 또한 유용합니다. 다음 실험에서는 GABAergic 뉴런만이 C57BL/6J 유전적 배경으로 크레조합을 발현하는 GAD67-Cre 노크인 마우스23과 EYFP 또는 EYFP와 융합된 ChR2(hChR2 H134R)를 포함하는 AAV 벡터를 대조군으로 사용했습니다. "FLEx (플립 절제)스위치"24. 절차는 특히 수 면/깨어 상태의 모니터링 하는 동안 BNST에서 GABAergic 뉴런의 optogenetic 여기를 설명25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1180px;" width="1180">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">1x1 Fiber-optic Rotary Joints</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td style="width:177px;">FRJ 1x1 FC-FC</td>
			<td style="width:437px;">for optogenetics</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin header</td>
			<td style="width:191px;">KEL corporation</td>
			<td style="width:177px;">DSP02-006-431G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin socket</td>
			<td style="width:191px;">Hirose</td>
			<td style="width:177px;">21602X3GSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">A/D converter</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>3.70&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>5.82&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Fuji film</td>
			<td style="width:177px;">014-23302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Amplifier</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Muromachi</td>
			<td style="width:177px;">MK-AT-210D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Automatic injecter</td>
			<td style="width:191px;">KD scientific</td>
			<td style="width:177px;">780311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Carbide cutter</td>
			<td style="width:191px;">Minitor</td>
			<td style="width:177px;">B1055</td>
			<td>&#966;0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Cyanoacrylate adhesion&#160; (Aron alpha A) and acceleration</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#30533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Dental curing light</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">Elipar S10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Epoxy adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#04888</td>
			<td>insulation around the solder of 6-pin and shielded cable</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Fiber optic patch cord (branching)</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Gad67-Cre mice</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Kenji Sakimura</td>
			<td></td>
			<td>Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>65461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:191px;">FOREDOM</td>
			<td style="width:177px;">K.1070</td>
			<td>Used with carbide cutter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Interconnecting sleeve</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>ADAF1</td>
			<td>&#966;2.5 mm Ceramic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:191px;">Pfizer</td>
			<td>871119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Rapp OptoElectronic</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>473nm wave length</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser intesity checker</td>
			<td style="width:191px;">COHERENT</td>
			<td style="width:177px;">1098293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser stimulator</td>
			<td style="width:191px;">Bio research center</td>
			<td style="width:177px;">STO2</td>
			<td>reffered as pulse generator in text</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Optic fiber with ferrule&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV2-rh10</td>
			<td style="width:191px;">provided by PennVector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">Addgene</td>
			<td>plasimid # 20296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Karl Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Patch cord</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>D202-9089-0.4</td>
			<td>0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pHelper</td>
			<td style="width:191px;">Stratagene</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Photocurable dental cement</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">56846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Serafin clamp</td>
			<td style="width:191px;">Stoelting</td>
			<td style="width:177px;">52120-43P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Shielded cable</td>
			<td style="width:191px;">mogami</td>
			<td style="width:177px;">W2780</td>
			<td>Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep recording chamber</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td style="width:437px;">Custum-made (21cm&#215; 29cm &#215; 19cm) with water tank holder</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep sign software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Slip ring</td>
			<td style="width:191px;">neuroscience,inc</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless screw</td>
			<td style="width:191px;">Yamazaki</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>&#966;1.0 x 2.0</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless wire</td>
			<td style="width:191px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:177px;">AS633</td>
			<td>&#160;0.0130 inch diameter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stereotaxic frame with digital console</td>
			<td style="width:191px;">Koph</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Model 940</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Vital recorder software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice

최근 몇 년 동안, 광유전학널리 신경 과학 연구의 많은 분야에서 사용되어왔다. 많은 경우에, 채널 로독신 2(ChR2)와 같은 opsin은 다양한 Cre-driver 마우스에서 특정 유형의 뉴런 세포에서 바이러스 벡터에 의해 발현된다. 이러한 opsins의 활성화는 광학 케이블을 통해 레이저 또는 LED에 의해 전달되는 광 펄스의 응용 프로그램에 의해 트리거되며, 활성화의 효과는 매우 높은 시간 해상도로 관찰된다. 실험자는 쥐에 있는 행동 또는 다른 생리적인 결과를 감시하는 동안 신경세포를 급격하게 자극할 수 있습니다. 광유전학은 마우스에 있는 잠/각성 상태의 규칙에 있는 신경 회로의 기능을 평가하는 유용한 전략을 가능하게 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 마우스의 수면 단계를 평가하기 위하여 뇌전도 (EEG) 및 근전도 (EMG) 감시 도중 특정 화학 동일성을 가진 뉴런의 광유전학 조작의 효력을 검토하기 위한 기술을 기술합니다. 일례로, 우리는 줄무늬 말단의 침대 핵에 있는 GABAergic 뉴런의 조작을 기술합니다 (BNST). 이러한 뉴런의 급성 광유전학적 흥분은 NREM 수면 중에 적용될 때 깨어있는 것으로 급속한 전이를 유발합니다. EEG/EMG 기록과 함께 광유전학적 조작은 수면/깨어 상태를 조절하는 신경 회로를 해독하기 위해 적용될 수 있습니다.

본 연구는 수면 상태 전환에 GABABNST 뉴런의 광유전학적 흥분의 효과를 보였다. ChR2-EYFP는 BNST에서 GABA 뉴런에서 국구적으로 발현되었다. 내부 하이브리드화 운동 화학 연구는 ChR2-EYFPGAD 67 mRNA 신호를 발현 하는 뉴런에서 동국화 했다 보여주었다, 이들은 GABAergic 뉴런을 나타내는. 면역성 화학 적 슬라이스 샘플은 BNST25바로 위에있는 광섬유의 위치를 ...

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Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

마우스에서 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학 적 조작

여기에서, 우리는 마우스에 있는 잠/각성 상태의 감시 도중 뉴런의 특정 모형의 광유전학 조작의 방법을 기술합니다, 예를 들면 stria 말단의 침대 핵에 우리의 최근 일을 제시하.

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

이 절차는 우리가 덜 침습적 조작과 높은 시간적 해상도와 수면 깨어 조절에 관여하는 특정 신경 회로의 기능을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법을 통해 특정 신경 회로의 조작과 함께 실시간으로 모니터링 표면 EEG를 통해 회로와 수면 깨어 상태 간의 인과 관계를 검사할 수 있습니다. 쇼타 코다니는 절차를 시연할 것입니다.발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 동물의 눈에 연고를 적용하고 흡수 패드에 마취 마우스의 머리를 안정화하기 위해 스테레오 전술 장치에 이어 바 및 코 핀을 사용합니다. 머리가 제자리에 고정되면, 두피에 중간 처진 절개를 하여 수투라 시정과 수구 코로날리스 또는 수투라 람도이트 사이의 교차점이 동일한 수준에서 수평선에 있는지 확인한다. 위치 간격을 피하려면 필요에 따라 코 핀치와 이어 바를 조정합니다.그런 다음 세라핀 클램프를 사용하여 피부를 열어 놓고 두개골의 노출된 표면을 소독하여 두개골 봉합사를 보다 명확하게 시각화할 수 있게 한다. 아데노 관련 바이러스 벡터를 주입하기 위해, 에탄올 살균 10 밀리리터 주사기를 미네랄 오일 의 2마이크로리터로 적재하고, 그 다음에 는 바이러스의 실험적 부피를 주입한다. 미세 주입 펌프를 사용하여 미세 주입 바늘의 끝을 bregma에 조정하고 좌표를 원점으로 주의하십시오.그런 다음 팁을 지정된 주사 부위로 이동하여 바늘 끝을 위치에 놓습니다. 주입 부위에 두개골을 표시하고 0.7 mm 초경 커터가 장착 된 치과 드릴을 사용하여 약 2 밀리미터 직경의 구멍을 두개골에 드릴링하십시오. 면봉으로 구멍 주위에서 혈액을 제거 한 후, 천천히 stria 말단 또는 BSNT의 침대 핵에 바늘을 이동하고 천천히 바이러스 용액의 지정된 볼륨을 주입.그런 다음 바늘을 조심스럽게 철회하기 전에 용액이 BNST 조직에 충분히 침투 할 수 있도록 5 분 동안 바늘을 제자리에 둡니다. 뇌전도, 또는 EEG, 및 전극 이식, 전극 이식, 1mm의 절연이 양쪽 끝에서 EMG 전극으로 제거되어 전극의 중심을 브레그마에 배치하는 두 개의 스테인레스 스틸 와이어를 먼저 납땜한다. 그런 다음 각 EEG 전극의 위치를 표시합니다.광섬유 임플란트의 위치를 결정하기 위해, 광섬유 발효기를 조작기에 부착하고 조판에 대해 30도 각도를 더하거나 뺀 각도로 조작기 암을 회전시킨다. 섬유 팁을 브레그마에 놓고 좌표를 기록합니다. 팁을 표적 삽입 선으로 이동하고 두개골의 위치와 삽입 부위 옆에 있는 앵커 나사의 위치를 표시합니다.치과 드릴을 사용하여 각 부위의 두개골을 드릴링하고 조작기를 사용하여 BNST 위에 도달할 때까지 광섬유를 부드럽게 삽입합니다. 발효는 나머지 두개골에 쉬어야합니다. 두라를 부러뜨리거나 조직을 손상시키지 않도록 주의를 기울여, 앵커 나사로 두개골에 섬유를 고정하십시오.그런 다음 광섬유를 덮고 사진 치료 가능한 치과 시멘트로 나사를 덮습니다. 다음으로, EEG/EMG 전극을 위한 구멍을 뚫고 첫 번째 전극의 끝을 하나의 구멍에 삽입한다. 임플란트를 한 손으로 잡고, 두개골과 전극 사이의 공간에 청응을 적용하고 조직의 손상을 주지 않도록주의하여 나머지 방법으로 전극을 삽입합니다.모든 전극이 배치되면, 추가 적인 시아노아크레이트 접착제 및 시아노아크릴레이트 가속제와 함께 전극및 광섬유의 둘레를 덮어 광케이블및 전극에 대한 ferrule에 중단을 일으키지 않도록 전선 연결 영역을 리드한다. 이제 목 근육을 노출하고 근육 아래에 EMG 전극에 대한 와이어를 삽입합니다. EMG 전극의 길이를 조정하여 핵 근육 바로 아래에 맞고 임플란트를 더 많은 시아노아릴레이트 접착제와 가속으로 채웁니다.그런 다음 마우스를 완전한 보상이 될 때까지 모니터링하여 열 패드에 놓습니다. 표적 뉴런의 사진 엑소시터 동안 EEG/EMG 모니터링의 경우 먼저 스칼라를 사용하여 레이저 강도를 조정하고 레이저 케이블의 끝을 사용하지 않는 광섬유에 밧줄로 묶습니다. 섬유와 케이블 사이의 접합에 공간이 없는지 확인합니다.20분 후, 워밍업된 레이저를 강도 체커에 방출하고 밀리미터 제곱당 10밀리와트로 강도를 조절합니다. 광 펄스 지속 시간을 10밀리초로 설정하고, 나머지 기간은 40밀리초로, 사이클은 20초로, 반복을 20으로 설정합니다. 레이저 모드를 트랜지스터 로직으로 변경하고 패턴 레귤레이터에 의해 제어되는 섬유에서 광 펄스가 방출되는지 확인합니다.이식된 전극과 케이블 어댑터를 연결한 다음, 레이저 누출을 방지하기 위해 가벼운 불투과성 재료로 접합을 덮습니다. 그리고 레이저가 준비되면, EEG/EMG 레코딩을 위한 실험 챔버로 마우스를 이동한다. 비급속 눈 운동 또는 빠른 눈 운동 수면에서 절각을 위한 대기 시간을 평가하기 위해, 기록 시간을 제한하고 최적화된 부위 획득 시간을 제한하고 마우스가 적어도 한 시간 동안 실험 챔버에서 자유롭게 움직일 수 있도록 한다.실험 기간 동안 동일한 기록 화면에서 EEG 및 EMG 신호를 모니터링합니다. 각 상태를 구별하기 쉽기 위해 각 파도에 대한 게인 제어를 사용하여 마우스의 상태를 깨어, 비 급속한 눈 운동 수면 또는 빠른 눈 운동 수면으로 평가합니다. 비급속 눈 운동 수면을 측정하여 절전 모드 대기 시간을 측정하고, 40초 동안 안정적인 비급속 눈 운동 수면을 관찰한 다음, 패턴 생성기를 켜서 사진 자극을 위해 켜고 이식된 광섬유에 레이저 방출을 확인합니다.그런 다음 수면 상태가 깨어날 때까지 EEG/EMG 신호를 기록합니다. 여기서 는 비급속 눈 운동 수면 동안 사진 자극 전후EEG/EMG 흔적을 나타내고 있다. EMG 신호가 없는 고전압 및 느린 주파수 EEG는 비빠른 눈 이동 수면을 나타냅니다.사진 자극은 제어 마우스가 이 전이를 보여주지 않는 동안 channelrhodopsin-2 표현 마우스에 있는 자극 후에 대략 2 초 후에 깨어에 심각한 전환을 트리거했습니다, 비 급속한 눈 운동 도중 BNST GABA 신경의 흥분이 깨어의 급속한 유도를 트리거한다는 것을 건의합니다. 반대로, 급속한 눈 운동 수면 중 사진 자극은 효과가 없었기 때문에 비급속 눈 운동 수면에서만 전환 효과가 나타났습니다. 바이러스 주입 및 광섬유 이식 단계에 대한 정밀한 조정에 주의를 기울이는 것이 중요합니다.수면 분석 중에 포착된 EEG/EMG 추적은 마우스의 다른 경계 상태에 대한 사진 조작의 결과를 평가하는 데 사용될 수 있다. 이 기술은 또한 우리가 수면 깨어 상태를 조절에 관여하는 그밖 분대 및 회로를 확인하는 것을 도울 것입니다. 보호 고글을 사용하여 눈에 레이저 손상을 방지하고 사용 후 아데노 관련 바이러스 벡터 용기를 항상 자동 복제해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Reconsolidation 창 동안 멸종 교육은 두려움의 복구를 방지

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

연구

신경과학

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

동시 Electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 Neuronal 활동 Optogenetic 조작의 실시간 측정

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동<em&gt; 초파리</em모션&gt; 유충

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Disruption of Frontal Lobe Neural Synchrony During Cognitive Control by Alcohol Intoxication

알코올 중독 인지에 관한 컨트롤 중 전 두 엽 신경 Synchrony의 중단

Decision making relies on dynamic interactions of distributed, primarily frontal brain regions. Extensive evidence from functional magnetic resonance ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

신경 줄기 세포와 쥐의 뇌에서 5-하이드록시메틸시토신의 검출

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Measuring Neural Mechanisms Underlying Sleep-Dependent Memory Consolidation During Naps in Early Childhood

초기 유년기에 낮잠 중 수면 의존적 기억 통합의 근본적인 신경 메커니즘 측정

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less ...