Name: optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Denne studien ble støttet av Merck etterforsker Studies Program (#54843), en KAKENHI Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på innovative områder, "WillDynamics" (16H06401) (TS), og en KAKENHI Grant-in-Aid for undersøkende forskning på innovative områder (TS) (18H02595).

Alle eksperimenter her ble godkjent av Animal Experiment og bruk komité ved Universitetet i Tsukuba, i samsvar med NIH retningslinjer.
1. Animal Surgery, virus injeksjon, elektrode for EEG/EMG, og optisk fiber implantation
Forsiktig: Passende sikringen og handling teknikker burde være valgt basert på det biosafety plan flate av det virus å bli anvendt. AAV skal brukes i en isolert P1A gradert rom for injeksjon, og røret bærer AAV må ste...

<ol>
	<li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder:+Secondary+symptom+or+core+feature?.">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?.</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li><li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity.">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li><li>Mellman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+anxiety+disorders.">Sleep and anxiety disorders.</a> Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).</li><li>Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuitry+of+wakefulness+and+sleep.">Neural circuitry of wakefulness and sleep.</a> Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).</li><li>Chemelli, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Narcolepsy+in+orexin+knockout+mice:+Molecular+genetics+of+sleep+regulation.">Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation.</a> Cell. 98 (4), 437-451 (1999).</li><li>Borb&#233;ly, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two-process+model+of+sleep+regulation:+A+reappraisal.">The two-process model of sleep regulation: A reappraisal.</a> Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).</li><li>Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+human+sleep:+recovery+process+gated+by+a+circadian+pacemaker.">Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).</li><li>Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic,+circadian,+and+emotional+regulation+of+sleep.">Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep.</a> Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).</li><li>Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+state+switching.">Sleep state switching.</a> Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).</li><li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li><li>Tovote, P., Fadok, J. P., L&#252;thi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuits+for+fear+and+anxiety.">Neuronal circuits for fear and anxiety.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).</li><li>Lebow, M. A., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overshadowed+by+the+amygdala:+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+emerges+as+key+to+psychiatric+disorders.">Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders.</a> Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+and+proliferation+of+intermediate+progenitors+of+GABAergic+neurons+in+the+mouse+telencephalon.">Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon.</a> Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+light+on+wakefulness+and+arousal.">Shining light on wakefulness and arousal.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).</li><li>Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+hypocretin-mediated+sleep-to-wake+transitions.">Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).</li><li>Weber, F., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit-based+interrogation+of+sleep+control.">Circuit-based interrogation of sleep control.</a> Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).</li><li>Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+REM+sleep+by+ventral+medulla+GABAergic+neurons.">Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons.</a> Nature. 526, 435-438 (2015).</li><li>Oishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-wave+sleep+is+controlled+by+a+subset+of+nucleus+accumbens+core+neurons+in+mice.">Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).</li><li>Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optogenetics+with+complementary+methodologies+in+systems+neuroscience.">Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).</li><li>Saito, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+in+the+preoptic+area+send+direct+inhibitory+projections+to+orexin+neurons.">GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li><li>Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+GABAergic+neurons+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+triggers+immediate+transition+from+non-rapid+eye+movement+sleep+to+wakefulness+in+mice.">Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice.</a> Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).</li><li>Lin, F., Pichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+neurons:+tools,+applications,+and+experimental+constraints.">Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints.</a> Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O&#8217;Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li></ol>

Vi her presenterte en metode for å evaluere effekten av optogenetic stimulering av neurons med spesielle kjemiske identiteter på statlige overganger av søvn/våkenhet og ga et eksempel på manipulering av GABABNST neurons. Våre data viste at optogenetic eksitasjon av GABABNST neurons resulterer i umiddelbar overgang fra REM søvn til våkenhet.
Ulike eksperimentelle design er tilgjengelig på grunn av utviklingen av mange typer optogenetic verktøy. Det er mulig å ak...

Søvn er viktig for optimal kognitiv funksjon. Nylige funn tyder også på at forstyrrelser i søvn er forbundet med et bredt spekter av sykdommer1,2,3. Selv om funksjonene til søvn er hittil i stor grad uløst, har betydelig fremgang blitt gjort nylig for å forstå de nevrale kretser og mekanismer som styrer søvn/våkenhet stater4. I pattedyr, er det tre tilstander av årvåkenhet: våkenhet, ikke-rask øyebevegelse (REM) søvn, og rask øyebevegelse (REM) søvn. Våkenhet er karakterisert ved rask EEG-svingninger (5-12 Hz) av lav amplitude med målrettet og varig motorisk aktivitet. REM søvn er definert av langsom svingninger (1-4 Hz) av høy amplitude (delta bølger), med mangel på bevissthet og målrettet motorisk aktivitet. REM søvn er preget av relativt rask svingninger (6-12 Hz) av lav amplitude og nesten komplett bilateral muskel atonia5.
Borbely foreslo en teori om søvn-våkenhet regulering kjent som de to prosessmodell6,7. En homøostatisk prosess, også referert til som prosess S, representerer søvn trykk som akkumuleres under våkenhet og avleder under søvn. En annen prosess, referert til som prosess C, er en døgn prosess, noe som forklarer hvorfor årvåkenhet nivåer svinger i 24 h syklus. I tillegg til disse to prosessene, allostatic faktorer er også viktig for regulering av Sleep/våkenhet8,9. Allostatic faktorer inkluderer ernæringsmessige tilstander og følelser. Frykt og angst er vanligvis ledsaget av en økning i opphisselse sammen med autonome og Nevroendokrine svar10,11,12. Den limbiske systemet antas å spille en rolle i regulering av frykt og angst, og mekanismer underliggende autonome og Nevroendokrine responser har blitt studert grundig, men veien som limbiske systemet påvirker søvn/våkenhet stater har ikke ennå ikke blitt avslørt. Et stort antall nyere studier med opto-og farmakogenetikk har antydet at neurons og neuronal kretser som regulerer søvn/våkenhet stater er fordelt over hele hjernen, inkludert barken, basal forebrain, thalamus, hypothalamus, og hjernestammen. Spesielt siste fremskritt i optogenetics har tillatt oss å stimulere eller hemme spesifikke nevrale kretser in vivo med høy romlige og timelige oppløsninger. Denne teknikken vil tillate fremgang i vår forståelse av nevrale underlag av søvn og våkenhet, og hvordan søvn/våkenhet stater er regulert av døgn prosesser, søvn trykk, og allostatic faktorer, inkludert følelser. Dette papiret har som mål å innføre hvordan du bruker optogenetic manipulasjon kombinert med søvn/våkne opptak, som kan ha potensial til å oppdatere vår forståelse av connectomes og mekanismer i hjernen som spiller en rolle i regulering av REM søvn, REM søvn, og våkenhet. Forståelse av denne mekanismen som limbiske systemet regulerer sove/våkenhet statene er av overordnet betydning for helsen, fordi søvnløshet er vanligvis forbundet med angst eller frykt for å ikke kunne sove (somniphobia).
Den BNST er antatt å spille en viktig rolle i angst og frykt. Gad 67-uttrykker GABAergic neurons er en stor befolkning på BNST12,13. Vi undersøkte effekten av optogenetic manipulasjon av disse neurons (GABABNST) på søvn/våkenhet stater. En av de største fremskritt i nevrovitenskap de siste årene har vært metoder som muliggjør manipulering av neurons med spesielle kjemiske identiteter in vivo, med høy romlige og timelige oppløsninger. Optogenetics er svært nyttig for å demonstrere årsakssammenheng mellom neural aktivitet og spesifikke atferdsmessige responser14. Vi beskriver optogenetics som en metode for å undersøke funksjonell tilkobling av definerte nevrale kretser i regulering av søvn/våkenhet stater. Ved å benytte denne teknikken, har stor fremgang er oppnådd i forståelsen av neuronal kretser som regulerer søvn/våkenhet statene15,16,17,18,19 . I mange tilfeller er opsins spesielt innført i neurons med bestemte kjemiske identiteter i selektive hjerneområder av en kombinasjon av grobunn-driver mus og grobunn-induserbart AAV-mediert genoverføring. Videre, fokal uttrykk for foto-sensitive opsins som channelrhodopsin 2 (ChR2)20 eller Archaerhodopsin (ArchT)21 kombinert med en grobunn-LOXP eller FLP-frt systemet tillater oss å manipulere en selektiv neuronal befolkning og spesifikke neural Pathway22.
Vi beskriver her eksperimenter på GABAergic neurons i BNST som et eksempel. For å uttrykke opsins i en utpekt neuronal befolkning, passende grobunn driver mus og grobunn-avhengige virus vektorer er mest brukt. Transgene eller knock-in linjer der opsins uttrykkes spesielt neuronal populasjoner er også nyttig. I de følgende forsøkene, brukte vi GAD67-grobunn knock-i mus23 der bare GABAergic neurons Express GROBUNN recombinase med en C57BL/6J genetisk bakgrunn, og en AAV vektor som inneholder ChR2 (hChR2 H134R) smeltet sammen med EYFP eller EYFP som en kontroll med en "FLEx (flip-forbruker) Switch"24. Prosedyren beskriver spesielt optogenetic eksitasjon av GABAergic neurons i BNST under overvåking av søvn/våkenhet stater25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1180px;" width="1180">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">1x1 Fiber-optic Rotary Joints</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td style="width:177px;">FRJ 1x1 FC-FC</td>
			<td style="width:437px;">for optogenetics</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin header</td>
			<td style="width:191px;">KEL corporation</td>
			<td style="width:177px;">DSP02-006-431G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin socket</td>
			<td style="width:191px;">Hirose</td>
			<td style="width:177px;">21602X3GSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">A/D converter</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>3.70&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>5.82&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Fuji film</td>
			<td style="width:177px;">014-23302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Amplifier</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Muromachi</td>
			<td style="width:177px;">MK-AT-210D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Automatic injecter</td>
			<td style="width:191px;">KD scientific</td>
			<td style="width:177px;">780311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Carbide cutter</td>
			<td style="width:191px;">Minitor</td>
			<td style="width:177px;">B1055</td>
			<td>&#966;0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Cyanoacrylate adhesion&#160; (Aron alpha A) and acceleration</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#30533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Dental curing light</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">Elipar S10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Epoxy adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#04888</td>
			<td>insulation around the solder of 6-pin and shielded cable</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Fiber optic patch cord (branching)</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Gad67-Cre mice</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Kenji Sakimura</td>
			<td></td>
			<td>Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>65461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:191px;">FOREDOM</td>
			<td style="width:177px;">K.1070</td>
			<td>Used with carbide cutter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Interconnecting sleeve</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>ADAF1</td>
			<td>&#966;2.5 mm Ceramic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:191px;">Pfizer</td>
			<td>871119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Rapp OptoElectronic</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>473nm wave length</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser intesity checker</td>
			<td style="width:191px;">COHERENT</td>
			<td style="width:177px;">1098293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser stimulator</td>
			<td style="width:191px;">Bio research center</td>
			<td style="width:177px;">STO2</td>
			<td>reffered as pulse generator in text</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Optic fiber with ferrule&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV2-rh10</td>
			<td style="width:191px;">provided by PennVector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">Addgene</td>
			<td>plasimid # 20296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Karl Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Patch cord</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>D202-9089-0.4</td>
			<td>0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pHelper</td>
			<td style="width:191px;">Stratagene</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Photocurable dental cement</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">56846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Serafin clamp</td>
			<td style="width:191px;">Stoelting</td>
			<td style="width:177px;">52120-43P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Shielded cable</td>
			<td style="width:191px;">mogami</td>
			<td style="width:177px;">W2780</td>
			<td>Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep recording chamber</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td style="width:437px;">Custum-made (21cm&#215; 29cm &#215; 19cm) with water tank holder</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep sign software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Slip ring</td>
			<td style="width:191px;">neuroscience,inc</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless screw</td>
			<td style="width:191px;">Yamazaki</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>&#966;1.0 x 2.0</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless wire</td>
			<td style="width:191px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:177px;">AS633</td>
			<td>&#160;0.0130 inch diameter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stereotaxic frame with digital console</td>
			<td style="width:191px;">Koph</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Model 940</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Vital recorder software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice

I de senere årene har optogenetics vært mye brukt i mange felt av neuroscientific forskning. I mange tilfeller er en opsin, for eksempel kanal rhodopsin 2 (ChR2), uttrykt ved et virus vektor i en bestemt type neuronal celler i ulike grobunn-driver mus. Aktivering av disse opsins utløses ved anvendelse av lyspulser som leveres med laser eller LED gjennom optiske kabler, og effekten av aktiveringen observeres med svært høy tidsoppløsning. Forskere er i stand til å akutt stimulere neurons mens overvåking atferd eller et annet fysiologisk utfall i mus. Optogenetics kan muliggjøre nyttige strategier for å evaluere funksjon av neuronal kretser i regulering av søvn/våkenhet tilstander i mus. Her beskriver vi en teknikk for å undersøke effekten av optogenetic manipulering av neurons med en bestemt kjemisk identitet under Elektroencefalogram (EEG) og electromyogram (EMG) overvåking for å evaluere søvn fasen av mus. Som et eksempel, beskriver vi manipulering av GABAergic neurons i sengen kjernen av stria terminalis (BNST). Akutt optogenetic eksitasjon av disse neurons utløser en rask overgang til våkenhet når den brukes under REM søvn. Optogenetic manipulasjon sammen med EEG/EMG innspillingen kan brukes til å dechiffrere den neuronal kretser som regulerer søvn/våkenhet stater.

Den nåværende studien viste effekten av optogenetic eksitasjon av GABABNST neurons på søvn tilstand overgang. ChR2-EYFP ble fokalt uttrykt i GABA neurons i BNST. En in situ hybridisering histochemical studie viste at ChR2-EYFP var colocalized i neurons uttrykke GAD 67 mRNA signaler, noe som indikerer at disse er GABAergic neurons. Immunhistokjemiske skive prøvene bekreftet plasseringen av optisk fiber, hvis spissen var like over BNST25.
<p class...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

Optogenetic manipulasjon av Neural kretser under overvåking søvn/våkenhet States i mus

Her beskriver vi metoder for optogenetic manipulering av bestemte typer neurons under overvåkning av søvn/våkenhet stater i mus, presentere vårt siste verk på sengen kjernen av stria terminalis som et eksempel.

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Denne prosedyren kan hjelpe oss med å identifisere funksjonen til spesifikk nevrokrets som er involvert i søvnvåkningreguleringen med mindre invasiv manipulasjon og høy temporal oppløsning. Denne metoden tillater oss overvåking overflaten EEG i sanntid i forbindelse med manipulering av en bestemt nevrokrets for å undersøke årsakssammenheng mellom kretser og søvn våkenhet tilstander. Shota Kodani skal demonstrere prosedyren.Etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemmen, bruk salve på dyrets øyne og bruk ørestengene og nesepinnen til det stereotaktiske apparatet for å stabilisere hodet på den bedøvede musen på en absorberende pute. Når hodet er festet i posisjon, gjør en mid-sagittal snitt i hodebunnen for å bekrefte at skjæringspunktet mellom sutura sagittalis og sutura coronalis eller sutura lambdoidea er i en horisontal linje på samme nivå. For å unngå et posisjoneringsgap, juster neseklemmen og ørestengene etter behov.Deretter bruker serafin klemmer til å holde huden åpen desinfisere den eksponerte overflaten av skallen for å gjøre det mulig å visualisere kraniale suturer for å bli visualisert tydeligere. For å injisere den adeno-tilknyttede virusvektoren, last en etanolsterilisert 10 milliliter sprøyte med to mikroliter mineralolje, etterfulgt av det eksperimentelle volumet av virus som skal injiseres. Bruk mikroinjeksjonspumpen til å justere spissen av mikroinjeksjonsnålen på luftmaen og notere koordinatene som opprinnelsessted.Flytt deretter spissen til det angitte injeksjonsstedet og plasser spissen på nålen på posisjonen. Merk skallen på injeksjonsstedet og bruk en tannbor utstyrt med en 0,7 millimeter karbidkutter for å bore et omtrent to millimeter diameter hull i skallen. Etter å ha fjernet blod fra rundt hullet med en bomullspinne, flytt nålen langsomt til sengekjernen i stria terminalis eller BSNT og sakte injisere det angitte volumet av virusoppløsning.La deretter nålen være på plass i fem minutter slik at oppløsningen tilstrekkelig infiltrerer BNST-vevet før du forsiktig trekker nålen tilbake. For elektroencefalogram, eller EEG, og elektromyogram, eller EMG, elektrodeimplantasjon, første lodde to rustfritt stål ledninger hvorfra en millimeter isolasjon har blitt strippet fra begge ender til EMG elektroder og plassere midten av elektrodene på bregma. Merk deretter posisjonen for hver EEG-elektrode.For å bestemme posisjonen til det optiske fiberimplantatet, fest en optisk fiber ferrule til manipulatoren og roter manipulatorarmen til en pluss eller minus 30 graders vinkel mot en horisontal linje. Sett fiberspissen på bregmaen og registrer koordinatene. Flytt spissen til den målrettede innsettingslinjen og merk posisjonen på skallen og posisjonen for ankerskruen ved siden av innsettingsstedet.Bruk tannboret til å bore skallen på hvert sted og bruk manipulatoren til å forsiktig sette inn optisk fiber til den når over BNST. Ferrule bør hvile på de resterende kraniet. Fest fiberen til skallen med en ankerskrue, vær forsiktig så du ikke bryter duraen eller skade noe vev.Dekk deretter fiberen og skruen med fotoherdbar tannsement. Deretter borer du hull til EEG/EMG-elektroder og setter spissen av den første elektroden inn i ett hull. Hold implantatet med den ene hånden, påfør cyanoacrylat lim på rommet mellom skallen og elektroden og sett elektroden resten av veien, ta vare på ikke å skade noe vev.Når alle elektrodene er plassert, dekk omkretsen av elektrodene og optiske fibre med ekstra cyanoacrylate lim og cyanoacrylat akselerator for å unngå å forårsake avbrudd i ferrule til optisk kabel og elektrode til bly wire tilkoblingssoner. Nå utsette nakkemusklene, og sett inn ledningene for EMG elektrode under muskelen. Juster lengden på EMG-elektroden slik at den passer like under nuchalmuskulaturen og fyll implantatene med mer cyanoacrylatlim og akselerator.Plasser deretter musen på en varmepute med overvåking til full kompensasjon. For EEG/EMG-overvåking under fotoutsøtelse av målrettede nevroner, bruk først en skalar til å justere laserintensiteten og bruke en glød for å tether spissen av laserkabelen til en ubrukt optisk fiber. Kontroller at det ikke er plass i krysset mellom fiberen og kabelen.Etter 20 minutter avgir den varmede laseren til intensitetskontrollen og justerer intensiteten til 10 milliwatt per millimeter kvadrert. Sett lyspulsvarighetet til 10 millisekunder, hvileperioden til 40 millisekunder, syklusen til 20, og gjenta til 20. Endre lasermodus til transistor logikk og bekrefte at lyspulser slippes ut fra fiberen kontrollert av mønsterregulatoren.Koble til den implanterte elektroden og kabeladapteren, og dekk deretter krysset med lett ugjennomtrengelig materiale for å forhindre laserlekkasje. Og når laseren er klar, flytt musene til det eksperimentelle kammeret for EEG / EMG-opptak. For å vurdere ventetiden til våkenhet fra ikke-rask øyebevegelse eller rask øyebevegelsessøvn, begrens opptakstiden og optimalisert sted få tid og la musene bevege seg fritt i det eksperimentelle kammeret i minst en time.I løpet av den eksperimentelle perioden overvåker du EEG- og EMG-signalene i samme opptaksskjerm. Evaluer musens tilstand som våkenhet, ikke rask øyebevegelsessøvn eller rask øyebevegelsessøvn ved hjelp av forsterkningskontroll for hver bølge for enkel å skille mellom hver tilstand. For måling av ikke-rask øyebevegelse søvn til våkenhet ventetid, observere stabil ikke rask øyebevegelse søvn i 40 sekunder, deretter slå på mønsteret generator for fotostimulering og bekrefte laserutslipp til implanterte optiske fibre.Deretter registrerer du EEG/EMG-signalene til søvntilstanden endres til våkenhet. Her vises det vist EEG/EMG-spor før og etter fotostimulering under ikke-rask øyebevegelsessøvn. En høy spenning og langsom frekvens EEG uten EMG signaler, representerer ikke rask øyebevegelse søvn.Fotostimulering utløste en akutt overgang til våkenhet omtrent to sekunder etter stimulering i channelrhodopsin-2 som uttrykte mus mens kontrollmus ikke viste denne overgangen, noe som tyder på at eksitasjonen av BNST GABA nevroner under ikke-rask øyebevegelses søvn utløser en rask induksjon av våkenhet. Omvendt hadde fotostimulering under rask øyebevegelsessøvn ingen effekt, så en overgangseffekt dukket bare opp i ikke-rask øyebevegelsessøvn. Det er viktig å ta vare på nøyaktige koordineringer for virusinjeksjon og optisk fiberimplantasjonstrinn.EEG/EMG-sporene som fanges opp under søvnanalysen, kan brukes til å vurdere konsekvensene av fotomanipulasjonen på de forskjellige årvåkne tilstander hos mus. Denne teknikken vil også hjelpe oss med å identifisere andre komponenter og kretser som er involvert i å regulere søvnvåkning tilstander. Bruk vernebriller for å unngå laserskader på øyet og sørg for å alltid autoklav sterilisere adeno-assosiert virus vektor beholder etter bruk.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Utryddelse Training Under reconsolidation Vindu Hindrer Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Electroencephalography, Real-time Måling av laktat Konsentrasjon og Optogenetic Manipulering av neuronal aktivitet i Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-enheten opptaket Metoder for å karakterisere nevrale aktiviteten i Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactory kretser

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

I Vivo to-foton avbildning av erfaring-avhengige molekylære endringer i kortikale Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic forstyrrelse av nevrale aktiviteten med Laser Illumination i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Disseksjon av Fear kretser i hjernen skiver

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic Entrainment av hippocampus Theta svingninger i oppfører seg mus

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Disruption of Frontal Lobe Neural Synchrony During Cognitive Control by Alcohol Intoxication

Forstyrrelse av frontallappen nevrale Synchrony under Cognitive administrere av alkoholforgiftning

Decision making relies on dynamic interactions of distributed, primarily frontal brain regions. Extensive evidence from functional magnetic resonance ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Påvisning av 5-Hydroxymethylcytosine i nevrale stamceller og hjerner av mus

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Measuring Neural Mechanisms Underlying Sleep-Dependent Memory Consolidation During Naps in Early Childhood

Måle nevrale mekanismer underliggende søvn-avhengige minne konsolidering under lur i tidlig barndom

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less ...