Name: optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Это исследование было поддержано Мерк Следователь исследований программы (#54843), KAKENHI Грант-в-помощь для научных исследований по инновационным областям, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.), и KAKENHI Грант-в-помощь для исследовательских исследований по инновационным областям (T.S.) (18H02595).

Все эксперименты здесь были одобрены Комитетом по эксперименту и использованию животных Университета Цукуба, в соответствии с руководящими принципами NIH.
1. Хирургия животных, инъекция вируса, электрод для ЭЭГ/ЭМГ и имплантация оптического волокна
<strong...

<ol>
	<li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder:+Secondary+symptom+or+core+feature?.">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?.</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li><li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity.">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li><li>Mellman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+anxiety+disorders.">Sleep and anxiety disorders.</a> Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).</li><li>Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuitry+of+wakefulness+and+sleep.">Neural circuitry of wakefulness and sleep.</a> Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).</li><li>Chemelli, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Narcolepsy+in+orexin+knockout+mice:+Molecular+genetics+of+sleep+regulation.">Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation.</a> Cell. 98 (4), 437-451 (1999).</li><li>Borb&#233;ly, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two-process+model+of+sleep+regulation:+A+reappraisal.">The two-process model of sleep regulation: A reappraisal.</a> Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).</li><li>Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+human+sleep:+recovery+process+gated+by+a+circadian+pacemaker.">Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).</li><li>Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic,+circadian,+and+emotional+regulation+of+sleep.">Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep.</a> Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).</li><li>Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+state+switching.">Sleep state switching.</a> Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).</li><li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li><li>Tovote, P., Fadok, J. P., L&#252;thi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuits+for+fear+and+anxiety.">Neuronal circuits for fear and anxiety.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).</li><li>Lebow, M. A., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overshadowed+by+the+amygdala:+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+emerges+as+key+to+psychiatric+disorders.">Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders.</a> Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+and+proliferation+of+intermediate+progenitors+of+GABAergic+neurons+in+the+mouse+telencephalon.">Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon.</a> Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+light+on+wakefulness+and+arousal.">Shining light on wakefulness and arousal.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).</li><li>Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+hypocretin-mediated+sleep-to-wake+transitions.">Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).</li><li>Weber, F., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit-based+interrogation+of+sleep+control.">Circuit-based interrogation of sleep control.</a> Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).</li><li>Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+REM+sleep+by+ventral+medulla+GABAergic+neurons.">Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons.</a> Nature. 526, 435-438 (2015).</li><li>Oishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-wave+sleep+is+controlled+by+a+subset+of+nucleus+accumbens+core+neurons+in+mice.">Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).</li><li>Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optogenetics+with+complementary+methodologies+in+systems+neuroscience.">Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).</li><li>Saito, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+in+the+preoptic+area+send+direct+inhibitory+projections+to+orexin+neurons.">GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li><li>Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+GABAergic+neurons+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+triggers+immediate+transition+from+non-rapid+eye+movement+sleep+to+wakefulness+in+mice.">Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice.</a> Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).</li><li>Lin, F., Pichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+neurons:+tools,+applications,+and+experimental+constraints.">Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints.</a> Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O&#8217;Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li></ol>

Здесь мы представили метод для оценки влияния оптогенетической стимуляции нейронов с особыми химическими идентичностями на состояние переходов сна / бодрствования и дал пример манипуляции ГАМКBNST нейронов. Наши данные показали, что оптогенетическое возбуждение нейронов ГАМК...

Сон необходим для оптимальной когнитивной функции. Последние результаты также свидетельствуют о том, чтонарушения во сне связаны с широким спектром заболеваний 1,2,3. Хотя функции сна до сих пор в значительной степени нерешенными, значительный прогресс был достигнут в последнее время в понимании нейронных цепей и механизмов, которые контролируют сон / бодрствования государства4. У млекопитающих существует три состояния бдительности: бодрствование, небыстрое движение глаз (NREM) сна, и быстрое движение глаз (REM) сна. Пробуждение характеризуется быстрыми колебаниями ЭЭГ (5-12 Гц) низкой амплитуды с целенаправленной и устойчивой двигательной активностью. Сон NREM определяется медленными колебаниями (1-4 Гц) высокой амплитуды (дельтовые волны), с отсутствием сознания и целенаправленной двигательной активностью. REM сон характеризуется относительно быстрыми колебаниями (6-12 Гц) низкой амплитудыи почти полной двусторонней атонии мышц 5.
Борбели предложил теорию регулирования сна бодрствования, известной как две модели процесса6,7. Гомеостатический процесс, также называемый процессом S, представляет давление сна, которое накапливается во время бодрствования и рассеивается во время сна. Другой процесс, называемый процессом C, является циркадным процессом, который объясняет, почему уровни бдительности колеблются в 24 h цикле. В дополнение к этим двум процессам, аллостатические факторы также важны для регулирования сна / бодрствования8,9. Аллостатические факторы включают состояние питания и эмоции. Страх и тревога, как правило, сопровождается увеличением возбуждения наряду с вегетативными и нейроэндокринными ответами10,11,12. Лимбическая система, как полагают, играют определенную роль в регуляции страха и тревоги, и механизмы, лежащие в основе вегетативных и нейроэндокринных реакций были изучены широко, но путь, по которому лимбическая система влияет на сон / бодрствование государства не но были выявлены. Большое количество недавних исследований с использованием опто- и фармакогенетики показали, что нейроны и нейронные цепи, которые регулируют сон / бодрствования государства распространяются по всему мозгу, в том числе кортики, базальный предмозг, таламус, гипоталамус, и ствол мозга. В частности, последние достижения в области оптогенетики позволили нам стимулировать или ингибировать специфические нейронные цепи in vivo с высокимпространственным и временным разрешением. Этот метод позволит прогрессировать в нашем понимании нервных субстратов сна и бодрствования, и как сон / бодрствование государства регулируются циркадных процессов, давление сна, и аллостатические факторы, в том числе эмоции. Эта статья направлена на введение, как использовать оптогенетические манипуляции в сочетании с записью сна / бодрствования, которые могли бы иметь потенциал для обновления нашего понимания коннектомы и механизмы в головном мозге, которые играют роль в регулировании сна NREM, REM сна, и бодрствования. Понимание этого механизма, с помощью которого лимбическая система регулирует состояние сна/бодрствования имеет первостепенное значение для здоровья, потому что бессонница обычно ассоциируется с тревогой или страхом быть не в состоянии спать (сомнифобия).
Считается, что BNST играет важную роль в тревоге и страхе. GAD67-выражение ГАМК нейронов являются основной популяции BNST12,13. Мы изучили влияние оптогенетических манипуляций этих нейронов (GABABNST) на сон / бодрствования государств. Одним из величайших достижений в области неврологии в последние годы были методы, которые позволяют манипулировать нейронами с определенными химическими идентичностями in vivo, с высоким пространственным и временным разрешением. Оптогенетика очень полезна для демонстрации причинно-следственной связи между нервной активностью и специфическими поведенческими реакциями14. Мы описываем оптогенетику как метод изучения функциональной связи определенных нейронных цепей в регуляции состояний сна/бодрствования. Используя эту технику, большой прогресс был достигнут в понимании нейрональных цепей, которые регулируют сон / бодрствования государства15,16,17,18,19 . Во многих случаях, opsins специфически введены в невенарах с определенными химическими тождественноплетениями в селективных зонах мозга комбинацией мышей Cre-водителя и Cre-индуцируемого AAV-опосредованного перехода гена. Кроме того, фокусное выражение фоточувствительных опсинов, таких как каналродопсин 2 (ChR2)20 или архаэродопсин (ArchT)21 в сочетании с Cre-loxP или Flp-FRT система позволяет манипулировать селективной нейронной популяции и конкретных нейронный путь22.
Мы описываем здесь эксперименты на ГАМК нейронов в BNST в качестве примера. Для выражения опсинов в назначенной нейрональной популяции наиболее часто используются соответствующие мыши-водители Cre и cre-dependent virus vectors. Трансгенные или стук-в линии, в которых опсины выражаются, в частности, нейронных популяций также полезны. В следующих экспериментах, мы использовали GAD67-Cre стук-в мышах23, в котором только ГАМК-нейроны выразить Cre рекомбиназы с C57BL/6J генетического фона, и вектор AAV, который содержит ChR2 (hChR2 H134R) сливается с EYFP или EYFP в качестве контроля с переключателем "FLEx (Flip-excision)24. Процедура конкретно описывает оптогенетическое возбуждение ГАМК нейронов в BNST во время мониторинга сна / бодрствования государства25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1180px;" width="1180">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">1x1 Fiber-optic Rotary Joints</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td style="width:177px;">FRJ 1x1 FC-FC</td>
			<td style="width:437px;">for optogenetics</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin header</td>
			<td style="width:191px;">KEL corporation</td>
			<td style="width:177px;">DSP02-006-431G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin socket</td>
			<td style="width:191px;">Hirose</td>
			<td style="width:177px;">21602X3GSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">A/D converter</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>3.70&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>5.82&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Fuji film</td>
			<td style="width:177px;">014-23302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Amplifier</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Muromachi</td>
			<td style="width:177px;">MK-AT-210D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Automatic injecter</td>
			<td style="width:191px;">KD scientific</td>
			<td style="width:177px;">780311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Carbide cutter</td>
			<td style="width:191px;">Minitor</td>
			<td style="width:177px;">B1055</td>
			<td>&#966;0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Cyanoacrylate adhesion&#160; (Aron alpha A) and acceleration</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#30533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Dental curing light</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">Elipar S10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Epoxy adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#04888</td>
			<td>insulation around the solder of 6-pin and shielded cable</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Fiber optic patch cord (branching)</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Gad67-Cre mice</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Kenji Sakimura</td>
			<td></td>
			<td>Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>65461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:191px;">FOREDOM</td>
			<td style="width:177px;">K.1070</td>
			<td>Used with carbide cutter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Interconnecting sleeve</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>ADAF1</td>
			<td>&#966;2.5 mm Ceramic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:191px;">Pfizer</td>
			<td>871119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Rapp OptoElectronic</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>473nm wave length</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser intesity checker</td>
			<td style="width:191px;">COHERENT</td>
			<td style="width:177px;">1098293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser stimulator</td>
			<td style="width:191px;">Bio research center</td>
			<td style="width:177px;">STO2</td>
			<td>reffered as pulse generator in text</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Optic fiber with ferrule&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV2-rh10</td>
			<td style="width:191px;">provided by PennVector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">Addgene</td>
			<td>plasimid # 20296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Karl Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Patch cord</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>D202-9089-0.4</td>
			<td>0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pHelper</td>
			<td style="width:191px;">Stratagene</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Photocurable dental cement</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">56846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Serafin clamp</td>
			<td style="width:191px;">Stoelting</td>
			<td style="width:177px;">52120-43P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Shielded cable</td>
			<td style="width:191px;">mogami</td>
			<td style="width:177px;">W2780</td>
			<td>Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep recording chamber</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td style="width:437px;">Custum-made (21cm&#215; 29cm &#215; 19cm) with water tank holder</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep sign software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Slip ring</td>
			<td style="width:191px;">neuroscience,inc</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless screw</td>
			<td style="width:191px;">Yamazaki</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>&#966;1.0 x 2.0</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless wire</td>
			<td style="width:191px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:177px;">AS633</td>
			<td>&#160;0.0130 inch diameter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stereotaxic frame with digital console</td>
			<td style="width:191px;">Koph</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Model 940</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Vital recorder software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice

В последние годы оптогенетика широко используется во многих областях нейронаучных исследований. Во многих случаях опсин, например канал родопсин 2 (ChR2), выражается вирусным вектором в определенном типе нейрональных клеток у различных мышей-кре-драйверов. Активация этих опсинов вызвана применением световых импульсов, которые поставляются лазером или светодиодом через оптические кабели, и эффект активации наблюдается с очень высоким разрешением времени. Экспериментаторы способны остро стимулировать нейроны при мониторинге поведения или другого физиологического исхода у мышей. Оптогенетика может позволить полезные стратегии для оценки функции нейрональных цепей в регуляции сна / бодрствования состояний у мышей. Здесь мы описываем методику изучения влияния оптогенетических манипуляций нейронов с определенной химической идентичностью во время электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и мониторинга электромиограммы (ЭМГ) для оценки стадии сна мышей. В качестве примера мы описываем манипуляции ГАМК нейронов в ядре кровати stria terminalis (BNST). Острое оптогенетическое возбуждение этих нейронов вызывает быстрый переход к бодрствованию при применении во время сна NREM. Оптогенетические манипуляции наряду с записью ЭЭГ/ЭМГ могут быть применены для расшифровки нейрональных цепей, которые регулируют состояния сна/бодрствования.

Настоящее исследование показало влияние оптогенетического возбуждения нейронов ГАМКBNST на переходное состояние сна. ChR2-EYFP был focally выражается в ГАМК нейронов в BNST. На месте гибридизации гистохимических исследование показало, что ChR2-EYFP был colocalized в нейронах, выра?...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

Оптогенетическое манипулирование нейронными цепями во время мониторинга сна / бодрствования государств у мышей

Здесь мы описываем методы оптогенетической манипуляции определенными типами нейронов во время мониторинга состояния сна/бодрствования у мышей, представляя нашу недавнюю работу над ядром кровати stria terminalis в качестве примера.

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Эта процедура может помочь нам определить функцию конкретной нейро цепи, которые участвуют в регулировании бодрствования сна с менее инвазивными манипуляциями и высоким временным разрешением. Этот метод позволяет нам мониторинг поверхности ЭЭГ в режиме реального времени в сочетании с манипуляцией конкретной нейро цепи для изучения причинно-следственной связи между схемами и сон бодрствования государств. Шота Кодани собирается продемонстрировать процедуру.После подтверждения отсутствия реакции на щепотку носа, нанесите мазь на глаза животного и используйте ушные батончики и носом булавку к стереотаксическому аппарату, чтобы стабилизировать голову обезболивающей мыши на абсорбющей площадке. Когда голова фиксируется в положении, сделать средне-sagittal разрез в кожу головы, чтобы подтвердить, что пересечение между сутура sagittalis и сутура coronalis или сутура lambdoidea находятся в горизонтальной линии на том же уровне. Чтобы избежать разрыва позиционирования, при необходимости отрегулируйте щепотку носа и ушные батончики.Затем с помощью серафина зажимы для удержания кожи открыты дезинфицировать открытую поверхность черепа, чтобы черепные швы, которые будут визуализированы более четко. Для введения вектора вируса, связанного с адено, загрузите стерилизованный этанол 10 миллилитровым шприцем с двумя микролитровами минерального масла, после чего будет введен экспериментальный объем вируса. Используйте микроинъекцию насоса для регулировки кончика микроинъекции иглы на брегму и обратите внимание на координаты в качестве точки происхождения.Затем перемести кончик в назначенное место инъекции и поместите кончик иглы в положение. Отметьте череп в месте инъекции и используйте зубную дрель, оснащенную карбидом 0,7 миллиметра, чтобы просверлить отверстие диаметром около двух миллиметров в черепе. После удаления крови со всего отверстия с помощью ватного тампона, медленно переместить иглу в ядро кровати стрии terminalis или BSNT и медленно вводить назначенный объем раствора вируса.Затем оставьте иглу на месте в течение пяти минут, чтобы позволить раствору достаточно проникнуть в ткань BNST, прежде чем тщательно втягивать иглу. Для электроэнцефалограммы, или ЭЭГ, и электромиограммы, или ЭМГ, имплантации электродов, первый припой два провода из нержавеющей стали, из которых один миллиметр изоляции был лишен с обоих концов на электроды ЭМГ и место центр электродов на брегму. Затем отметь положение для каждого электрода ЭЭГ.Чтобы определить положение имплантата оптического волокна, прикрепите к манипулятору феррул оптического волокна и поверните руку манипулятора на угол плюс-минус 30 градусов против горизонтальной линии. Положите наконечник волокна на брегму и запиши координаты. Перемести наконечник к целевой линии вставки и отметьте положение на черепе и положение для якорного винта рядом с местом вставки.Используйте зубную дрель для бурения черепа на каждом участке и используйте манипулятор, чтобы аккуратно вставить оптическое волокно, пока оно не достигнет выше BNST. Феррул должен отдохнуть на оставшемся черепе. Закретись волокном к черепу якорным винтом, заботясь о том, чтобы не сломать дуру и не повредить салфетку.Затем накройте волокно и винт фото-излечимым зубным цементом. Далее сверлит отверстия для электродов ЭЭГ/ЭМГ и вставляет кончик первого электрода в одно отверстие. Держа имплантат одной рукой, нанесите клей цианоакрилата в пространство между черепом и электродом и вставьте электрод на остальной части пути, заботясь о том, чтобы не повредить ни одну ткань.Когда все электроды были размещены, покрыть окружность электродов и оптических волокон с дополнительными цианоакрилат клей и цианоакрилат ускоритель, чтобы избежать причинения каких-либо перерывов на ферруле для оптического кабеля и электрода, чтобы привести провода соединительных зон. Теперь разоблачить мышцы шеи, и вставить провода для эмГ электрода под мышцу. Отрегулируйте длину электрода ЭМГ так, чтобы он помещался прямо под нухальные мышцы и заполнял имплантаты более цианоакрилатным клеем и ускорителем.Затем поместите мышь на тепловую площадку с мониторингом до полной компенсации. Для мониторинга ЭЭГ/ЭМГ во время фотовозбудения целевых нейронов, сначала используйте scalar для регулировки интенсивности лазера и использования феррула, чтобы привязать кончик лазерного кабеля к неиспользованной оптической клетчатке. Подтвердите, что на стыке волокна и кабеля нет места.Через 20 минут, излучают разогретый лазер до интенсивности проверки и настроить интенсивность до 10 милливатт на миллиметр в квадрате. Установите продолжительность светового импульса до 10 миллисекунд, остальные периоды до 40 миллисекунд, цикл до 20, и повторить до 20. Измените лазерный режим на транзисторную логику и подтвердите, что световые импульсы испускаются из волокна, контролируемого регулятором шаблона.Подключите имплантированный электрод и кабельный адаптер, а затем покройте соединение легким непроницаемым материалом для предотвращения утечки лазера. А когда лазер будет готов, переместите мышей в экспериментальную камеру для записи ЭЭГ/ЭМГ. Для оценки задержки бодрствования от не быстрого движения глаз или быстрого сна движения глаз, ограничить время записи и оптимизированный сайт получить время, и пусть мыши свободно перемещаться в экспериментальной камере, по крайней мере один час.В течение экспериментального периода следите за сигналами ЭЭГ и ЭМГ на одном экране записи. Оцените состояние мыши как бодрствование, не быстрый сон движения глаз, или быстрый сон движения глаз, используя контроль усиления для каждой волны для удобства различения каждого состояния. Для измерения небывого сна движения глаз, чтобы бодрствования задержки, наблюдать стабильный не быстрый сон движения глаз в течение 40 секунд, а затем включить генератор шаблона для фотостимуляции и подтвердить лазерное излучение имплантированных оптических волокон.Затем завестите сигналы ЭЭГ/ЭМГ до тех пор, пока состояние сна не изменится до бодрствования. Здесь представлены ЭЭГ / ЭМГ следы до и после фото стимуляции во время не быстрого сна движения глаз показаны. Высокое напряжение и медленная частота ЭЭГ без сигналов ЭМГ, представляет собой не быстрый сон движения глаз.Фото стимуляции вызвало острый переход к бодрствования около двух секунд после стимуляции в channelrhodopsin-2 выражая мышей в то время как контроль мышей не продемонстрировать этот переход, предполагая, что возбуждение нейронов BNST ГАМК во время не быстрого движения глаз сна вызывает быструю индукцию бодрствования. И наоборот, фотостимуляция во время быстрого сна движения глаз не имела никакого эффекта, поэтому эффект перехода возник только при не быстром сне движения глаз. Важно позаботиться о точных координациях для инъекций вируса и этапов имплантации оптического волокна.Следы ЭЭГ/ЭМГ, снятые во время анализа сна, могут быть использованы для оценки последствий фотомани манипуляций на различных бдительных состояниях у мышей. Этот метод также поможет нам определить другие компоненты и схемы, участвующие в регулировании состояния бодрствования сна. Используйте защитные очки, чтобы избежать лазерного повреждения глаза и не забудьте всегда автоклав стерилизовать адено-ассоциированный вирус вектор контейнера после использования.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Вымирание обучение в течение Обратное уплотнение окон невозможным восстановление страха

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Одновременное электроэнцефалография, в режиме реального времени измерения концентрации лактата и Optogenetic Манипуляция активности нейронов в коры головного мозга грызунов

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-единицы Запись методы для характеристики нейронной активности в Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Обонятельные схемы

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

В Vivo Двухфотонные изображений зависящие от опыта молекулярные изменения в корковых нейронов

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Возмущение нейронной активности с лазерной подсветкой в ​​полу-нетронутыми<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки в движении

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo оптогенетика Вскрытие страха схем в головном мозге Ломтики

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic ГРЭС гиппокампа тета колебаний в себя мышей

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Disruption of Frontal Lobe Neural Synchrony During Cognitive Control by Alcohol Intoxication

Срыв лобной доли нейронных синхронности во время когнитивные контроля алкогольного опьянения

Decision making relies on dynamic interactions of distributed, primarily frontal brain regions. Extensive evidence from functional magnetic resonance ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Обнаружение 5-гидроксиметилцитозин в нейронных стволовых клетках и мозгах мышей

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Measuring Neural Mechanisms Underlying Sleep-Dependent Memory Consolidation During Naps in Early Childhood

Измерение нейронных механизмов, лежащих в основе консолидации сно-зависимой памяти во время naps в раннем детстве

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less ...