Name: optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00
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Este estudio fue apoyado por el Programa de Estudios de Investigadores de Merck (#54843), una Subvención en Ayuda para La Investigación Científica de KAKENHI sobre áreas innovadoras, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.) y una Subvención en Ayuda de KAKENHI para Investigación Exploratoria en Áreas Innovadoras (T.S.) (18H02595).

Todos los experimentos aquí fueron aprobados por el Comité de Experimento y Uso Animal de la Universidad de Tsukuba, cumpliendo con las directrices de NIH.
1. Cirugía animal, inyección de virus, electrodo para EEG/EMG e implantación de fibra óptica
PRECAUCION: Deben seleccionarse técnicas adecuadas de protección y manipulación en función del nivel de bioseguridad del virus que se va a utilizar. AAV se debe utilizar en una sala de iny...

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	<li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder:+Secondary+symptom+or+core+feature?.">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?.</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li><li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity.">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li><li>Mellman, T. 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S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).</li><li>Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optogenetics+with+complementary+methodologies+in+systems+neuroscience.">Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).</li><li>Saito, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+in+the+preoptic+area+send+direct+inhibitory+projections+to+orexin+neurons.">GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li><li>Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+GABAergic+neurons+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+triggers+immediate+transition+from+non-rapid+eye+movement+sleep+to+wakefulness+in+mice.">Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice.</a> Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).</li><li>Lin, F., Pichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+neurons:+tools,+applications,+and+experimental+constraints.">Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints.</a> Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O&#8217;Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li></ol>

Aquí presentamos un método para evaluar el efecto de la estimulación optogenética de las neuronas con identidades químicas particulares en las transiciones de estado de sueño / vigilia y dio un ejemplo de manipulación de las neuronas GABABNST. Nuestros datos mostraron que la excitación optogenética de las neuronas GABABNST resulta en la transición inmediata del sueño NREM a la vigilia.
Varios diseños experimentales están disponibles debido al desarrollo de nu...

El sueño es esencial para una función cognitiva óptima. Los hallazgos recientes también sugieren que las alteraciones en el sueño se asocian con una amplia gama de enfermedades1,2,3. Aunque las funciones del sueño están todavía en gran medida sin resolver, recientemente se han hecho progresos sustanciales en la comprensión de los circuitos neuronales y mecanismos que controlan los estados de sueño/vigilia4. En los mamíferos, hay tres estados de vigilancia: vigilia, sueño de movimiento ocular no rápido (NREM) y sueño de movimiento ocular rápido (REM). La vigilia se caracteriza por oscilaciones EEG rápidas (5-12 Hz) de baja amplitud con actividad motora intencionada y sostenida. El sueño NREM se define por oscilaciones lentas (1-4 Hz) de alta amplitud (ondas delta), con falta de conciencia y actividad motora deliberada. El sueño REM se caracteriza por oscilaciones relativamente rápidas (6-12 Hz)de baja amplitud y casi completa atonía muscular bilateral 5.
Borbely propuso una teoría de la regulación de la vigilia del sueño conocida como los dos modelos de proceso6,7. Un proceso homeostático, también conocido como proceso S, representa la presión del sueño que se acumula durante la vigilia y se disipa durante el sueño. Otro proceso, conocido como proceso C, es un proceso circadiano, que explica por qué los niveles de vigilancia fluctúan en el ciclo de 24 h. Además de estos dos procesos, los factores alostáticos también son importantes para la regulación del sueño/vigilia8,9. Los factores allostáticos incluyen estados nutricionales y emociones. El miedo y la ansiedad suelen ir acompañados de un aumento de la excitación junto con las respuestas autonómicas y neuroendocrinas10,11,12. Se cree que el sistema límbico desempeña un papel en la regulación del miedo y la ansiedad, y los mecanismos subyacentes a las respuestas autonómicas y neuroendocrinas se han estudiado extensamente, pero la vía por la cual el sistema límbico influye en los estados de sueño/vigilia no ha sido aún así se han revelado. Un gran número de estudios recientes con opto- y farmacogenética han sugerido que las neuronas y circuitos neuronales que regulan los estados de sueño/vigilia se distribuyen por todo el cerebro, incluyendo los cortices, el antecefálico basal, el tálamo, el hipotálamo, y el tallo cerebral. En particular, los recientes avances en optogenética nos han permitido estimular o inhibir circuitos neuronales específicos in vivo con altas resoluciones espaciales y temporales. Esta técnica permitirá avanzar en nuestra comprensión de los sustratos neuronales del sueño y la vigilia, y cómo los estados de sueño/vigilia están regulados por procesos circadianos, presión de sueño y factores alostáticos, incluyendo la emoción. Este artículo tiene como objetivo introducir cómo utilizar la manipulación optogenética combinada con la grabación de sueño/vigilia, que podría tener el potencial de actualizar nuestra comprensión de los connectomes y mecanismos en el cerebro que juegan un papel en la regulación del sueño NREM, sueño REM, y la vigilia. La comprensión de este mecanismo por el cual el sistema límbico regula los estados de sueño/vigilia es de suma importancia para la salud, porque el insomnio generalmente se asocia con la ansiedad o el miedo a no poder dormir (somnifobia).
Se cree que el BNST juega un papel esencial en la ansiedad y el miedo. GAD 67-expresando neuronas GABAérgicas son una población importante del BNST12,13. Examinamos el efecto de la manipulación optogenética de estas neuronas (GABABNST) en estados de sueño/vigilia. Uno de los mayores avances en neurociencia en los últimos años han sido los métodos que permiten la manipulación de las neuronas con identidades químicas particulares in vivo, con altas resoluciones espaciales y temporales. La optogenética es muy útil para demostrar vínculos causales entre la actividad neuronal y las respuestas conductuales específicas14. Describimos la optogenética como un método para examinar la conectividad funcional de los circuitos neuronales definidos en la regulación de los estados de sueño/vigilia. Mediante la utilización de esta técnica, se ha logrado un gran progreso en la comprensión de los circuitos neuronales que regulan los estados de sueño/vigilia15,16,17,19,19 . En muchos casos, las opsins se introducen específicamente en neuronas con identidades químicas particulares en regiones cerebrales selectivas mediante una combinación de ratones Cre-driver y transferencia de genes mediada por AAV inducible Cre. Además, la expresión focal de opsins fotosensibles como la cifrodopsina 2 (ChR2)20 o la arqueerhodopsina (ArchT)21 combinada con un sistema Cre-loxP o Flp-FRT nos permite manipular una población neuronal selectiva y específica vía neural22.
Aquí describimos los experimentos sobre neuronas GABAérgicas en el BNST como un ejemplo. Para expresar opsins en una población neuronal designada, se utilizan con mayor frecuencia ratones conductores de Cre apropiados y vectores de virus dependientes de Cre. También son útiles las líneas transgénicas o de impacto en las que las opsins se expresan en determinadas poblaciones neuronales. En los siguientes experimentos, utilizamos ratones knock-in GAD67-Cre 23 en los que sólo las neuronas GABAérgicas expresan la recombinación de Cre con un fondo genético C57BL/6J, y un vector AAV que contiene ChR2 (hChR2 H134R) fusionado con EYFP o EYFP como un vector de control con un interruptor "FLEx (Flip-escision)"24. El procedimiento describe específicamente la excitación optogenética de las neuronas GABAérgicas en el BNST durante el seguimiento de los estados de sueño/vigilia25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1180px;" width="1180">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">1x1 Fiber-optic Rotary Joints</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td style="width:177px;">FRJ 1x1 FC-FC</td>
			<td style="width:437px;">for optogenetics</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin header</td>
			<td style="width:191px;">KEL corporation</td>
			<td style="width:177px;">DSP02-006-431G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin socket</td>
			<td style="width:191px;">Hirose</td>
			<td style="width:177px;">21602X3GSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">A/D converter</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>3.70&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>5.82&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Fuji film</td>
			<td style="width:177px;">014-23302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Amplifier</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Muromachi</td>
			<td style="width:177px;">MK-AT-210D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Automatic injecter</td>
			<td style="width:191px;">KD scientific</td>
			<td style="width:177px;">780311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Carbide cutter</td>
			<td style="width:191px;">Minitor</td>
			<td style="width:177px;">B1055</td>
			<td>&#966;0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Cyanoacrylate adhesion&#160; (Aron alpha A) and acceleration</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#30533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Dental curing light</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">Elipar S10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Epoxy adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#04888</td>
			<td>insulation around the solder of 6-pin and shielded cable</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Fiber optic patch cord (branching)</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Gad67-Cre mice</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Kenji Sakimura</td>
			<td></td>
			<td>Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>65461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:191px;">FOREDOM</td>
			<td style="width:177px;">K.1070</td>
			<td>Used with carbide cutter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Interconnecting sleeve</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>ADAF1</td>
			<td>&#966;2.5 mm Ceramic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:191px;">Pfizer</td>
			<td>871119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Rapp OptoElectronic</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>473nm wave length</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser intesity checker</td>
			<td style="width:191px;">COHERENT</td>
			<td style="width:177px;">1098293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser stimulator</td>
			<td style="width:191px;">Bio research center</td>
			<td style="width:177px;">STO2</td>
			<td>reffered as pulse generator in text</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Optic fiber with ferrule&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV2-rh10</td>
			<td style="width:191px;">provided by PennVector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">Addgene</td>
			<td>plasimid # 20296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Karl Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Patch cord</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>D202-9089-0.4</td>
			<td>0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pHelper</td>
			<td style="width:191px;">Stratagene</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Photocurable dental cement</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">56846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Serafin clamp</td>
			<td style="width:191px;">Stoelting</td>
			<td style="width:177px;">52120-43P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Shielded cable</td>
			<td style="width:191px;">mogami</td>
			<td style="width:177px;">W2780</td>
			<td>Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep recording chamber</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td style="width:437px;">Custum-made (21cm&#215; 29cm &#215; 19cm) with water tank holder</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep sign software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Slip ring</td>
			<td style="width:191px;">neuroscience,inc</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless screw</td>
			<td style="width:191px;">Yamazaki</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>&#966;1.0 x 2.0</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless wire</td>
			<td style="width:191px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:177px;">AS633</td>
			<td>&#160;0.0130 inch diameter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stereotaxic frame with digital console</td>
			<td style="width:191px;">Koph</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Model 940</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Vital recorder software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice

En los últimos años, la optogenética ha sido ampliamente utilizada en muchos campos de la investigación neurocientífica. En muchos casos, una opsin, como la rodopsina de canal 2 (ChR2), se expresa mediante un vector de virus en un tipo particular de células neuronales en varios ratones Cre-driver. La activación de estas opsins se activa mediante la aplicación de pulsos de luz que se entregan por láser o LED a través de cables ópticos, y el efecto de la activación se observa con una resolución de tiempo muy alta. Los experimentadores son capaces de estimular agudamente las neuronas mientras monitorean el comportamiento u otro resultado fisiológico en ratones. La optogenética puede permitir estrategias útiles para evaluar la función de los circuitos neuronales en la regulación de los estados de sueño/vigilia en ratones. Aquí describimos una técnica para examinar el efecto de la manipulación optogenética de las neuronas con una identidad química específica durante el electroencefalograma (EEG) y la monitorización del electromiograma (EMG) para evaluar la etapa del sueño de los ratones. Como ejemplo, describimos la manipulación de las neuronas GABAérgicas en el núcleo de la cama de la estría terminalis (BNST). La excitación optogenética aguda de estas neuronas desencadena una rápida transición a la vigilia cuando se aplica durante el sueño NREM. La manipulación optogenética junto con la grabación EEG/EMG se puede aplicar para descifrar los circuitos neuronales que regulan los estados de sueño/vigilia.

El presente estudio mostró el efecto de la excitación optogenética de las neuronas GABABNST en la transición del estado del sueño. ChR2-EYFP se expresó focalmente en las neuronas GABA en el BNST. Un estudio histoquímico de hibridación in situ mostró que ChR2-EYFP fue colocalizado en neuronas que expresan señales de MRNA GAD 67, lo que indica que estas son neuronas GABAérgicas. Las muestras de rodajas inmunohistoquímicas confirmaron la posición de la fibra óptica, ...

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Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

Manipulación optogenética de circuitos neuronales durante la supervisión de los estados de sueño/vigilia en ratones

Aquí, describimos métodos de manipulación optogenética de determinados tipos de neuronas durante la monitorización de los estados de sueño/vigilia en ratones, presentando nuestro trabajo reciente en el núcleo de la estría terminal is como ejemplo.

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Este procedimiento puede ayudarnos a identificar la función de circuito neuro específico que intervienen en la regulación de la vigilia del sueño con menos manipulación invasiva y alta resolución temporal. Este método nos permite el monitoreo de la superficie EEG en tiempo real junto con la manipulación de un circuito neuro específico para examinar la relación causal entre los circuitos y los estados de vigilia del sueño. Shota Kodani va a demostrar el procedimiento.Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del otro, aplicar ungán al ojo del animal y utilizar las barras de oído y el pasador de la nariz en el aparato estereotáctico para estabilizar la cabeza del ratón anestesiado en una almohadilla absorbente. Cuando la cabeza esté fijada en su posición, haga una incisión de hundimiento medio en el cuero cabelludo para confirmar que la intersección entre la sutura sagittalis y la sutura coronalis o sutura lambdoidea están en una línea horizontal al mismo nivel. Para evitar un espacio de posicionamiento, ajuste el pellizco de la nariz y las barras de las orejas según sea necesario.Luego, usando abrazaderas de serafína para mantener la piel abierta desinfectar la superficie expuesta del cráneo para permitir que las suturas craneales se visualicen más claramente. Para inyectar el vector del virus asociado al adeno, cargue una jeringa esterilizada con etanol de 10 mililitros con dos microlitros de aceite mineral, seguido del volumen experimental del virus que se va a inyectar. Utilice la bomba de microinyección para ajustar la punta de la aguja de microinyección en el bregma y observe las coordenadas como el punto de origen.A continuación, mueva la punta al lugar de inyección designado y coloque la punta de la aguja en la posición. Marque el cráneo en el lugar de inyección y utilice un taladro dental equipado con un cortador de carburo de 0,7 milímetros para perforar un agujero de aproximadamente dos milímetros de diámetro en el cráneo. Después de extraer sangre de alrededor del agujero con un hisopo de algodón, mueva lentamente la aguja al núcleo de la cama de la estrías terminalis o BSNT e inyecte lentamente el volumen designado de solución ánltica.A continuación, deje la aguja en su lugar durante cinco minutos para permitir que la solución se infiltre lo suficiente en el tejido BNST antes de retraer cuidadosamente la aguja. Para electroencefalograma, o EEG, y electromiograma, o EMG, implantación de electrodos, primero soldar dos alambres de acero inoxidable de los cuales se ha despojado un milímetro de aislamiento de ambos extremos a los electrodos EMG y colocar el centro de los electrodos en el bregma. A continuación, marque la posición de cada electrodo EEG.Para determinar la posición del implante de fibra óptica, conecte una férula de fibra óptica al manipulador y gire el brazo manipulador a un ángulo más o menos de 30 grados contra una línea horizontal. Ponga la punta de fibra en el bregma y registre las coordenadas. Mueva la punta a la línea de inserción objetivo y marque la posición en el cráneo y la posición del tornillo de anclaje junto al sitio de inserción.Utilice el taladro dental para perforar el cráneo en cada sitio y utilice el manipulador para insertar suavemente la fibra óptica hasta que llegue por encima del BNST. La férula debe descansar sobre el cráneo restante. Fije la fibra al cráneo con un tornillo de anclaje, teniendo cuidado de no romper la dura o dañar ningún tejido.A continuación, cubra la fibra y atornille con cemento dental fotocurable. A continuación, taladre agujeros para electrodos EEG/EMG e inserte la punta del primer electrodo en un orificio. Sosteniendo el implante con una mano, aplicar adhesivo de cianoacrilato al espacio entre el cráneo y el electrodo e insertar el electrodo el resto del camino, teniendo cuidado de no dañar ningún tejido.Cuando se hayan colocado todos los electrodos, cubra la circunferencia de los electrodos y las fibras ópticas con adhesivo adicional de cianoacrilato y acelerador de cianoacrilato para evitar causar cualquier interrupción en la férula al cable óptico y electrodo a las zonas de conexión del cable de plomo. Ahora exponga los músculos del cuello e inserte los cables para el electrodo EMG debajo del músculo. Ajuste la longitud del electrodo EMG de modo que encaje justo debajo de los músculos nucales y llene los implantes con más adhesivo y acelerador de cianoacrilato.A continuación, coloque el ratón sobre una almohadilla de calor con monitoreo hasta que se recompensa completa. Para la monitorización de EEG/EMG durante la fotoexcitación de neuronas dirigidas, primero utilice un escalar para ajustar la intensidad del láser y utilice una férula para amarrar la punta del cable láser a una fibra óptica no utilizada. Confirme que no hay espacio en la unión entre la fibra y el cable.Después de 20 minutos, emita el láser calentado al comprobador de intensidad y ajuste la intensidad a 10 milivatios por milímetro cuadrado. Establezca la duración del pulso de luz en 10 milisegundos, el período de descanso en 40 milisegundos, el ciclo en 20 y la repetición en 20. Cambie el modo láser a la lógica del transistor y confirme que los pulsos de luz se emiten desde la fibra controlada por el regulador del patrón.Conecte el electrodo implantado y el adaptador de cable y, a continuación, cubra la unión con material impermeable ligero para evitar fugas de láser. Y cuando el láser esté listo, mueva los ratones a la cámara experimental para la grabación EEG/EMG. Para evaluar la latencia a la vigilia de movimiento ocular no rápido o sueño de movimiento ocular rápido, limite el tiempo de grabación y el tiempo de ganancia optimizado del sitio y deje que los ratones se muevan libremente en la cámara experimental durante al menos una hora.Durante el período experimental, monitoree las señales EEG y EMG en la misma pantalla de grabación. Evalúe el estado del ratón como vigilia, sueño de movimiento ocular no rápido o sueño de movimiento ocular rápido usando el control de ganancia para cada onda para facilitar la distinción de cada estado. Para la medición del sueño de movimiento ocular no rápido a la latencia de vigilia, observe el sueño estable de movimiento ocular no rápido durante 40 segundos, luego encienda el generador de patrones para la estimulación fotográfica y confirme la emisión láser a las fibras ópticas implantadas.A continuación, registre las señales EEG/EMG hasta que el estado de suspensión cambie a vigilia. Aquí se muestran rastros de EEG/EMG representados antes y después de la estimulación fotográfica durante el sueño no rápido del movimiento ocular. Un EEG de alto voltaje y frecuencia lenta sin señales EMG, representa el sueño no rápido del movimiento ocular.La estimulación fotográfica desencadenó una transición aguda a la vigilia unos dos segundos después de la estimulación en ratones que expresan la canalización-2 mientras que los ratones de control no demostraron esta transición, lo que sugiere que la excitación de las neuronas BNST GABA durante el sueño de movimiento ocular no rápido desencadena una rápida inducción de vigilia. Por el contrario, la estimulación fotográfica durante el sueño de movimiento ocular rápido no tuvo ningún efecto, por lo que un efecto de transición sólo surgió en el sueño de movimiento ocular no rápido. Es importante tener cuidado con las coordinaciones precisas para la inyección de virus y los pasos de implantación de fibra óptica.Los rastros EEG/EMG capturados durante el análisis del sueño se pueden utilizar para evaluar las consecuencias de la manipulación de la foto en los diferentes estados vigilantes en ratones. Esta técnica también nos ayudará a identificar otros componentes y circuitos involucrados en la regulación de los estados de vigilia del sueño. Utilice gafas protectoras para evitar daños por láser en el ojo y asegúrese de esterilizar siempre el autoclave el contenedor vectorial de virus asociado al adeno después de su uso.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Formación extinción durante la ventana de reconsolidación impide una recuperación del Miedo

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Investigación

Neurociencias

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic de arrastre de las oscilaciones Theta Hippocampal en comportarse ratones

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Disruption of Frontal Lobe Neural Synchrony During Cognitive Control by Alcohol Intoxication

Interrupción de sincronía neuronal del lóbulo Frontal durante Control cognitivo por intoxicación de Alcohol

Decision making relies on dynamic interactions of distributed, primarily frontal brain regions. Extensive evidence from functional magnetic resonance ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

La detección de 5-Hidroximetilcitosina en células madre neuronales y cerebros de ratones

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Measuring Neural Mechanisms Underlying Sleep-Dependent Memory Consolidation During Naps in Early Childhood

Medición de los mecanismos neuronales subyacentes a la consolidación de la memoria dependiente del sueño durante las siestas en la primera infancia

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less ...