Name: optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Denna studie stöddes av Merck Investigator Studies program (#54843), en KAKENHI Grant-in-Aid för vetenskaplig forskning om innovativa områden, "WillDynamics" (16H06401) (TS), och en KAKENHI Grant-in-Aid för undersökande forskning om innovativa områden (TS) (18H02595).

Alla experiment här godkändes av Animal experiment och använda kommittén vid universitetet i Tsukuba, som uppfyller NIH riktlinjer.
1. djur kirurgi, virus insprutning, elektrod för EEG/EMG och optisk fiber implantation
Försiktighet: Lämpliga skydds-och hanteringsmetoder bör väljas på grund av den biosäkerhetsnivå hos viruset som ska användas. AAV ska användas i ett isolerat P1A graderat rum för injektion, och röret som transpor...

<ol>
	<li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder:+Secondary+symptom+or+core+feature?.">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?.</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li><li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity.">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li><li>Mellman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+anxiety+disorders.">Sleep and anxiety disorders.</a> Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).</li><li>Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuitry+of+wakefulness+and+sleep.">Neural circuitry of wakefulness and sleep.</a> Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).</li><li>Chemelli, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Narcolepsy+in+orexin+knockout+mice:+Molecular+genetics+of+sleep+regulation.">Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation.</a> Cell. 98 (4), 437-451 (1999).</li><li>Borb&#233;ly, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two-process+model+of+sleep+regulation:+A+reappraisal.">The two-process model of sleep regulation: A reappraisal.</a> Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).</li><li>Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+human+sleep:+recovery+process+gated+by+a+circadian+pacemaker.">Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).</li><li>Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic,+circadian,+and+emotional+regulation+of+sleep.">Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep.</a> Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).</li><li>Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+state+switching.">Sleep state switching.</a> Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).</li><li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li><li>Tovote, P., Fadok, J. P., L&#252;thi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuits+for+fear+and+anxiety.">Neuronal circuits for fear and anxiety.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).</li><li>Lebow, M. A., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overshadowed+by+the+amygdala:+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+emerges+as+key+to+psychiatric+disorders.">Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders.</a> Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+and+proliferation+of+intermediate+progenitors+of+GABAergic+neurons+in+the+mouse+telencephalon.">Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon.</a> Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+light+on+wakefulness+and+arousal.">Shining light on wakefulness and arousal.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).</li><li>Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+hypocretin-mediated+sleep-to-wake+transitions.">Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).</li><li>Weber, F., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit-based+interrogation+of+sleep+control.">Circuit-based interrogation of sleep control.</a> Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).</li><li>Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+REM+sleep+by+ventral+medulla+GABAergic+neurons.">Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons.</a> Nature. 526, 435-438 (2015).</li><li>Oishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-wave+sleep+is+controlled+by+a+subset+of+nucleus+accumbens+core+neurons+in+mice.">Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).</li><li>Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optogenetics+with+complementary+methodologies+in+systems+neuroscience.">Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).</li><li>Saito, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+in+the+preoptic+area+send+direct+inhibitory+projections+to+orexin+neurons.">GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li><li>Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+GABAergic+neurons+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+triggers+immediate+transition+from+non-rapid+eye+movement+sleep+to+wakefulness+in+mice.">Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice.</a> Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).</li><li>Lin, F., Pichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+neurons:+tools,+applications,+and+experimental+constraints.">Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints.</a> Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O&#8217;Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li></ol>

Vi presenterade här en metod för att utvärdera effekten av optogenetisk stimulering av nervceller med särskilda kemiska identiteter på statliga övergångar av sömn/vakenhet och gav ett exempel på manipulation av GABABnst nervceller. Våra data visade att optogenetisk excitation av GABABnst nervceller resulterar i omedelbar övergång från NREM sömn till vakenhet.
Olika experimentella konstruktioner finns tillgängliga på grund av utvecklingen av många typer av...

Sömn är viktigt för optimal kognitiv funktion. De senaste rönen tyder också på att sömnstörningar i sömnen är förknippade med ett brett spektrum av sjukdomar1,2,3. Även om funktionerna i sömnen är ännu i stort sett olösta, betydande framsteg har gjorts nyligen i förståelsen av neurala kretsar och mekanismer som styr sömn/vakenhet stater4. Hos däggdjur finns det tre tillstånd av vaksamhet: vakenhet, icke-Rapid ögonrörelser (NREM) sömn, och snabba ögonrörelser (REM) sömn. Vakenhet kännetecknas av snabba EEG svängningar (5-12 Hz) av låg amplitud med målmedveten och ihållande motorisk aktivitet. NREM-sömnen definieras av långsamma svängningar (1-4 Hz) av kick amplitud (delta vinkar), med brist av medvetenhet och målmedveten motorisk aktivitet. REM-sömn karakteriseras av förhållandevis fastar svängningar (6-12 Hz) av låg amplitud och nästan färdig bilateral muskel Atonia5.
Borbely föreslog en teori om sömn-vakenhet förordning kallas två processmodell6,7. En homeostatiska process, även kallad process S, representerar sömn tryck som ackumuleras under vakenhet och skingpates under sömnen. En annan process, kallad process C, är en Cirkadisk process, vilket förklarar varför vaksamhets nivåerna fluktuerar i 24 h cykel. Förutom dessa två processer, allostatiska faktorer är också viktiga för regleringen av sömn/vakenhet8,9. Allostatiska faktorer inkluderar näringsmässiga stater och känslor. Rädsla och ångest åtföljs vanligtvis av en ökning av upphetsning tillsammans med autonoma och neuroendokrina svar10,11,12. Det limbiska systemet tros spela en roll i regleringen av rädsla och ångest, och mekanismerna bakom autonoma och neuroendokrina svar har studerats utförligt, men den väg genom vilken det limbiska systemet påverkar sömn/vakenhet stater har inte ännu inte avslöjats. Ett stort antal nyligen genomförda studier med OPTO-och Farmakogenetik har föreslagit att nervceller och neuronala kretsar som reglerar sömn/vakenhet stater distribueras i hela hjärnan, inklusive cortices, basal forebrain, Thalamus, hypothalamus, och hjärnstammen. I synnerhet har de senaste framstegen inom optogenetik tillåtit oss att stimulera eller hämma specifika neurala kretsar in vivo med höga rumsliga och temporala resolutioner. Denna teknik kommer att möjliggöra framsteg i vår förståelse av de neurala substrat för sömn och vakenhet, och hur sömn/vakenhet stater regleras av dygnsrytm processer, sömn tryck, och allostatiska faktorer, inklusive känslor. Detta dokument syftar till att införa hur man använder optogenetisk manipulation kombinerat med sömn/Wake inspelning, som kan ha potential att uppdatera vår förståelse av de connectomes och mekanismer i hjärnan som spelar en roll i regleringen av NREM sömn, REM-sömn, och vakenhet. Förståelse för denna mekanism genom vilken det limbiska systemet reglerar sömn/vakenhet stater är av största vikt för hälsan, eftersom sömnlöshet är vanligtvis förknippas med ångest eller rädsla för att inte kunna sova (somniphobia).
BNST tros spela en viktig roll i ångest och rädsla. Gad 67-uttrycker GABAergic neuroner är en stor population av bnst12,13. Vi undersökte effekten av optogenetisk manipulation av dessa nervceller (GABABnst) på sömn/vakenhet stater. En av de största framstegen inom neurovetenskap under de senaste åren har varit metoder som möjliggör manipulation av nervceller med särskilda kemiska identiteter in vivo, med hög rumsliga och temporala resolutioner. Optogenetik är mycket användbart för att demonstrera orsakssambanden mellan neurala aktivitet och specifika beteendemässiga svar14. Vi beskriver optogenetik som en metod för att undersöka funktionell anslutning av definierade neurala kretsar i regleringen av sömn/vakenhet stater. Genom att utnyttja denna teknik, stora framsteg har uppnåtts i förståelsen av neuronala kretsar som reglerar sömn/vakenhet stater15,16,17,18,19 . I många fall, opsins är specifikt introduceras i nervceller med särskilda kemiska identiteter i selektiva hjärnregioner genom en kombination av CRE-driver möss och CRE-inducerbara AAV-medierad genöverföring. Vidare, fokala uttryck för fotokänsliga opsins som channelrhodopsin 2 (ChR2)20 eller archaerhodopsin (archt)21 kombinerat med ett CRE-loxP eller FLP-FRT-system tillåter oss att manipulera en selektiv neuronala population och specifika neurala väg22.
Vi beskriver här experiment på GABAergic neuroner i BNST som ett exempel. För att uttrycka opsins i en utsedd neuronala population, lämpliga CRE förare möss och CRE-beroende virusvektorer används oftast. Transgena eller Knock-in linjer där opsins uttrycks i synnerhet neuronala populationer är också användbara. I följande experiment använde vi GAD67-CRE Knock-in möss23 där endast GABAergic neuroner uttrycka CRE driver med en C57BL/6j genetisk bakgrund, och en AAV vektor som innehåller ChR2 (hChR2 H134R) smält med eyfp eller eyfp som en kontroll med en "FLEx (Flip-excision) switch"24. Förfarandet beskriver specifikt optogenetisk excitation av GABAergic neuroner i BNST under övervakning av sömn/vakenhet stater25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1180px;" width="1180">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">1x1 Fiber-optic Rotary Joints</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td style="width:177px;">FRJ 1x1 FC-FC</td>
			<td style="width:437px;">for optogenetics</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin header</td>
			<td style="width:191px;">KEL corporation</td>
			<td style="width:177px;">DSP02-006-431G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin socket</td>
			<td style="width:191px;">Hirose</td>
			<td style="width:177px;">21602X3GSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">A/D converter</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>3.70&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>5.82&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Fuji film</td>
			<td style="width:177px;">014-23302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Amplifier</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Muromachi</td>
			<td style="width:177px;">MK-AT-210D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Automatic injecter</td>
			<td style="width:191px;">KD scientific</td>
			<td style="width:177px;">780311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Carbide cutter</td>
			<td style="width:191px;">Minitor</td>
			<td style="width:177px;">B1055</td>
			<td>&#966;0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Cyanoacrylate adhesion&#160; (Aron alpha A) and acceleration</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#30533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Dental curing light</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">Elipar S10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Epoxy adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#04888</td>
			<td>insulation around the solder of 6-pin and shielded cable</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Fiber optic patch cord (branching)</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Gad67-Cre mice</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Kenji Sakimura</td>
			<td></td>
			<td>Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>65461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:191px;">FOREDOM</td>
			<td style="width:177px;">K.1070</td>
			<td>Used with carbide cutter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Interconnecting sleeve</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>ADAF1</td>
			<td>&#966;2.5 mm Ceramic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:191px;">Pfizer</td>
			<td>871119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Rapp OptoElectronic</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>473nm wave length</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser intesity checker</td>
			<td style="width:191px;">COHERENT</td>
			<td style="width:177px;">1098293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser stimulator</td>
			<td style="width:191px;">Bio research center</td>
			<td style="width:177px;">STO2</td>
			<td>reffered as pulse generator in text</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Optic fiber with ferrule&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV2-rh10</td>
			<td style="width:191px;">provided by PennVector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">Addgene</td>
			<td>plasimid # 20296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Karl Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Patch cord</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>D202-9089-0.4</td>
			<td>0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pHelper</td>
			<td style="width:191px;">Stratagene</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Photocurable dental cement</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">56846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Serafin clamp</td>
			<td style="width:191px;">Stoelting</td>
			<td style="width:177px;">52120-43P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Shielded cable</td>
			<td style="width:191px;">mogami</td>
			<td style="width:177px;">W2780</td>
			<td>Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep recording chamber</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td style="width:437px;">Custum-made (21cm&#215; 29cm &#215; 19cm) with water tank holder</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep sign software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Slip ring</td>
			<td style="width:191px;">neuroscience,inc</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless screw</td>
			<td style="width:191px;">Yamazaki</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>&#966;1.0 x 2.0</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless wire</td>
			<td style="width:191px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:177px;">AS633</td>
			<td>&#160;0.0130 inch diameter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stereotaxic frame with digital console</td>
			<td style="width:191px;">Koph</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Model 940</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Vital recorder software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice

Under de senaste åren har optogenetik ofta använts inom många områden av neurovetenskaplig forskning. I många fall, en opsin, såsom Channel rhodopsin 2 (ChR2), uttrycks av en virusvektor i en viss typ av neuronala celler i olika CRE-driver möss. Aktivering av dessa opsins utlöses av tillämpning av ljuspulser som levereras av laser eller leds genom optiska kablar, och effekten av aktivering observeras med mycket hög tid upplösning. Försöksledaren kan akut stimulera nervceller medan övervakning beteende eller ett annat fysiologiskt utfall hos möss. Optogenetics kan möjliggöra användbara strategier för att utvärdera funktionen av neuronala kretsar i regleringen av sömn/vakenhet stater i möss. Här beskriver vi en teknik för att undersöka effekten av optogenetisk manipulation av nervceller med en specifik Kemisk identitet under elektroencefalogram (EEG) och Elektromyogram (EMG) övervakning för att utvärdera sömn stadiet av möss. Som ett exempel, vi beskriver manipulation av GABAergic neuroner i sängen kärnan i stria terminalis (BNST). Akut optogenetisk excitation av dessa nervceller utlöser en snabb övergång till vakenhet när de appliceras under NREM-sömn. Optogenetisk manipulation tillsammans med EEG/EMG inspelning kan tillämpas för att dechiffrera neuronala kretsar som reglerar sömn/vakenhet stater.

Den nuvarande studien visade effekten av optogenetisk excitation av GABABnst nervceller på Sleep State Transition. ChR2-EYFP uttrycktes i GABA neuroner i BNST. En in situ hybridisering histokemiska studie visade att ChR2-eyfp var colokaliserade i nervceller som uttrycker Gad 67 mRNA signaler, vilket indikerar att dessa är GABAergic nervceller. Immunohistochemical slice prover bekräftade positionen av optisk fiber, vars spets var precis ovanför BNST25...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

Optogenetisk manipulation av neurala kretsar under övervakning sömn/vakenhet stater hos möss

Här, vi beskriver metoder för optogenetisk manipulation av vissa typer av nervceller under övervakning av sömn/vakenhet stater i möss, presentera vårt senaste arbete på sängen kärnan i stria terminalis som ett exempel.

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Detta förfarande kan hjälpa oss att identifiera funktionen av specifika neuro krets som är inblandade i sömn vakenhet förordningen med mindre invasiv manipulation och hög tidsmässiga upplösning. Denna metod tillåter oss övervakningen yta EEG i realtid i samband med manipulering av en specifik neuro krets för att undersöka orsakssamband mellan kretsar och sömn vakenhet stater. Shota Kodani ska demonstrera ingreppet.Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa, applicera salva på djurets ögon och använda öronstänger och näsa stift till stereotaktisk apparat för att stabilisera huvudet av den sövda musen på en absorberande pad. När huvudet är fast i läge, gör en mid-sagittal snitt i hårbotten för att bekräfta att skärningspunkten mellan sutura sagittalis och sutura coronalis eller sutura lambdoidea är i en horisontell linje på samma nivå. För att undvika en positioneringsspalt, justerar du näsknyt- och öronstängerna vid behov.Sedan använda serafin klämmor till hålla huden öppen desinficera den exponerade ytan av skallen för att möjliggöra kraniala suturer som ska visualiseras tydligare. För att injicera den adeno-associerade virusvektorn, ladda en etanolsteriliserad 10 milliliterspruta med två mikroliter mineralolja, följt av den experimentella virusvolymen som ska injiceras. Använd mikroinjektionspumpen för att justera spetsen på mikroinjektionsnålen på bregma och notera koordinaterna som ursprungspunkt.Flytta sedan spetsen till det angivna injektionsstället och placera nålspetsen på positionen. Markera skallen vid injektionsstället och använd en tandborr som är utrustad med en 0,7 millimeters hårdmetallskärare för att borra ett hål i skallen med ungefär två millimeters diameter. Efter att ha tagit bort blod från runt hålet med en bomullspinne, flytta långsamt nålen till sängkärnan i stria terminalis eller BSNT och injicera långsamt den utsedda volymen av viruslösning.Låt sedan nålen vara på plats i fem minuter så att lösningen kan infiltrera BNST-vävnaden tillräckligt innan nålen dras tillbaka försiktigt. För elektroencefalogram, eller EEG, och elektromyogram, eller EMG, elektrodimplantation, löd först två rostfria ståltrådar från vilka en millimeter isolering har tagits bort från båda ändar till EMG-elektroderna och placera elektrodernas mitt på bregma. Markera sedan positionen för varje EEG-elektrod.För att bestämma positionen för det optiska fiberimplantatet, fäst en optisk fiber ferrule till manipulatorn och rotera manipulatorarmen till ett plus eller minus 30 graders vinkel mot en horisontell linje. Sätt fiberspetsen på bregma och spela in koordinaterna. Flytta spetsen till den riktade insättningslinjen och markera positionen på skallen och placeringen för ankarskruven bredvid införingsstället.Använd tandborren för att borra skallen på varje plats och använd manipulatorn för att försiktigt sätta in fibern för optik tills den når över BNST. Ferrule bör vila på resterande kranium. Säkra fibern till skallen med en ankarskruv, var noga med att inte bryta dura eller skada någon vävnad.Täck sedan fibern och skruva med foto-härdbara tandcement. Därefter borra hål för EEG/ EMG-elektroder och sätt in spetsen på den första elektroden i ett hål. Hålla implantatet med en hand, applicera cyanoakrylatlim på utrymmet mellan skallen och elektroden och sätt in elektroden resten av vägen, var noga med att inte skada någon vävnad.När alla elektroder har placerats, täck omkretsen av elektroderna och de optiska fibrerna med ytterligare cyanoakrylat lim och cyanoakrylat accelerant för att undvika att orsaka avbrott vid ferrule till optisk kabel och elektrod till bly tråd anslutningszoner. Nu utsätter nackmusklerna, och sätt in trådarna för EMG elektroden under muskeln. Justera längden på EMG-elektroden så att den passar precis under nuchalmusklerna och fyll implantaten med mer cyanoakrylatlim och accelerant.Placera sedan musen på en värmedyna med övervakning tills full recompensy. För EEG/ EMG övervakning under foto-excitation av riktade nervceller, först använda en skalär för att justera laserintensiteten och använda en ferrule att tjudra spetsen på laserkabeln till en oanvänd fiber. Bekräfta att det inte finns plats vid korsningen mellan fibern och kabeln.Efter 20 minuter, avger den uppvärmda lasern till intensiteten checker och justera intensiteten till 10 milliwatt per millimeter i kvadrat. Ställ in ljuspulsens varaktighet till 10 millisekunder, viloperioden till 40 millisekunder, cykeln till 20 och upprepningen till 20. Ändra laserläget till transistorlogik och bekräfta att ljuspulser avges från fibern som styrs av mönsterregulatorn.Anslut den implanterade elektroden och kabeladaptern, täck sedan korsningen med ljust ogenomträngligt material för att förhindra laserläckage. Och när lasern är klar, flytta mössen till den experimentella kammaren för EEG / EMG-inspelning. För att bedöma latensen till vakenhet från icke snabba ögonrörelser eller snabb ögonrörelsesömn, begränsa inspelningstiden och optimerad plats vinna tid och låt mössen röra sig fritt i den experimentella kammaren i minst en timme.Under försöksperioden övervakar du EEG- och EMG-signalerna i samma inspelningsskärm. Utvärdera musens tillstånd som vakenhet, icke snabba ögonrörelser sömn, eller snabba ögonrörelser sömn med hjälp av vinna kontroll för varje våg för att underlätta för att skilja varje stat. För mätning av den icke snabba ögonrörelsen sova till vakenhet latens, observera stabil icke snabba ögonrörelser sova i 40 sekunder, sedan slå på mönstergeneratorn för foto stimulering och bekräfta laser utsläpp till de implanterade optiska fibrer.Spela sedan in EEG/EMG-signalerna tills sömntillståndet ändras till vakenhet. Här representerade EEG/EMG spår före och efter foto stimulering under icke snabba ögonrörelser sömn visas. En hög spänning och långsam frekvens EEG med inga EMG signaler, representerar icke snabba ögonrörelser sömn.Foto stimulering utlöste en akut övergång till vakenhet ungefär två sekunder efter stimulering i channelrhodopsin-2 uttrycker möss medan kontroll möss inte visa denna övergång, vilket tyder på att excitation av BNST GABA nervceller under icke snabba ögonrörelser sömn utlöser en snabb induktion av vakenhet. Omvänt, foto stimulering under snabba ögonrörelser sömn hade ingen effekt så en övergång effekt endast framkommit i icke snabba ögonrörelser sömn. Det är viktigt att ta hand om exakta koordinationer för virusinjektionen och optikfiberimplantationsstegen.EEG/EMG-spåren som fångas in under sömnanalysen kan användas för att bedöma fotomanipulationens konsekvenser på de olika vaksamma tillstånden hos möss. Denna teknik kommer också att hjälpa oss att identifiera andra komponenter och kretsar som deltar i regleringen av sömn vakenhet stater. Använd skyddsglasögon för att undvika laserskador i ögat och se till att alltid autoklavera sterilisera den adeno-associerade virusvektorbehållaren efter användning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Extinction utbildning under Återpackning Fönster Förhindrar Återvinning av rädsla

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Elektroencefalografi, realtidsmätning av laktat koncentration och optogenetic Manipulering av neuronal aktivitet hos gnagare Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-enhet inspelning Metoder för att karaktärisera neural aktivitet i Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactory kretsar

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo Två-foton avbildning av erfarenhet beroende molekylära förändringar i kortikala neuron

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic störning av neural aktivitet med laserbelysning i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex vivo optogenetic Dissekering av skräck kretsar i hjärnan skivor

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic ångan av hippocampus Theta svängningar i beter sig möss

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Disruption of Frontal Lobe Neural Synchrony During Cognitive Control by Alcohol Intoxication

Störningar i frontalloben neurala synkronin under kognitiv kontroll av alkoholförgiftning

Decision making relies on dynamic interactions of distributed, primarily frontal brain regions. Extensive evidence from functional magnetic resonance ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Detektion av 5-Hydroximetylcytosin i neurala stamceller och hjärnor av möss

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Measuring Neural Mechanisms Underlying Sleep-Dependent Memory Consolidation During Naps in Early Childhood

Mätning av neurala mekanismer bakom sömn beroende minnes konsolidering under tupplurar i tidig barndom

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less ...