Name: optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Bu çalışmada, Merck araştırmacı çalışmalar programı (#54843), bir KAKENHI Grant-in-yardım yenilikçi alanlar üzerinde bilimsel araştırma için, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.) ve bir KAKENHI Grant-in-yardım yenilikçi alanlar (T.S.) üzerinde keşif araştırması için destek oldu (18H02595).

Buradaki tüm deneyler, NıH kurallarına uymak üzere Tsukuba Üniversitesi hayvan deneyi ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. hayvan cerrahisi, virüs enjeksiyonu, EEG/EMG ve optik fiber Implantasyon için elektrot
Dikkat: Kullanılacak virüsün Biyogüvenlik düzeyine göre uygun koruma ve işleme teknikleri seçilmelidir. AAV enjeksiyon için yalıtılmış bir P1A dereceli odada kullanılmalıdır, ve AAV taşıyan tüp...

<ol>
	<li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder:+Secondary+symptom+or+core+feature?.">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?.</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li><li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity.">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li><li>Mellman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+anxiety+disorders.">Sleep and anxiety disorders.</a> Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).</li><li>Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuitry+of+wakefulness+and+sleep.">Neural circuitry of wakefulness and sleep.</a> Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).</li><li>Chemelli, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Narcolepsy+in+orexin+knockout+mice:+Molecular+genetics+of+sleep+regulation.">Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation.</a> Cell. 98 (4), 437-451 (1999).</li><li>Borb&#233;ly, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two-process+model+of+sleep+regulation:+A+reappraisal.">The two-process model of sleep regulation: A reappraisal.</a> Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).</li><li>Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+human+sleep:+recovery+process+gated+by+a+circadian+pacemaker.">Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).</li><li>Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic,+circadian,+and+emotional+regulation+of+sleep.">Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep.</a> Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).</li><li>Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+state+switching.">Sleep state switching.</a> Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).</li><li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li><li>Tovote, P., Fadok, J. P., L&#252;thi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuits+for+fear+and+anxiety.">Neuronal circuits for fear and anxiety.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).</li><li>Lebow, M. A., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overshadowed+by+the+amygdala:+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+emerges+as+key+to+psychiatric+disorders.">Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders.</a> Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+and+proliferation+of+intermediate+progenitors+of+GABAergic+neurons+in+the+mouse+telencephalon.">Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon.</a> Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+light+on+wakefulness+and+arousal.">Shining light on wakefulness and arousal.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).</li><li>Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+hypocretin-mediated+sleep-to-wake+transitions.">Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).</li><li>Weber, F., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit-based+interrogation+of+sleep+control.">Circuit-based interrogation of sleep control.</a> Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).</li><li>Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+REM+sleep+by+ventral+medulla+GABAergic+neurons.">Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons.</a> Nature. 526, 435-438 (2015).</li><li>Oishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-wave+sleep+is+controlled+by+a+subset+of+nucleus+accumbens+core+neurons+in+mice.">Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).</li><li>Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+optogenetics+with+complementary+methodologies+in+systems+neuroscience.">Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).</li><li>Saito, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+in+the+preoptic+area+send+direct+inhibitory+projections+to+orexin+neurons.">GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).</li><li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li><li>Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+GABAergic+neurons+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+triggers+immediate+transition+from+non-rapid+eye+movement+sleep+to+wakefulness+in+mice.">Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice.</a> Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).</li><li>Lin, F., Pichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).</li><li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+neurons:+tools,+applications,+and+experimental+constraints.">Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints.</a> Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O&#8217;Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li></ol>

Biz burada uyku/uyanıklık devlet geçişleri üzerinde belirli kimyasal kimlikleri ile nöronların optogenetik stimülasyon etkisini değerlendirmek için bir yöntem sundu ve GABABnst nöronların manipülasyon bir örnek verdi. Bizim veri gösterdi GABAbnst nöronlar optogenetic uyarılma wakefulness NREM uyku hemen geçiş sonuçları.
Çeşitli Deneysel tasarımlar, birçok türde optogenetik araç gelişimi nedeniyle mevcuttur. Etkinleştirmek ya da ChR2, SSFO, ha...

Optimum bilişsel fonksiyon için uyku önemlidir. Son bulgular da uyku bozuklukları çeşitli hastalıklar ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir1,2,3. Uyku fonksiyonları henüz büyük ölçüde çözülmemiş olmasına rağmen, son zamanlarda sinir devreleri ve uyku/uyanıklık Devletler4kontrol mekanizmaları anlamada önemli ilerleme yapılmıştır. Memelilerde, uyanık üç devlet vardır: uyanıklık, hızlı olmayan göz hareketi (NREM) uyku, ve hızlı göz hareketi (REM) uyku. Uyanıklık, hızlı EEG osilasyonlarıyla (5-12 Hz), maksatlı ve sürekli motor aktivitesi ile düşük amplitüd ile karakterize edilir. NREM uyku (1-4 Hz) yüksek amplitüd (Delta dalgaları), bilinç eksikliği ve amaç motor aktivitesi ile yavaş salınımlar tarafından tanımlanır. REM uykusu nispeten hızlı salınımlar (6-12 Hz) düşük amplitüd ve neredeyse komple bilateral kas atonia5ile karakterize edilir.
Borbely, iki proses modeli6,7olarak bilinen uyku-uyanıklık Yönetmeliği teorisi önerdi. Bir homeostatik süreç, aynı zamanda işlem S olarak adlandırılır, uyanıklık sırasında birikir ve uyku sırasında dağılıyor uyku basıncını temsil eder. C süreci olarak adlandırılan bir başka süreç ise, 24 saat döngüsünde neden uyanık düzeylerinin dalgalanacağını açıklayan bir sirkadiyen süreçtir. Bu iki süreçlere ek olarak, allostatik faktörler uyku/uyanıklık8,9düzenlenmesi için de önemlidir. Allostatic faktörler beslenme durumları ve duygu içerir. Korku ve anksiyete genellikle otozik ve nöroendokrin tepkiler ile birlikte uyarılma artışı eşlik eder10,11,12. Limbik sistem korku ve anksiyete düzenlenmesi bir rol oynamaya inanılır, ve otonjik ve nöroendokrin tepkiler altta yatan mekanizmalar kapsamlı olarak incelenmiştir, ancak limbik sistem uyku/uyanıklık durumları etkileyen yol değil henüz ortaya çıktı. Opto-ve Farmakogenetik kullanan son çalışmalar çok sayıda nöronlar ve uyku/uyanıklık Devletler düzenleyen nöronal devrelerin beyin boyunca dağıtılır önerdi, korsinler dahil, bazal forebrain, talamus, hipotalamus, ve beyin kökü. Özellikle, optogenetik son gelişmeler bize uyarmak veya belirli nöral devreler in vivo yüksek uzamsal ve temporal çözünürlüklerde inhibe izin verdik. Bu teknik uyku ve uyanıklık nöral substratlar bizim anlayışımızda ilerleme sağlayacak, ve nasıl uyku/uyanıklık Devletler sirkadiyen süreçleri tarafından düzenlenir, uyku basıncı, ve allostatik faktörler, duygu dahil. Bu yazıda, NREM uyku, REM uyku düzenlenmesi bir rol oynayan beyinde konektoumunu ve mekanizmalar bizim anlayışımızı güncellemek için potansiyeli olabilir uyku/uyandırma kaydı ile birlikte optogenetik manipülasyon nasıl kullanılacağı tanıtmak amaçlamaktadır, ve uyanıklık. Hangi limbik sistem uyku/uyanıklık Devletler düzenleyen bu mekanizmanın anlayış sağlık için önemli bir önem taşımaktadır, çünkü uykusuzluk genellikle anksiyete ya da uyku mümkün olma korkusu ile ilişkilidir (somniphobia).
BNST anksiyete ve korku önemli bir rol oynamak için düşünülmektedir. Gad 67-gabaergic nöronlar ifade bnst12,13büyük bir nüfus vardır. Biz bu nöronların optogenetik manipülasyon etkisini inceledi (GABABnst) uyku/uyanıklık Devletler. Son yıllarda Nörobilim en büyük gelişmelerden biri, yüksek uzamsal ve temporal çözünürlüklerde ile, özel kimyasal kimlikleri in vivo ile nöronların manipülasyon sağlayan yöntemler olmuştur. Optogenetiği nöral aktivite ve spesifik davranışsal tepkiler14arasındaki nedensel bağlantıları göstermek için son derece yararlıdır. Biz uyku/uyanıklık devletlerin düzenlenmesi tanımlanan nöral devrelerin işlevsel bağlantı incelemek için bir yöntem olarak optogenetik tarif. Bu tekniği kullanarak, uyku/uyanıklık durumları düzenleyen nöronal devreleri anlamak için büyük bir ilerleme elde edilmiştir15,16,17,18,19 . Birçok durumda, opsins özellikle CRE-sürücü fareler ve CRE-indüklenebilir AAV aracılı gen transfer kombinasyonu ile seçici beyin bölgelerinde belirli kimyasal kimlikleri ile nöronlar tanıtıldı. Ayrıca, bir CRE-loxP veya FLP-FRT sistemi ile birlikte channelrhodopsin 2 (ChR2)20 veya archaerhodopsin (archt)21 gibi fotoğraf duyarlı opgünahların fokal ifade bize seçici bir nöronal nüfus ve spesifik manipüle sağlar nöral yol22.
Biz burada bir örnek olarak BNST içinde GABAergic nöronlar üzerinde deneyler tarif. Belirlenmiş bir nöronal nüfus opsins ifade etmek için, uygun CRE sürücü fareler ve CRE bağımlı virüs vektörler en sık kullanılır. Opgünahların özellikle nöronal nüfus içinde ifade edildiği transgenik veya Knock-in hatları da yararlıdır. Aşağıdaki deneyler, biz kullanılan GAD67-CRE Knock-in fareler23 hangi sadece gabaergic nöronlar bir C57BL/6J genetik arka plan ile CRE Rekombinaz Ifade, ve bir AAV vektörü IÇEREN ChR2 (hChR2 H134R) BIR kontrol olarak EYFP veya EYFP ile kaynama "FLEx (Flip-eksizyon) anahtarı" ile24. Prosedür özellikle uyku/uyanıklık Devletler25izlenmesi sırasında bnst Içinde gabaeroid nöronların optogenetiği uyarılma açıklanmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1180px;" width="1180">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">1x1 Fiber-optic Rotary Joints</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td style="width:177px;">FRJ 1x1 FC-FC</td>
			<td style="width:437px;">for optogenetics</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin header</td>
			<td style="width:191px;">KEL corporation</td>
			<td style="width:177px;">DSP02-006-431G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">6-pin socket</td>
			<td style="width:191px;">Hirose</td>
			<td style="width:177px;">21602X3GSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">A/D converter</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>3.70&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:375px;">AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td>5.82&#215;1013(genomic copies/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:191px;">Fuji film</td>
			<td style="width:177px;">014-23302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Amplifier</td>
			<td style="width:191px;">Nippon koden</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Anesthetic vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Muromachi</td>
			<td style="width:177px;">MK-AT-210D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Automatic injecter</td>
			<td style="width:191px;">KD scientific</td>
			<td style="width:177px;">780311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Carbide cutter</td>
			<td style="width:191px;">Minitor</td>
			<td style="width:177px;">B1055</td>
			<td>&#966;0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Cyanoacrylate adhesion&#160; (Aron alpha A) and acceleration</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#30533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Dental curing light</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">Elipar S10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Epoxy adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Konishi</td>
			<td>#04888</td>
			<td>insulation around the solder of 6-pin and shielded cable</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Fiber optic patch cord (branching)</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Gad67-Cre mice</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Kenji Sakimura</td>
			<td></td>
			<td>Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>65461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:191px;">FOREDOM</td>
			<td style="width:177px;">K.1070</td>
			<td>Used with carbide cutter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Interconnecting sleeve</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>ADAF1</td>
			<td>&#966;2.5 mm Ceramic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:191px;">Pfizer</td>
			<td>871119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser&#160;&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Rapp OptoElectronic</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>473nm wave length</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser intesity checker</td>
			<td style="width:191px;">COHERENT</td>
			<td style="width:177px;">1098293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Laser stimulator</td>
			<td style="width:191px;">Bio research center</td>
			<td style="width:177px;">STO2</td>
			<td>reffered as pulse generator in text</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Optic fiber with ferrule&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Thorlab</td>
			<td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV2-rh10</td>
			<td style="width:191px;">provided by PennVector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">Addgene</td>
			<td>plasimid # 20296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td>
			<td style="width:191px;">provided by Dr. Karl Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Patch cord</td>
			<td style="width:191px;">Doric</td>
			<td>D202-9089-0.4</td>
			<td>0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">pHelper</td>
			<td style="width:191px;">Stratagene</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Photocurable dental cement</td>
			<td style="width:191px;">3M</td>
			<td style="width:177px;">56846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Serafin clamp</td>
			<td style="width:191px;">Stoelting</td>
			<td style="width:177px;">52120-43P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Shielded cable</td>
			<td style="width:191px;">mogami</td>
			<td style="width:177px;">W2780</td>
			<td>Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep recording chamber</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td style="width:437px;">Custum-made (21cm&#215; 29cm &#215; 19cm) with water tank holder</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Sleep sign software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Slip ring</td>
			<td style="width:191px;">neuroscience,inc</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless screw</td>
			<td style="width:191px;">Yamazaki</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>&#966;1.0 x 2.0</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stainless wire</td>
			<td style="width:191px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:177px;">AS633</td>
			<td>&#160;0.0130 inch diameter</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Stereotaxic frame with digital console</td>
			<td style="width:191px;">Koph</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>Model 940</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:191px;">Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:375px;">Vital recorder software</td>
			<td style="width:191px;">KISSEI COMTEC</td>
			<td style="width:177px;">N/A</td>
			<td>for EEG/EMG recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic manipulation of neural circuits during monitoring sleep/wakefulness states in mice

Son yıllarda, optogenetik yaygın nörooscientifik araştırma birçok alanda kullanılmıştır. Birçok durumda, bir opsin, kanal rodopsin 2 (ChR2) gibi, çeşitli CRE-sürücü fareler nöronal hücrelerin belirli bir tür bir virüs vektörü tarafından ifade edilir. Bu opgünahların aktivasyonu, lazer veya LED optik kablolar aracılığıyla teslim edilen ışık darbeleri uygulaması ile tetiklenir ve aktivasyon etkisi çok yüksek zaman çözünürlüğü ile görülür. Deneyler, farelerde davranışı veya başka bir fizyolojik sonucu izlerken nöronları akut uyarmak edebiliyoruz. Optogenetiği, farelerde uyku/uyanıklık devletlerinin düzenlenmesi nöronal devrelerin fonksiyonunu değerlendirmek için yararlı stratejiler olanaklı kılmak. Burada, farelerin uyku aşamasını değerlendirmek için elektroensefalogram (EEG) ve elektromiyogram (EMG) izleme sırasında belirli bir kimyasal kimliğe sahip olan nöronların optogenetik manipülasyonunun etkisini incelemek için bir teknik açıklanmaktadır. Örneğin, biz stria terminalis (BNST) yatak çekirdeğinde GABAerjik nöronların manipülasyon açıklanmaktadır. Bu nöronların akut optogenetik uyarılması NREM uyku sırasında uygulandığında uyanıklık hızlı bir geçiş tetikler. EEG/EMG kayıt ile birlikte optogenetik manipülasyon uyku/uyanıklık Devletler düzenleyen nöronal devreler deşifre için uygulanabilir.

Bu çalışmada GABABnst nöronların optogenetik uyarma etkisi uyku durumu geçiş gösterdi. ChR2-EYFP ekspresyonu bnst GABA nöronlar ifade edildi. Bir in situ hibridizasyon histokimyasal çalışmada ChR2-EYFP, bu GABAerjik nöronlar olduğunu gösteren, Gad 67 mRNA sinyalleri ifade nöronlar içinde kolokalize olduğunu gösterdi. İmmunohistokimyasal dilim numuneleri, ucu BNST25' in hemen üstünde olan optik lifin konumunu doğruladı.
<p clas...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice at JoVE.com

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

Farelerde uyku/uyanıklık durumları Izleme sırasında nöral devrelerin optogenetik manipülasyon

Burada, biz farelerde uyku/uyanıklık devletlerin izlenmesi sırasında nöronların belirli türlerinin optogenetik manipülasyon yöntemlerini açıklamak, bir örnek olarak stria terminalis yatak çekirdeği üzerinde son çalışma sunma.

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Bu prosedür bize daha az invaziv manipülasyon ve yüksek zamansal çözünürlük ile uyku uyanıklık düzenleme dahil belirli nöro devrenin işlevini belirlemenize yardımcı olabilir. Bu yöntem bize devreler ve uyku uyanıklık durumları arasındaki nedensel ilişkiyi incelemek için belirli bir nöro devre manipülasyon ile birlikte gerçek zamanlı izleme yüzeyi EEG sağlar. Shota Kodani prosedürü gösterecek.Ayak ucurmesine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, hayvanın gözlerine merhem uygulayın ve kulak çubuklarını ve burun pimini stereotaktik cihaza kullanarak anestezili farenin başını emici bir ped üzerinde sabitle. Kafa pozisyonda sabitlendiğinde, sutura sagittalis ve sutura coronalis veya sutura lambdoidea arasındaki kesişme aynı düzeyde yatay bir çizgi de olduğunu doğrulamak için kafa derisi bir orta sagittal kesi yapmak. Konumlandırma boşluğundan kaçınmak için, burun kıskacını ve kulak çubuklarını gerektiği gibi ayarlayın.Daha sonra kafatası dikişlerinin daha net görüntülemesini sağlamak için kafatasının açık yüzeyini dezenfekte etmek için cilde açık tutmak için serafin kelepçeler kullanarak. Adeno ile ilişkili virüs vektörü enjekte etmek için, iki mikrolitre mineral yağ ile sterilize edilmiş bir etanol yükleyin, ardından enjekte edilecek virüsün deneysel hacmi. Mikroenjeksiyon iğnesinin ucunu bregma üzerine ayarlamak için mikroenjeksiyon pompasını kullanın ve koordinatları çıkış noktası olarak not edin.Daha sonra ucu belirlenen enjeksiyon bölgesine taşıyın ve iğnenin ucunu pozisyona yerleştirin. Enjeksiyon yerinde kafatası işaretlemek ve kafatası içine yaklaşık iki milimetre çapında delik delmek için 0,7 milimetre karbür kesici ile donatılmış bir diş matkap kullanın. Pamuklu bir bezle deliğin etrafındaki kanı çıkardıktan sonra, iğneyi yavaşça stria terminalis veya BSNT'nin yatak çekirdeğine taşıyın ve belirlenen virüs çözeltisini yavaşça enjekte edin.Daha sonra çözeltinin iğneyi dikkatlice geri çekmeden önce BNST dokusuna yeterince sızmasına izin vermek için iğneyi beş dakika yerinde bırakın. Elektroensefalogram veya EEG, ve elektromiyogram veya EMG, elektrot implantasyonu için, ilk lehim iki paslanmaz çelik teller hangi yalıtım bir milimetre eMG elektrotlar için her iki ucundan sıyrılmış ve bregma üzerine elektrotların merkezi yerleştirin. Daha sonra her EEG elektrot için konumu işaretleyin.Optik fiber implantın konumunu belirlemek için, manipülatöre optik fiber ferrule takın ve manipülatör kolunu yatay bir çizgiye karşı artı veya eksi 30 derecelik açıya döndürün. Fiber ucunu bregma'ya koy ve koordinatları kaydet. Ucu hedeflenen ekleme hattına taşıyın ve kafatasıüzerindeki konumu ve ekleme bölgesinin yanındaki çapa vidasının konumunu işaretleyin.Her sitede kafatası matkap ve bnst üzerinde ulaşana kadar yavaşça optik fiber eklemek için manipülatör kullanın diş matkap kullanın. Ferrule kalan kafatası üzerinde dinlenmeli. Bir çapa vida ile kafatasına lif güvenli, dura kırmak veya herhangi bir doku zarar değil dikkat.Sonra lif kapağı ve fotoğraf tedavi edilebilir diş çimentosu ile vida. Daha sonra, EEG/EMG elektrotları için delikler açve ilk elektrotun ucunu bir deliğe takın. İmplantı tek elle tutarak, kafatası ile elektrot arasındaki boşluğa siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın ve elektrodu yolun geri kalanında takın, herhangi bir dokuya zarar vermemeye özen takın.Tüm elektrotlar yerleştirildiğinde, elektrotların ve optik liflerin çevresini ek siyanoakrilat yapıştırıcı ve siyanoakrilat hızlandırıcı ile kaplayın ve kablo bağlantı bölgelerine kablo ve elektrot için ferrule'de herhangi bir kesintiye neden olmasını önleyebilirsiniz. Şimdi boyun kaslarını ortaya çıkar ve kas Altında EMG elektrot için telleri takın. EMG elektrotunun uzunluğunu, ense kaslarının hemen altına sığacak şekilde ayarlayın ve implantları daha siyanoakrilat yapıştırıcı ve hızlandırıcı ile doldurun.Sonra tam telafi kadar izleme ile bir ısı yastığı üzerinde fare yerleştirin. Hedeflenen nöronların foto uyarma sırasında EEG / EMG izleme için, ilk lazer yoğunluğunu ayarlamak için bir skaler kullanın ve kullanılmayan bir optik fiber lazer kablosuucu tether için bir ferrule kullanın. Fiber ve kablo arasındaki kavşakta boşluk olmadığını doğrulayın.20 dakika sonra, yoğunluk denetleyicisi için ısıtılmış lazer yayarlar ve milimetre kare başına 10 miliwatt yoğunluğunu ayarlayın. Işık darbe süresini 10 milisaniyeye, geri kalan süreyi 40 milisaniyeye, döngüyü 20'ye ve tekrarı 20'ye ayarlayın. Lazer modunu transistör mantığıyla değiştirin ve ışık darbelerinin desen regülatörü tarafından kontrol edilen fiberden yayılarak yayLıp,İmplante edilmiş elektrot ve kablo adaptörünü bağlayın ve lazer sızıntısını önlemek için kavşağı ışık geçirimsiz malzemeyle kaplayın. Lazer hazır olduğunda fareleri EEG/EMG kaydı için deney odasına taşıyın. Hızlı olmayan göz hareketi veya hızlı göz hareketi uyku uyanıklık için gecikme değerlendirmek için, kayıt süresini sınırlamak ve optimize site kazanç süresi ve fareler en az bir saat boyunca deneysel odada serbestçe hareket sağlar.Deney süresi boyunca, EEG ve EMG sinyallerini aynı kayıt ekranında izleyin. Her durumu ayırt etme kolaylığı için her dalga için kazanç kontrolünü kullanarak farenin durumunu uyanıklık, hızlı olmayan göz hareketi uykusu veya hızlı göz hareketi uykusu olarak değerlendirin. Uyanıklık gecikmesi için hızlı olmayan göz hareketi uyku ölçümü için, 40 saniye boyunca istikrarlı non rapid göz hareketi uyku gözlemlemek, sonra fotoğraf stimülasyonu için desen jeneratör açın ve implante optik lifleriçin lazer emisyon onaylamak.Ardından Uyku durumu uyanıklığa geçene kadar EEG/EMG sinyallerini kaydedin. Burada hızlı olmayan göz hareketi uykusırasında fotoğraf stimülasyonu öncesi ve sonrası EEG/EMG izleri gösterilmiştir. EMG sinyali olmayan yüksek voltajlı ve yavaş frekanslı EEG, hızlı olmayan göz hareketi uykusu dur.Fotoğraf stimülasyonu kanaloidpsin-2'de uyarılmayı takiben uyanıklığa akut geçişi tetikledi kontrol fareleri bu geçişi göstermezken, hızlı olmayan göz hareketi uykusunda BNST GABA nöronların uyarılmasının uyanıklığın hızlı bir indüksiyonunu tetiklediğini düşündürmektedir. Tersine, hızlı göz hareketi uyku sırasında fotoğraf stimülasyonu bir geçiş etkisi sadece hızlı olmayan göz hareketi uyku ortaya çıktı bu yüzden hiçbir etkisi yoktu. Bu virüs enjeksiyonu ve optik fiber implantasyon adımları için hassas koordinasyon dikkat etmek önemlidir.Uyku analizi sırasında yakalanan EEG/EMG izleri, farelerdeki farklı uyanık hallerde fotoğraf manipülasyonunun sonuçlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu teknik aynı zamanda uyku uyanıklık durumlarını düzenleyen ilgili diğer bileşenleri ve devreleri belirlememize yardımcı olacaktır. Göze lazer hasarı önlemek için koruyucu gözlük kullanın ve her zaman otoklav kullanımdan sonra adeno ilişkili virüs vektör konteyner sterilize emin olun.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Reconsolidation Pencere sırasında Extinction Eğitim Fear Kurtarma önler

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Yarı sağlam Lazer Aydınlatma ile Sinir Faaliyet optogenetic Pertürbasyon<em&gt; Drosophila</emMotion&gt; Larva

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Hipokampal teta salınımlarını fareler davranışlar içinde Optogenetic sürüklenme

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Disruption of Frontal Lobe Neural Synchrony During Cognitive Control by Alcohol Intoxication

Ön lobu sinir senkronizasyonu bozulma bilişsel denetimi tarafından alkol zehirlenmesi sırasında

Decision making relies on dynamic interactions of distributed, primarily frontal brain regions. Extensive evidence from functional magnetic resonance ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Farelerin Nöral Kök Hücreleri ve Beyinlerinde 5-Hidroksimetilsitozozin Insaptama

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Measuring Neural Mechanisms Underlying Sleep-Dependent Memory Consolidation During Naps in Early Childhood

Erken Çocukluk Döneminde Uykuya Bağımlı Bellek Konsolidasyonunun Altında Yatan Sinirsel Mekanizmaların Ölçülmesi

Sleep is critical for daily functioning. One important function of sleep is the consolidation of memories, a process that makes them stronger and less ...